CN114032206A - 一种酵母菌种子液的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种酵母菌种子液的培养方法。本发明对现有的酵母菌种子液发酵工艺进行优化，通过选用一级种子液的培养、二级发酵液制备、二级发酵液培养以及在培养过程中进行补料的培养步骤，大幅提高了最终酵母菌种子液的产量，同时通过加入特定比例的促进剂，各组分间的相互作用，能够有效提高酵母菌培养过程的活菌数量和菌种活力，大大提高了酵母菌种子液的培养效率。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种酵母菌种子液的培养方法。
背景技术
酵母菌是单细胞真核微生物，通过出芽进行无性生殖,也可形成子囊孢子进行有性生殖，具有个体大、蛋白质含量高(45％～55％)、易分离培养、代谢产物多和综合利用广等特点，在现代工业中酵母菌是与人们日常生活联系最为紧密的一种微生物，广泛应用于食品、医药和饲料工业等领域，其中酵母菌在饲料工业中的应用尤其重要，随着科技的日渐发展，人们对于酵母菌在饲料发酵中的应用于开发研究逐渐关注，但是酵母菌在进行发酵前需对其进行种子液活化，而在工业生产中种子液需要的量是非常巨大的，因此需要提供一种能够有效提高酵母菌活性，并且获得更高活菌含量和菌种活力的酵母菌种子液培养方法。
专利文献201610120853.8公开了一种酵母菌、其培养方法及应用，所述酵母菌的培养方法包括以下步骤：(1)将冻干保藏菌接入已灭菌的一级种子培养基，接种量为2％-8％，培养20至40小时，获得一级种子液；(2)一级种子液，接入二级种子培养基，接种量为5％-10％，培养20至30小时，获得二级种子液；(3)二级种子液进行发酵培养，在发酵进行的第20-30小时，每升发酵液流加已灭菌质量比例为5％的蔗糖溶液100-500ml。但具有的酵母菌活菌数量较低。
专利文献201310002505.7公开了一种酵母菌的培养方法和生产酒精的方法，包括向外观糖含量为15-20波美度的液化液培养基中加入糖化酶，酵母菌在培养基中单糖浓度为0.02-0.04g/ml时加入，并在培养过程中，控制糖化酶的加入量，使得培养基中相对于3×108菌落形成单位的酵母菌，单糖的浓度为0.02-0.04g/ml。但具有的酵母菌活菌数量较低。
发明内容
本发明旨在提供一种酵母菌种子液的培养方法，通过在培养基中加入特定含量的促进剂以及在培养过程中进行补料操作，大幅提高了最终酵母种子液的活菌含量及菌种活力。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种酵母菌种子液的培养方法，包括以下步骤：
S1、一级种子液的培养：配置一级液体培养基，量取50～100mL配制得到的一级液体培养基于250mL锥形瓶中，在120～125℃进行灭菌，冷却后接种一环试管保存的酵母菌菌种，并于25～30℃，200r/min摇床培养20-24h，即得一级种子液；
S2、二级发酵液制备：配置二级液体培养基，量取1～3L配制得到的二级液体培养基于5L锥形瓶中，在120～125℃进行灭菌，冷却后接入一级种子液，得到二级发酵液；
S3、二级发酵液的培养：将步骤S2得到的二级发酵液放置于磁力搅拌器中进行搅拌，于25～30℃下恒温培养20-30h，即得酵母菌种子液。
优选地，所述步骤S1中一级液体培养基包括如下原料及质量份数：蛋白胨0.5～2.0份，酵母膏0.1～1.0份，葡萄糖1.0～3.0份，磷酸二氢钾0.1～0.5份、硫酸镁0.1～0.5份和水900～1000份。
优选地，所述步骤S2中二级培养基包括如下原料及质量份数：蛋白胨1.5～5.0份，酵母膏0.3～3.0份，葡萄糖3.0～7.0份，磷酸二氢钾0.3～1.5份，硫酸镁0.3～1.5份、促进剂0.3～1.5份和水1500～3500份。
优选地，所述促进剂为葛根素、黄芪多糖和海藻糖。更优选地，所述葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为(1～3)：1.25：5。
优选地，所述步骤S1和步骤S2中的灭菌时间均为10～30min。
优选地，所述步骤S2中一级种子液的接种比例为步骤S2锥形瓶中二级液体培养基体积的3％-10％。
优选地，所述步骤S3的二级发酵液培养过程中，还包括补料过程。
优选地，所述补料过程中补加50％葡萄糖溶液100mL。
优选地，所述步骤S3中磁力搅拌器的搅拌速度为500-1000r/min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过在培养基中加入特定比例的促进剂，通过各组分间的相互作用，可以有效促进酵母菌繁殖，大幅提高了酵母菌的活菌数量和菌种活力。
(2)本发明在二级发酵液中选用磁力搅拌器进行搅拌培养，可以使培养基充分被搅起，有利于培养过程的顺利进行，同时选磁力搅拌器进行培养相比于现有技术中的摇床培养，克服了因摇床培养空间密闭狭小无法进行补料操作的缺陷，使二级酵母发酵液的产量大大提高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、一种酵母菌种子液的培养方法
一种酵母菌种子液的培养方法，包括以下步骤：
S1、一级种子液的培养：量取50mL配制得到的一级液体培养基于250mL锥形瓶中，在120℃进行灭菌10min，冷却后接种一环试管保存的酵母菌菌种，并于25℃，200r/min摇床培养20h，即得一级种子液；
S2、二级发酵液制备：量取1L配制得到的二级液体培养基于5L锥形瓶中，在120℃进行灭菌10min，冷却后接入二级液体培养基体积3％的一级种子液，得到二级发酵液；
S3、二级发酵液的培养：将步骤S2得到的二级发酵液放置于磁力搅拌器中进行搅拌，搅拌速度为500r/min，于25℃下恒温培养30h，并在中途补加100mL的50％葡萄糖溶液，即得酵母菌种子液。
所述步骤S1中一级液体培养基包括如下原料：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，葡萄糖1.0g，磷酸二氢钾0.1g、硫酸镁0.1g和水900g。
所述步骤S2中二级培养基包括如下原料：蛋白胨1.5g，酵母膏0.3g，葡萄糖3.0g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.3g、促进剂0.3g和水1500g。
所述促进剂为葛根素、黄芪多糖和海藻糖；葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为1：1.25：5。
实施例2、一种酵母菌种子液的培养方法
一种酵母菌种子液的培养方法，包括以下步骤：
S1、一级种子液的培养：量取80mL配制得到的一级液体培养基于250mL锥形瓶中，在121℃进行灭菌20min，冷却后接种一环试管保存的酵母菌菌种，并于30℃，200r/min摇床培养20h，即得一级种子液；
S2、二级发酵液制备：量取2L配制得到的二级液体培养基于5L锥形瓶中，在121℃进行灭菌20min，冷却后接入二级液体培养基体积的5％一级种子液，得到二级发酵液；
S3、二级发酵液的培养：将步骤S2得到的二级发酵液放置于磁力搅拌器中进行搅拌，搅拌速度为800r/min，于28℃下恒温培养20h，并在中途补加100mL的50％葡萄糖溶液，即得酵母菌种子液。
所述步骤S1中一级液体培养基包括如下原料：蛋白胨1.0g，酵母膏0.5g，葡萄糖2.0g，磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.3g和水950g。
所述步骤S2中二级培养基包括如下原料：蛋白3.0g，酵母膏2.0g，葡萄糖5.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁1.0g、促进剂1.0g和水2500g。
所述促进剂为葛根素、黄芪多糖和海藻糖；所述葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为2：1.25：5。
实施例3、一种酵母菌种子液的培养方法
一种酵母菌种子液的培养方法，包括以下步骤：
S1、一级种子液的培养：量取100mL配制得到的一级液体培养基于250mL锥形瓶中，在125℃进行灭菌30min，冷却后接种一环试管保存的酵母菌菌种，并于28℃，200r/min摇床培养24h，即得一级种子液；
S2、二级发酵液制备：量取3L配制得到的二级液体培养基于5L锥形瓶中，在125℃进行灭菌30min，冷却后接入二级液体培养基体积的10％一级种子液，得到二级发酵液；
S3、二级发酵液的培养：将步骤S2得到的二级发酵液放置于磁力搅拌器中进行搅拌，搅拌速度为1000r/min，于30℃下恒温培养25h，并在中途补加100mL的50％葡萄糖溶液，即得酵母菌种子液。
所述步骤S1中一级液体培养基包括如下原料：蛋白胨2.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖3.0g，磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.5g和水1000g。
所述步骤S2中二级培养基包括如下原料及质量份数：蛋白胨5.0g，酵母膏3.0g，葡萄糖7.0g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁1.5g、促进剂1.5g和水3500g。
所述促进剂为葛根素、黄芪多糖和海藻糖；所述葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为3：1.25：5。
对比例1、一种酵母菌种子液的培养方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有葛根素。
制备方法同实施例2。
对比例2、一种酵母菌种子液的培养方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有黄芪多糖。
制备方法同实施例2。
对比例3、一种酵母菌种子液的培养方法
与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为1：1：1。
制备方法同实施例2。
对比例4、一种酵母菌种子液的培养方法
与实施例2相比，本对比例的区别在于：步骤S3进行摇床培养，其他操作参数与实施例2相同。
制备方法参照实施例2。
试验例一、酵母菌活菌数量测定
一、实验样品
实施例1～3、对比例1～4培养得到的酵母菌种子液。
二、实验方法
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，实施例1～3、对比例1～4培养得到酵母种子液由盖玻片边缘滴1小滴，让菌液沿缝隙自行进入计数室，静置5min。将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行观察计数，统计最终的酵母菌活菌数量。
三、实验结果
表1各样品酵母菌活菌数量实验结果
| 组别 | 细菌计数(CFU/ml) |
| 实施例1 | 3.3×10<sup>9</sup> |
| 实施例2 | 3.8×10<sup>9</sup> |
| 实施例3 | 3.5×10<sup>9</sup> |
| 对比例1 | 9.6×10<sup>8</sup> |
| 对比例2 | 9.8×10<sup>8</sup> |
| 对比例3 | 0.4×10<sup>9</sup> |
| 对比例4 | 1.9×10<sup>9</sup> |
从表1中的数据可以得知，本发明实施例1～3培养方法培养得到的酵母菌种子液具有的活菌数量最多，且均优于对比例1～4得到的活菌数量；由实施例1～3和对比例1～3的实验结果可以得知，本发明通过在培养基中加入特定比例的葛根素、黄芪多糖和海藻糖作为促进剂组分，可以显著提高最终培养得到的酵母菌的活菌数量；对比例4在培养方法上选用现有技术中的摇床培养操作，最终得到的种子液中酵母菌的活菌数仅为1.9×109CFU/m，远少于本发明实施例1～3。
试验例二、酵母菌菌种活力测定
一、实验样品
实施例1～3、对比例1～3培养得到的酵母菌种子液。
二、实验方法
2.1活力管的制备
称取脱脂奶粉11克加入89毫升蒸馏水，搅拌10-15分钟使之充分溶解，溶解后静置一小时后用双层纱布过滤，除去不溶物。然后将溶液分装试管10毫升，盖上塞子密封。采用间歇三次灭菌：第一次灭菌90-95℃水浴灭菌20分钟，取出自然冷却至室温然后放置于4-6℃冰箱保存。第二天进行第二次灭菌，方法同第一次灭菌，取出自然冷却至室温然后放置于4-6℃冰箱保存。第三天进行第三次灭菌，方法同第一次灭菌，取出自然冷却至室温然后放置于4-6℃冰箱保存备用。
2.2接种：使用实施例1～3、对比例1～3培养得到的酵母种子液进行接种，接种前将活力管预热至37℃，在灭菌的活力管中加入3％的发酵剂。接种操作要求在超净台完成，操作过程为无菌操作，使用接种吸管必须经过灭菌。
2.3发酵：在恒温37℃进行发酵培养3.5小时。
2.4测酸：发酵培养3.5小时后，立即取出活力管进行酸度测定。用移液管移取10ml样品至100ml三角瓶中，用20ml纯净水将移液管润洗干净后，一并倒入100ml三角瓶中，加入3滴0.5％酚酞，开始滴定。用0.1mol/ml NaOH标准溶液滴定至微红色，并在30秒内不退色。消耗的0.1mol/ml NaOH标准溶液毫升数乘以10，即为酸度。
2.5计算：菌种活力＝0.087×消耗氢氧化钠毫升数。
三、实验结果
表2各样品的氢氧化钠消耗量
| 组别 | 氢氧化钠消耗量(mL) | 菌种活力 |
| 实施例1 | 10.54 | 0.917 |
| 实施例2 | 10.62 | 0.924 |
| 实施例3 | 10.32 | 0.898 |
| 对比例1 | 7.75 | 0.674 |
| 对比例2 | 7.82 | 0.680 |
| 对比例3 | 8.15 | 0.709 |
从表2中的数据可以得知，本发明实施例1～3培养得到的酵母菌种子液，具有较高的菌种活力且均优于对比例1～3；由于对比例1中促进剂组分缺少葛根素，对比例2促进剂组分中缺少黄芪多糖，对比例3中促进剂组分葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为1：1：1，导致最终对比例1～3培养得到的酵母菌种子液具有的菌种活力较低，由此可以证明本发明在酵母菌种子液的培养基中加入促进剂组分可以显著提高最终培养得到的酵母菌的菌种活力，提供更高质量的酵母菌菌种，满足市场的需求。
从以上试验可以得出本项发明技术在酵母菌种子液培养过程的培养基中加入促进剂组分，通过各组分间的相互作用，能够有效促进酵母菌繁殖，大幅提高了酵母菌的活菌数量和菌种活力。同时选用磁力搅拌器进行搅拌培养，可以使培养基充分被搅起，有利于培养过程的顺利进行，选磁力搅拌器进行培养相比于现有技术中的摇床培养，克服了因摇床培养空间密闭狭小无法进行补料操作的缺陷，使二级酵母发酵液的产量大大提高。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种酵母菌种子液的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、一级种子液的培养：配置一级液体培养基，量取50～100mL配制得到的一级液体培养基于250mL锥形瓶中，在120～125℃进行灭菌，冷却后接种一环试管保存的酵母菌菌种，并于25～30℃，200r/min摇床培养20-24h，即得一级种子液；
S2、二级发酵液制备：配置二级液体培养基，量取1～3L配制得到的二级液体培养基于5L锥形瓶中，在120～125℃进行灭菌，冷却后接入一级种子液，得到二级发酵液；
S3、二级发酵液的培养：将步骤S2得到的二级发酵液放置于磁力搅拌器中进行搅拌，于25～30℃下恒温培养20-30h，即得酵母菌种子液。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中一级液体培养基包括如下原料及质量份数：蛋白胨0.5～2.0份，酵母膏0.1～1.0份，葡萄糖1.0～3.0份，磷酸二氢钾0.1～0.5份、硫酸镁0.1～0.5份和水900～1000份。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中二级培养基包括如下原料及质量份数：蛋白胨1.5～5.0份，酵母膏0.3～3.0份，葡萄糖3.0～7.0份，磷酸二氢钾0.3～1.5份，硫酸镁0.3～1.5份、促进剂0.3～1.5份和水1500～3500份。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述促进剂为葛根素、黄芪多糖和海藻糖。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述葛根素、黄芪多糖和海藻糖的质量比为(1～3)：1.25：5。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2中的灭菌时间均为10～30min。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中一级种子液的接种比例为步骤S2锥形瓶中二级液体培养基体积的3％-10％。
8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S3的二级发酵液培养过程中，还包括补料过程。
9.如权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述补料过程中补加50％葡萄糖溶液100mL。
10.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中磁力搅拌器的搅拌速度为500-1000r/min。
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