CN104357347B - 一株氧化葡萄糖酸杆菌及其在发酵产vc前体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株氧化葡萄糖酸杆菌及其在发酵产VC前体中的应用，所述氧化葡萄糖酸杆菌的分类命名为葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）S18，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2014387。将氧化葡萄糖酸杆菌经过平板培养、斜面培养、种子培养和发酵培养生产VC前体，无需伴生菌混合培养即可单独发酵生产VC前体，大幅度提高发酵产物中2‑KLG的产量，并且遗传稳定性好，连续传代5次后效价并无明显改变。在500L发酵罐中，糖酸转换率几乎没有下降，发酵时间也由72h下降到56h，极大的减少了生产成本，简化了生产工艺。

Description

一株氧化葡萄糖酸杆菌及其在发酵产VC前体中的应用
技术领域
本发明涉及一株氧化葡萄糖酸杆菌及其在发酵产VC前体中的应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
维生素C（L-抗坏血酸）是人体必需的维生素，具有极强的应用价值和生理作用。VC是我国医疗行业出口创汇的两大龙头产品之一，目前我国80%的VC相关产品用于出口，占国际市场份额的30%，但同时相关资料表明国内每年VC的生产能力仍过剩3万吨。在这种市场格局下，如何对VC生产进行科技创新，降低生产成本已成为亟待解决的问题。
目前，VC发酵工艺有化学技术为基础的莱氏法,我国学者研究出的二步发酵法以及运用基因工程技术为基础的一步发酵法。国内生产企业大多采用二步发酵法生产VC，相对于其他方法有成本低，效率高，污染低的优势，但目前还存在总收率过低的缺点，尤其第二部发酵的收率偏低。虞龙、余曾亮等运用低能离子注入技术对二步发酵法中的大菌和小菌进行了选育，比较了H+、N+、Ar+注入Vc生产菌的差异，确定了最佳诱变剂量，诱变后的糖酸转化率高达97％ ，并在后续研究中经180吨和300吨发酵罐近300次的实际生产应用，取得了明显的成效。
二步法发酵VC相比莱氏法有原料成本低，环境污染少等优点，但同时二步发酵法也有能耗高的缺点，二步发酵法工艺相对复杂，发酵过程中要时刻监控小菌数量。开发一步法直接用于工业应用的菌株可以大大降低生产成本，简化操作工艺，例如：虞龙等曾开发出耐33℃高温的高产VC菌株，就让企业每年节省了五千万的制冷费用，创造效益上亿元，为国家增加外汇四千万美元。
余曾亮等对二步发酵法发酵菌种进行选育前后对比研究表明，大菌分泌的胞外活性物质能促进小菌生长同时分泌的碱性物质能维持发酵体系中的pH值趋向于中性，这种环境更有利于小菌的生长代谢和产酸。小菌（氧化葡萄糖酸杆菌）在两部发酵法生产VC中主要产VC前体2-KLG，但单独培养存活和产酸效率较低，只有与伴生菌混合培养才能促进其生长和产酸。单独采用氧化葡萄糖酸杆菌发酵产VC，不仅可以减少制冷等能耗来节省成本，同时也可以简化生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一株氧化葡萄糖酸杆菌及其在发酵产VC前体中的应用，诱变方法简单、高效、安全，相较于出发混合菌种，得到的氧化葡萄糖酸杆菌能单独用于发酵，且发酵周期短，减少生产成本，简化生产工艺。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一株氧化葡萄糖酸杆菌，分类命名为葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）S18，已于2014年8月20日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2014387。
本发明所述的氧化葡萄糖酸杆菌的筛选方法是：将实验室保存的氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌在平板上混合培养，细胞悬浮液经低能氮离子注入诱变后，通过平板初筛获得能单独生长和产酸的氧化葡萄糖酸杆菌，通过平板初筛、摇瓶发酵复筛获取作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出符合工业应用的目标菌株葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）S18。
本发明菌株的形态学及生理化学特征如下：
菌落颜色：白色；
需氧方式：好氧；
菌落大小：3~8μm；
适宜生长温度：30~35℃；
适宜生长pH：6.0~7.0；
菌落形态：椭圆形；
革兰氏染色：阴性。
本发明所提供的氧化葡萄糖酸杆菌筛选诱变方法，具体步骤如下
（a)、混合细胞悬浮液制备：将平板上培养的混合菌株氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌，制成细胞悬液，调整浓度为106/毫升。
（b)、低能氮离子注入诱变：取0.1 mL的步骤(a)中细胞悬浮液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20~30 KeV，注入剂量为3.6×1014~26.6×1014 ions/cm3下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到平板培养基上，在30~35 ℃下倒置培养培养时间为2~3d。
(c)、筛选能够单独存活的氧化葡萄糖酸杆菌：将步骤（b）诱变得到的菌种接种至平板培养基上培养后，筛选能够单独存活的氧化葡萄糖酸杆菌落。
（d）、单细胞悬浮液的制备：将筛选出的氧化葡萄糖酸杆菌涂布到平板培养基上，并在30~35 ℃下倒置培养2~3d后，制备成细胞悬液，调整浓度为106/毫升。
（e）、低能氮离子注入诱变：取0.1 mL的步骤(d)中细胞悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20~30 KeV，注入剂量为3.6×1014~26.6×1014ions/cm3下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到平板培养基上，在30~35 ℃下倒置培养，培养时间为2~3d。
（f）、复筛：将步骤（e）诱变得到的菌种接种至斜面培养基上培养后，在30~35℃下倒置培养培养时间为2~3 d；再接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间24~36 h.，将种子培养基中的种液接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，250 mL摇瓶装液量30~50 mL，发酵温度30~35 ℃，发酵时间48~72h。
用标准碘量法测定2-KLG含量，二苯胺法测定山梨糖含量。筛选出高产菌株做下一次诱变的出发菌株，重复d~f，直到筛选出目标菌株。
步骤（b）中低能氮离子注入，优选诱变能量为25KeV。
在上述筛选方法中：步骤（b)、（c）、（d）和（e）中所采用的平板培养基包含如下质量百分数成分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的一种或多种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的一种或几种混合。
步骤（f）所采用的斜面培养基包含如下质量分数成分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的一种或几种混合。
步骤（f)所采用的种子培养基包含如下质量分数成分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的一种或几种混合。
步骤（f）所采用的发酵培养基包含如下质量分数成分：氮源5%~10%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的一种或几种混合。
上述筛选出的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵生产VC前体中的应用。具体步骤如下：
（1）平板培养：将氧化葡萄糖酸杆菌接种到平板培养基，培养温度为30~35℃。培养时间2~3d。
（2）、斜面培养：将步骤(1)平板培养的氧化葡萄糖酸杆菌接种到斜面培养基上，培养温度为30~35℃，培养时间为2~3d。
（3）、种子培养：将步骤（2）斜面培养的氧化葡萄糖酸杆菌接种到种子培养基中，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间为24~36h。
（4）、发酵培养：将步骤（3）中的种子培养液接种至发酵培养基，以5%~15%（V/V）接种量接种于发酵培养基中，培养温度为30~35℃，培养时间为48~72h。
其中，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分：所述步骤2）中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
所述种子液培养基包含如下质量分数组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的一种或几种混合。
所述发酵培养基包含如下质量分数组分：氮源5%~10%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的一种或几种混合。
有益效果：
本发明筛选得到的氧化葡萄糖酸杆菌，无需伴生菌混合培养即可单独发酵生产VC前体，大幅度提高发酵产物中2-KLG的产量，并且遗传稳定性好，连续传代5次后效价并无明显改变。在500L发酵罐中，糖酸转换率几乎没有下降，发酵时间也由72h下降到56h，极大的减少了生产成本，简化了生产工艺。本发明菌株完全符合工业化VC生产的技术指标，可用于工业化发酵生产，有重大的社会科研意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制本发明。
实施例1
本实施例说明将氧化葡萄糖酸杆菌原始菌株进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。
进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下：
（a）、单细胞悬浮液制备：取30~35℃恒温培养2~3d的氧化葡萄糖酸杆菌新鲜斜面加无菌水10mL，制成菌悬液，用血球计数板计数，调整细胞浓度106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL步骤（a）中的菌悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在25KeV,注入剂量为6.6×1014ions/cm3下对其进行氮离子注入，靶室真空度为10-3Pa，以15S脉冲式注入，间隔10S，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1mL无菌水洗脱，涂布到平板上，在30~35℃下倒置培养2~3d。
(c)、诱变菌株的筛选：
初筛：取步骤（b）中的单菌落接种至斜面培养基上，培养温度为30~35℃，培养时间为2~3d，再将斜面培养基上的单菌落接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间24~36h。用标准碘量法测定2-KLG含量，二苯胺法测定山梨糖含量。挑选糖酸转化率高的菌株作为作为复筛菌株。
复筛：将筛选出的种子培养基中的种液接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，250mL摇瓶装液量30~50mL，发酵温度30~35℃，发酵时间48~72h。用标准碘量法测定2-KLG含量，二苯胺法测定山梨糖含量。挑选平板上糖酸转化率高的菌株进行再次诱变。
其中步骤（b）中的平板培养基为：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃； 所述百分数为质量百分数。
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
所述种子液培养基包含如下质量分数组分：玉米浆2%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
所述发酵培养基包含如下质量分数组分：玉米浆3%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵结束后检测各菌株产量如表1所示
表1
菌号 出发混合菌 诱变后菌种
2-KLG（mg/mL) 93.652 94.368
山梨糖（mg/mL) 2.431 1.573
实施例2 本实施例说明菌株的鉴定及遗传稳定性
菌株的鉴定：细胞呈椭圆状，较长较细，好氧的革兰氏阴性菌，无鞭毛，在平板培养基上菌落颜色为白色，圆柱形菌落，菌落较薄，湿润，边缘整齐，表面光滑，质地均匀，菌落大小3~8μm，生长最适温度：28~35℃，生长温度范围为25-35℃，生长最适pH：6.0~7.0，生长pH范围为5.2~7.2。
传代发酵实验：将筛选得到的氧化葡萄糖酸杆菌S18接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养48h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间48h。将斜面培养物接种到种子培养基后，培养温度30℃，100mL摇瓶装液量45mL，在120rpm摇床转速下培养24h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），培养温度29℃，在180rpm转速下培养60h。发酵培养结束后检测发酵液中2-KLG与山梨糖含量结果如表2所示：
表2埃博霉素高产菌的遗传稳定性
传代次数 2-KLG/( mg/mL) 山梨糖/( mg/mL)
1 93.381 2.336
2 92.278 4.816
3 92.692 1.593
4 91.571 0.287
5 89.846 1.491
从实验结果可知，经过5次连续传代，突变株S18较稳定，有较好的传代稳定性。可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3
本实施例说明氧化葡萄糖酸杆菌S18在发酵生产VC前体（2-KLG）中的应用
本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：玉米浆2%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0. 1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：玉米浆3%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的氧化葡萄糖酸杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养48h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间48h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养64h。发酵培养结束后检测发酵液中2-KLG含量为94.3 mg/mL，较出发混合菌种(93.6mg/mL)无下降，发酵周期缩短了11.1%。
实施例4
本实施例说明氧化葡萄糖酸杆菌S18在发酵生产VC前体（2-KLG）中的应用本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：玉米浆2%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0. 1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：玉米浆3%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的氧化葡萄糖酸杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养48h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间48h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养60h。发酵培养结束后检测发酵液中2-KLG含量为93.1 mg/mL，较出发混合菌种几乎无下降，发酵周期缩短了16.7%。
实施例5
本实施例说明氧化葡萄糖酸杆菌S18在发酵生产VC前体（2-KLG）中的应用本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：玉米浆2%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0. 1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：玉米浆3%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的氧化葡萄糖酸杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养48h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间48h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养56h。发酵培养结束后检测发酵液中2-KLG含量为92.6 mg/mL，较出发混合菌种几乎无下降，发酵周期缩短了22.2%。
实施例6
本实施例说明氧化葡萄糖酸杆菌S18在发酵生产VC前体（2-KLG）中的应用本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：玉米浆3%，尿素1%，山梨糖5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：玉米浆2%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0. 1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：玉米浆3%，尿素2%，山梨糖10%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的氧化葡萄糖酸杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养48h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间48h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养48h。发酵培养结束后检测发酵液中2-KLG含量为90.3 mg/mL，较出发混合菌种下降了3%，发酵周期缩短了33.3%。
实施例7 本实施例说明2-KLG含量以及山梨糖含量的测试方法
标准碘量法测定2-KLG含量：
试剂：H2SO4，淀粉，碘液
（1）测试样的制备：取发酵液2mL至大试管中，加14N H2SO2ML，摇匀，置沸水浴加热20min，取出用水冷却，将其转入三角瓶中。
（2）测试试剂的滴定：往三角瓶内加1%淀粉做指示剂，用0.1N碘液滴定至蓝色即为终点，同时做空白对照，根据标准曲线换算。
计算方法：2-KLG（mg/mL)=(VI2+0.04707)/0.1357
VI2：发酵液样品耗碘毫升数减去空白耗碘毫升数之差。
二苯胺法测定山梨糖含量：
试剂：浓盐酸，无水乙醇，80%无水乙醇，60%无水乙醇，二苯胺。
（1）山梨糖标准液的制备：准确称取105℃干燥至恒重的山梨糖标准样品100mg于100mL容量瓶中，加蒸馏水200mL溶解，然后加无水乙醇稀释至刻度。精密称取此溶液5mL于100mL量瓶中，用80%乙醇稀释至刻度，每mL含山梨糖50微克。
（2）测定方法：精密称取发酵液1mL于25mL或50mL量瓶中，加蒸馏水5mL，用无水乙醇调节醇浓度达80%，摇匀，放置片刻，过滤。滤液用于测定。取1mL滤液于10mL量瓶中，加入浓盐酸1.5mL，2%二苯胺乙醇液2mL，摇匀后于沸水中加热30min，取出，用冷水迅速冷却，以60%乙醇稀释至刻度。在640nm波长处，以水为空白溶液测试吸光度，同时取山梨糖标准液进行标准对照，根据所得吸光度计算山梨糖含量。
计算方法：山梨糖=S×D1×N/(V×D2）
S：山梨糖标准品重量 D1：样品吸光度
D2：山梨糖标准品吸光度 V：试样体积
N：稀释倍数。

Claims (7)

1.一株氧化葡萄糖酸杆菌，分类命名为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）s18，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2014387。
2.权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵产VC前体中的应用。
3.权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵产VC前体中的应用，其特征在于包括如下步骤：
1）平板培养：将氧化葡萄糖酸杆菌接种至平板培养基上培养，培养温度为30~35℃，培养时间为2~3d；
2）斜面培养：将步骤1）平板培养基培养的氧化葡萄糖酸杆菌接种至斜面培养基培养，培养温度为30~35℃，培养时间为2~3d；
3）种子培养：将步骤2）中氧化葡萄糖酸杆菌的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，培养时间24~36h；
4） 发酵培养：将步骤3)中种子培养的氧化葡萄糖酸杆菌接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，发酵温度30~35℃，发酵时间48~72h。
4.根据权利要求3所述的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵产VC前体中的应用，其特征在于：所述步骤1）中平板培养基包含如下质量百分数的组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的至少一种,且包括山梨糖；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵产VC前体中的应用，其特征在于所述步骤2）中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的至少一种，且包括山梨糖；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的氧化葡萄糖酸杆菌菌在发酵产VC前体的应用，其特征在于所述步骤3）中的种子培养基包含如下质量百分数的组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的至少一种，且包括山梨糖；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的氧化葡萄糖酸杆菌菌在发酵产VC前体的应用，其特征在于所述步骤4）中的发酵培养基中包含如下质量分数的组分：氮源5%~10%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者山梨糖中的至少一种，且包括山梨糖；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105420222A (zh) * 2015-12-04 2016-03-23 帝斯曼江山制药（江苏）有限公司 一种普通生酮基古龙酸菌的诱变筛选方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101208428B (zh) * 2005-02-11 2014-05-21 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对维生素c的发酵生产
CN102250822A (zh) * 2011-06-01 2011-11-23 江南大学 一种改造氧化葡萄糖酸杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法
CN103290071B (zh) * 2013-06-09 2015-02-18 山东天力药业有限公司 一种2-酮基-l-古龙酸的制备方法
CN103484418A (zh) * 2013-10-08 2014-01-01 江南大学 一种生产2-klg的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其应用
CN103484417B (zh) * 2013-10-08 2015-06-24 江南大学 一种提高生产2-klg发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一种新型诱变技术在Vc前体(2-KLG)产生菌遗传改良中的作用;虞龙 等;《高技术通讯》;20021128;第41页摘要、第1.1节，第44页表1，第45页图5、图6 *
低能N~+诱变B. trispora(-)菌存活率-注入量效应模型的构建;张宁，虞龙;《辐射研究与辐射工艺学报》;20100420;83-86 *
低能离子注入介导Vc前体(2-KLG)产生菌的DNA转导;虞龙 等;《核技术》;20040410;第264页摘要 *
氮离子注入柠檬酸生产菌的诱变选育;虞龙 等;《辐射研究与辐射工艺学报》;20050830;233-236 *

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