CN117580957A - 一种安丝菌素p-3的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
一种安丝菌素的发酵方法，包括发酵培养和自发酵培养起即始的每日流补，所述每日流补所添加的补料按质量体积比包括30～60％葡萄糖及安丝菌素代谢合成前体0.02‑0.2％，所述安丝菌素代谢合成前体包括甲硫氨酸、异亮氨酸和异丁醇。所述发酵培养的培养基按质量体积比包括：速效碳源0.2～5％，缓释碳源0.5～5％，速效氮源0.2～5％，缓释氮源0.5～5％，无机盐0.2～1.5％。发酵效价可稳定在600ug/m以上。
Description
本发明属于医药技术领域，更进一步的属于发酵技术领域，具体涉及一种安丝菌素的发酵方法，包括种子培养、发酵培养、补料培养等。
安丝菌素是一种美登素类抗生素，其主要是从微生物比如橙色珍贵束丝放线菌发酵生产的，具有极强的抗肿瘤、抗结核杆菌、抗细菌等多种药理活性。
安丝菌素P-3为主要发酵产物，其通过阻碍微管形成从而阻止细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著抗肿瘤作用。
安丝菌素的化学结构式为：
安丝菌素为聚酮类化合物，安丝菌素的生物合成途径主要由以下三个主要阶段构成：Ⅰ.葡萄糖经生物反应生成葡萄糖-6-磷酸，以葡萄糖-6-磷酸为反应起始点，分别经过磷酸戊糖途径和糖酵解途径产出赤藓糖-4-磷酸(E-4-P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，再由赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸经氨基莽草酸生物合成途径，从而得到3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)。Ⅱ.以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)为生物代谢起点，Ⅰ型聚酮合酶的催化下继续添加丙酸单元、乙酸单元、聚酮碳链延伸单元等，缩合反应形成前体安丝菌素化合物。Ⅲ.前体安丝菌素化合物经过6个聚酮合酶的修饰步骤最终合成P-3。
目前大多数专利和文献，主要有以下现有技术述及，
CN 105907681B，一种高产安丝菌素P-3的突变株及安丝菌素P-3的制备方法，紫外线灯诱变筛选出珍贵橙色束丝放线菌，控制发酵过程中通气比为1.0～2.0vvm，发酵溶氧大于30％，pH为6.0～8.0。发酵周期6-7天，发酵终点效价152.21mg/L。
CN 103805648 B，高产安丝菌素发酵工艺，珍贵橙色束丝放线菌，发酵培养基发酵2～3天后，向发酵液中加入0.10～0.30％(v/v)的异丁醇，发酵进行4～6天后，向发酵液中流加葡萄糖，流加速率为3～10g/L/d；发酵进行8～12天后，进入重复补料分批发酵阶段。发酵周期20-21天，发酵终点效价410mg/L。
其余文献有零星描述通过正交等试验设计优化安丝菌素(P-3)发酵配方试验，进行配方优化，且配方优化主要集中于基础粮食物料配比，未针对代谢过程、生物代谢途径关键前体等进行优化。
发明内容
本方法通过分析生物代谢途径设计基础配方DOE实验和前体补料响应面实验，采用明确的发酵配方和前体补量设计，操作简单、过程控制稳定，适合工业化生产。
在对安丝菌素生物合成途径前体的影响研究中异丁醇、甲硫氨酸和异亮氨酸作用位点和代谢机理较为重要。异丁醇通过异丁醇脱氢酶(IDH)转化为异丁酸进一步经过生物代谢生产异丁酰辅酶A，异丁酰辅酶A通过异丁酰辅酶A变位酶转化为乙酰辅酶A进一步经过生物代谢生产丙二酰辅酶A参与至安丝菌素的生物合成途径Ⅱ阶段缩合反应形成前体安丝菌素化合物中。异丁醇同时还具备激活葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和柠檬酸合成酶基因表达的作用，增强糖酵解途径，影响安丝菌素的生物合成途径Ⅰ阶段。甲硫氨酸和异亮氨酸通过生物合成丙酰辅酶A，参与至安丝菌素的生物合成途径Ⅱ阶段中。同时甲硫氨酸还经生物代谢合成形成S-腺苷-蛋氨酸参与至安丝菌素的生物合成途径Ⅲ阶段聚酮合酶的修饰步骤。控制各前体补入配比和总量，可以有效提高生物代谢合成安丝菌素(P-3)效率。
本发明通过将发酵培养基内速效碳氮源和缓释碳氮源、各生物代谢途径关键前体通过DOE实验设计，优选适宜参数。完成发酵优化控制，将碳代谢流从中心代谢途径向安丝菌素生物合成途径引导。本发明提供的发酵方法，经过发酵体系验证，在13～14天发酵周期，放罐可达到711ug/ml。
一种安丝菌素P-3的发酵培养基，包括以下组分：
| 发酵培养基组分 | 质量体积比(W/V) |
| 速效碳源 | 0.2～5％ |
| 缓释碳源 | 0.5～5％ |
| 速效氮源 | 0.2～5％ |
| 缓释氮源 | 0.5～5％ |
| 无机盐 | 0.2～1.5％ |
所述发酵培养基的pH值为6.5～7.5。
发酵培养基按上述工艺配方进行配料，发酵罐内加水，边搅拌边投入原料；
所述的发酵投料后的体积可为0～50000L；
所述的发酵罐温度为10～37℃，优选为25～30℃；
所述的发酵罐培养的时间为12～14天；
所述的发酵培养自发酵培养起即开始流补；所述的流补按每日流补量计算；
所述每日流补的补料配方如下：
作为一种具体的实施方案，所述的碳源包括但不限于：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘油、麦芽糊精、高麦芽糖粉、玉米粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、糯米粉、可溶性淀粉、酵母粉等。
作为一种具体的实施方案，所述的氮源包括但不限于：麦芽提取物、酵母提取物、酵母浸粉、酵母粉、酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、玉米蛋白粉、大豆蛋白粉、棉籽精粉、大豆粉、黄豆饼粉等。
作为一种具体的实施方案，所述的碳源包括速效碳源和缓释碳源。
作为一种具体的实施方案，所述的氮源包括速效氮源和缓释氮源。
作为一种具体的实施方案，所述的速效碳源包括但不限于：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、乳糖等。
作为一种具体的实施方案，所述的缓释碳源包括但不限于：玉米粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、糯米粉、可溶性淀粉等。
作为一种具体的实施方案，所述的速效氮源包括但不限于：麦芽提取物、酵母提取物、酵母浸粉等。
作为一种具体的实施方案，所述的缓释氮源包括但不限于：玉米蛋白粉、大豆蛋白粉、棉籽精粉、大豆粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉等。
作为一种具体的实施方案，所述的无机盐包括但不限于：碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氯化物等。
作为一种具体的实施方案，所述的无机盐选自碳酸钙、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁。
本发明还提供一种安丝菌素P-3的发酵方法，包括以下步骤：
1.摇瓶种子培养：包括摇瓶种子的配制、分装、灭菌、接种和培养，得到摇瓶种子菌液；
2.种子罐培养：包括种子培养的配料、灭菌、接种和培养，得到种子菌液；
3.发酵培养：包括发酵培养基的配料、灭菌、接种和培养，得到安丝菌素发酵液；
4.补料培养：自发酵培养起始即开始流补，所述的流补以每日流补量计算；
5.放罐。
作为一种具体的实施方案，本发明的发酵培养基的配方如下：
| 发酵培养基组分 | 质量体积比(W/V) |
| 葡萄糖 | 0.1～2％； |
| 甘油 | 0.1～2％； |
| 果糖 | 0.1～2％； |
| 可溶性淀粉 | 0.5～2.5％； |
| 马铃薯淀粉 | 0.5～2.5％； |
| 酵母抽提物 | 0.1～1％； |
| 棉籽精粉 | 0.1～1％； |
| 碳酸钙 | 0.1～1％； |
| 磷酸二氢钾 | 0.01～0.1％； |
| 硫酸镁 | 0.01～0.1％； |
| 硫酸亚铁 | 0.01～0.1％； |
作为一种具体的实施方案，发酵培养的方式为，按配比取各组分进行配料，发酵罐内加入水，边搅拌边加入原料，用氢氧化钠调节pH，依次进行实罐灭菌和管道灭菌后，用无菌空气把种子液压入发酵罐。
作为一种具体的实施方案，本发明的补料培养方式如下：每日流补30～60％葡萄糖，维持发酵体系残糖0.5～1％，并每日流补前体，所述前体为安丝菌素合成途径前体。
作为一种具体的实施方案，所述的前体选自异丁醇、甲硫氨酸和异亮氨酸。
作为一种具体的实施方案，所述流补前体的含量为0.02～0.2％。
作为一种具体的实施方案，所述流补前体甲硫氨酸的含量为0.01～0.1％，优选为0.03～0.06％，更优选为0.05％。
作为一种具体的实施方案，所述流补前体异亮氨酸的含量为0.01～0.1％，优选为0.03～0.06％，更优选为0.04～0.05％。
作为一种具体的实施方案，所述流补前体异丁醇的含量为0.01～0.1％，优选为0.01～0.04％，更优选为0.015～0.02％。
本发明提供的安丝菌素P-3发酵方法，包括以下步骤：
1.发酵培养：称取各原料，以重量体积比计为，葡萄糖0.1～2％、果糖0.1～2％、甘油0.1～2％、马铃薯淀粉0.5～2.5％、可溶性淀粉0.5～2.5％、酵母抽提物0.1～1％、棉籽精粉0.1～1％、碳酸钙0.1～1％、磷酸二氢钾0.01～0.1％、硫酸镁0.01～0.1％和硫酸亚铁0.01～0.1％；发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，用氢氧化钠调节pH至6.8～7.5，灭菌，保温保压；用无菌空气把种子液压入发酵罐，发酵罐于罐温25～30℃培养；
2.补料培养：发酵培养开始后即进行每日流补，流补30～60％葡萄糖，以及前体异丁醇、甲硫氨酸和异亮氨酸；
3.放罐：发酵培养12～14天后，发酵结束。
本发明的有益效果为：
1.发酵培养基内速效/缓释碳源，速效/缓释氮源种类筛选和比例筛选。影响菌体初级代谢增长菌体，和利用碳氮源次级代谢产生API，以安丝菌素(P-3)为例，生物代谢途径中初始碳源为葡萄糖。但在基础培养基中加入过量葡萄糖，引起葡萄糖阻遏效应，分解代谢产物阻遏某些编码诱导酶体系的基因的转录，从而影响其对其他碳源的利用效率，细胞生长受到抑制。本专利对初始碳氮源进行种类筛选，并使用田口实验完成发酵配方各组分比例优选。
2.本发明相较于现有技术，通过在生物代谢合成过程中适量添加部分前体，配合API的生物合成。但部分前体如异丁醇，流补过量对菌体生长会产生抑制作用。本专利通过响应面实验，在发酵体系流补前体组分、总量选择中，得出优解。
3.本发明提供的发酵方法，经过发酵体系验证，在12～14天发酵周期，放罐可达到600ug/ml以上。
图1-实施例5所得发酵产物的HPLC图谱
图2-实施例10所述的mintab多响应预测结果图
图3～5-实施例10响应面预测中P-3效价与前体％的等值线图
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例用于理解本发明的 方法和核心思想，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，进行任何可能的变化或替换，均属于本发明的保护范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件；未注明来源的原料和试剂，通常为通过商业途径可购得的常规试剂。
菌种及保存方法
本发明所使用的安丝菌素P-3菌株的分类命名为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)，已于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC NO.21355。
本发明所述的菌种以甘油管和斜面两种形式保藏。
实施例1:发酵培养
发酵培养基配方(W/V)：葡萄糖1.0％；甘油6.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉2.0％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
按上述工艺配方进行配料，发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，并调节pH至6.5～7.0。进汽实罐灭菌，罐温118-122℃，罐压0.09-0.12MPa，保温保压30min；进行管道灭菌，灭菌时间60min。用无菌空气把种子液压入发酵罐，接种前检查并记录种子情况。
发酵液于罐温30℃，罐压0.04～0.05MPa。
自发酵培养起始即开始每日流补，其中流补的补料中葡萄糖配制比例为葡萄糖30～60％，流补中包括安丝菌素生物合成前体0.1％，其中前体是异丁醇、甲硫氨酸和异亮氨酸的等量混合。
本实施例1所记载的发酵方法获得的安丝菌素P-3的发酵效价为639ug/ml。
实施例2
发酵培养基配方(W/V)：葡萄糖0.5％；甘油3.2％；果糖0.2％；可溶性淀粉2％；马铃薯淀粉3.2％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉0.4％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
按上述工艺配方进行配料，发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，并调节pH至6.5～7.0。
发酵液于罐温30℃，罐压0.04～0.05MPa。
自发酵培养起始即开始每日流补，其中流补的补料中葡萄糖配制比例为葡萄糖30～60％，流补中包括安丝菌素生物合成前体，其中异丁醇0.03％、甲硫氨酸0.03％和异亮氨酸0.03％。
本实施例2所记载的发酵方法获得的安丝菌素P-3的发酵效价为642ug/ml。
实施例3
发酵培养基配方(W/V)：葡萄糖0.5％；甘油0.8％；果糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉3.2％；酵母抽提物0.8％；棉籽精粉0.4％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
按上述工艺配方进行配料，发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，并调节pH至6.5～7.0。
发酵液于罐温30℃，罐压0.04～0.05MPa。
自发酵培养起始即开始每日流补，其中流补的补料中葡萄糖配制比例为葡萄糖30～60％，流补中包括安丝菌素生物合成前体，其中异丁醇0.01％、甲硫氨酸0.05％和异亮氨酸0.03％。
本实施例3所记载的发酵方法获得的安丝菌素P-3的发酵效价为652ug/ml。
实施例4
发酵培养基配方(W/V)：葡萄糖0.5％；甘油0.8％；果糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉3.2％；酵母抽提物0.8％；棉籽精粉0.4％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
按上述工艺配方进行配料，发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，并调节pH至6.5～7.0。发酵液于罐温30℃，罐压0.04～0.05MPa。
自发酵培养起始即开始每日流补，其中流补的补料中葡萄糖配制比例为葡萄糖30～60％，流补中包括安丝菌素生物合成前体，其中异丁醇0.03％、甲硫氨酸0.05％和异亮氨酸0.05％。
本实施例4所记载的发酵方法获得的安丝菌素P-3的发酵效价为650ug/ml。
实施例5
发酵培养基配方(W/V)：葡萄糖0.5％；甘油0.8％；果糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉3.2％；酵母抽提物0.8％；棉籽精粉0.4％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
按上述工艺配方进行配料，发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，并调节pH至6.5～7.0。发酵液于罐温30℃，罐压0.04～0.05MPa。
自发酵培养起始即开始每日流补，其中流补的补料中葡萄糖配制比例为葡萄糖30～60％，流补中包括安丝菌素生物合成前体，其中异丁醇0.018％、甲硫氨酸0.05％和异亮氨酸0.043％。
本实施例5所记载的发酵方法获得的安丝菌素P-3的发酵效价为711ug/ml。
附图1为本实施例4发酵终点产物HPLC图谱。
实施例6：发酵培养物料的考察
实验设计：
本次实验意在筛选发酵培养配方中碳氮源的选择。
除碳氮源外，无机盐的组分为碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
下述每个筛选的实验方案，除发酵碳源氮源和前体的组分与比例外，其余方案均与实施例1相同。
实验方案：
方案1-1：发酵培养基配方(W/V)为乳糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-2：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-3：发酵培养基配方(W/V)为果糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-4：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-5：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；高麦芽糖粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-6：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；麦芽糊精2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-7：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；玉米粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-8：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；马铃薯淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-9：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；糯米粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-10：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；大豆粉1％；
方案1-11：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；大豆粉1％；
方案1-12：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；大豆粉1％；
方案1-13：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母浸粉0.5％；大豆粉1％；
方案1-14：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母粉0.5％；大豆粉1％；
方案1-15：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；麦芽提取物0.5％；酵母蛋白胨0.5％；大豆粉1％；
方案1-16：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；大豆蛋白胨0.5％；大豆粉1％；
方案1-17：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；酵母粉0.5％；玉米浆干粉1％；
方案1-18：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；酵母粉0.5％；玉米蛋白粉1％；
方案1-19：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；酵母粉0.5％；水解植物蛋白1％；
方案1-20：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；酵母粉0.5％；大豆蛋白粉1％；
方案1-21：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；酵母粉0.5％；棉籽精粉1％；
方案1-22：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；酵母粉0.5％；黄豆饼粉1％；
实验结果：
实验结论：配方中不足量的速效氮源会致使发酵效价不佳；配方中以乳糖为速效碳源会致使发酵效价不佳；基本确认本发明的速效碳源可以是葡萄糖、果糖、甘油；缓释碳源可以是麦芽糊精、玉米粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉；速效氮源可以是酵母浸粉、酵母抽提物、麦芽提取物、酵母粉、酵母蛋白胨；缓释氮源可以是玉米浆干粉、玉米蛋白粉、水解植物蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、棉籽精粉、黄豆饼粉。
基本确认本发明发酵罐与补料的碳源、氮源、复合碳氮源的选择可以为葡萄糖、甘油、糊精、麦麸、豆饼粉、生豆粉、玉米浆、酵母粉。
实施例7：基于摇瓶实验的发酵培养物料配比的考察
实验设计：基于实施例6中关于碳氮源的选择，进一步测试合理的葡萄糖、果糖、甘油、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、酵母抽提物、麦芽提取物、棉籽精粉在发酵培养基中的比例。
除碳氮源外，无机盐的组分为碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
下述每个筛选的实验方案，除发酵碳源氮源和前体的组分与比例外，其余方案均与实施例1相同。
方案2-1：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油2.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉1.0％；
方案2-2：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油4.0％；果糖1.0％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉4.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉2.0％；
方案2-3：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油6.0％；果糖2.0％；可溶性淀粉6.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物2.0％；棉籽精粉3.0％；
方案2-4：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖1.0％；甘油2.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉4.0％；酵母抽提物2.0％；棉籽精粉3.0％；
方案2-5：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖1.0％；甘油4.0％；果糖1.0％；可溶性淀粉6.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉1.0％；
方案2-6：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖1.0％；甘油6.0％；果糖2.0％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉2.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉2.0％；
方案2-7：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖2.0％；甘油2.0％；果糖1.0％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉3.0％；
方案2-8：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖2.0％；甘油4.0％；果糖2.0％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉2.0％；酵母抽提物2.0％；棉籽精粉1.0％；
方案2-9：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖2.0％；甘油6.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉6.0％；马铃薯淀粉4.0％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉2.0％；
实验结果：
实验结论：试验显示，葡萄糖1％，甘油4％，果糖0.5％，可溶性淀粉6％，马铃薯淀粉4％，酵母抽提物1％和棉籽精粉1％为相对较优的物料配比选择，为后续精选配比提供基础。
实施例8：基于摇瓶的发酵流补培养前体的考察
实验设计：基于实施例6和7中关于碳氮源的选择和配比，考察是否需加入安丝菌素P-3代谢途径关键前体混合物(总甲硫氨酸0.3％、异亮氨酸0.3％、异丁醇0.3％)为因子，并筛选前体的比例。
除碳氮源外，无机盐的组分为碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；七水硫酸亚铁0.001％。
下述每个筛选的实验方案，除发酵碳源氮源的组分与比例外，其余方案均与实施例1相同。
方案3-1：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油2.0％；果糖2.0％；可溶性淀粉6.0％；马铃薯淀粉4.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉1.0％；前体0.1％；
方案3-2：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油4.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物2.0％；棉籽精粉2.0％；前体0.1％；
方案3-3：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖0.5％；甘油6.0％；果糖1.0％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉2.0％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉3.0％；前体0.1％；
方案3-4：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖1.0％；甘油2.0％；果糖1.0％；可溶性淀粉6.0％；马铃薯淀粉2.0％；酵母抽提物2.0％；棉籽精粉2.0％；前体0.1％；
方案3-5：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖1.0％；甘油4.0％；果糖2.0％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉4.0％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉3.0％；前体0.1％；
方案3-6：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖1.0％；甘油6.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉2.0％；前体0.1％；
方案3-7：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖2.0％；甘油2.0％；果糖2.0％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉1.0％；前体0.1％；
方案3-8：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖2.0％；甘油4.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉6.0％；马铃薯淀粉2.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉3.0％；前体0.1％；
方案3-9：发酵培养基配方(W/V)为葡萄糖2.0％；甘油6.0％；果糖1.0％；可溶性淀粉2.0％；马铃薯淀粉4.0％；酵母抽提物2.0％；棉籽精粉1.0％；前体0.1％；
实验结果：
实验结论：试验显示，引入安丝菌素生物合成路径前体有助于其发酵培养。
实施例9：田口实验筛选发酵培养物料组分和配比的考察及数据分析和优化
实验设计：实施例6～8中筛选的物料，通过mintab进行静态田口设计，将葡萄糖、果糖、甘油、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、酵母抽提物、棉籽精粉在发酵培养基中所占比例，以及每日流补中是否加入安丝菌素P-3代谢途径关键前体混合物(总甲硫氨酸0.3％、异亮氨酸0.3％、异丁醇0.3％)为因子。筛选物料比例，其正交因子如下。
| 因子符号 | 因子名称 | 水平1 | 水平2 | 水平3 |
| A | 前体混合 | 不添加 | 添加 | N/A |
| B | 葡萄糖 | 0.2％ | 0.5％ | 0.8％ |
| C | 甘油 | 0.8％ | 2％ | 3.2％ |
| D | 果糖 | 0.2％ | 0.5％ | 0.8％ |
| E | 可溶性淀粉 | 0.8％ | 2％ | 3.2％ |
| F | 马铃薯淀粉 | 0.8％ | 2％ | 3.2％ |
| G | 酵母抽提物 | 0.2％ | 0.5％ | 0.8％ |
| H | 棉籽精粉 | 0.4％ | 1％ | 1.6％ |
下述每个筛选的实验方案，除发酵罐与补料配方中的碳源氮源的组分与比例外，其余方案均与实施例1相同。
| 编号 | A水平 | B水平 | C水平 | D水平 | E水平 | F水平 | G水平 | H水平 |
| 4-1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 4-2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 4-3 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 4-4 | 1 | 2 | 1 | 1 | 2 | 2 | 3 | 3 |
| 4-5 | 1 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 |
| 4-6 | 1 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 2 | 2 |
| 4-7 | 1 | 3 | 1 | 2 | 1 | 3 | 2 | 3 |
| 4-8 | 1 | 3 | 2 | 3 | 2 | 1 | 3 | 1 |
| 4-9 | 1 | 3 | 3 | 1 | 3 | 2 | 1 | 2 |
| 4-10 | 2 | 1 | 1 | 3 | 3 | 2 | 2 | 1 |
| 4-11 | 2 | 1 | 2 | 1 | 1 | 3 | 3 | 2 |
| 4-12 | 2 | 1 | 3 | 2 | 2 | 1 | 1 | 3 |
| 4-13 | 2 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1 | 3 | 2 |
| 4-14 | 2 | 2 | 2 | 3 | 1 | 2 | 1 | 3 |
| 4-15 | 2 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 2 | 1 |
| 4-16 | 2 | 3 | 1 | 3 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 4-17 | 2 | 3 | 2 | 1 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| 4-18 | 2 | 3 | 3 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1 |
实验结果：
| 实验编号 | P-3效价1(ug/ml) | P-3效价2(ug/ml) |
| 4-1 | 266 | 303 |
| 4-2 | 321 | 332 |
| 4-3 | 255 | 302 |
| 4-4 | 465 | 462 |
| 4-5 | 416 | 419 |
| 4-6 | 124 | 129 |
| 4-7 | 237 | 282 |
| 4-8 | 320 | 326 |
| 4-9 | 170 | 151 |
| 4-10 | 497 | 501 |
| 4-11 | 577 | 598 |
| 4-12 | 380 | 390 |
| 4-13 | 514 | 510 |
| 4-14 | 409 | 415 |
| 4-15 | 636 | 642 |
| 4-16 | 545 | 543 |
| 4-17 | 475 | 483 |
| 4-18 | 571 | 573 |
使用mintab预测田口结果
设置(优化前)：
设置(优化后)：
使用mintab预测田口结果，S/N(信躁比)和标准差明显提升，发酵过程稳定性和抗干扰能力明显提升。均值提升，预期放罐效价值也显著提升。
根据信噪比响应表和均值响应表，对各因子的影响显著性进行分析。
通过信噪比响应分析得到排秩极差为A前体混合，B葡萄糖，E可溶性淀粉，F马铃薯淀粉，C甘油，D果糖，G酵母抽提物。
均值响应的排秩极差为A前体混合，F马铃薯淀粉，G酵母抽提物，H棉籽精粉，E可溶性淀粉，D果糖，C甘油，B葡萄糖。
均值效应分析排列为A前体混合，F马铃薯淀粉，G酵母抽提物，H棉籽精粉，E可溶性淀粉，D果糖，C甘油，B葡萄糖。
按S/N效应排列为A前体混合，B葡萄糖，E可溶性淀粉，F马铃薯淀粉，C甘油，D果糖，G酵母抽提物。
综合分析S/N效应(调节因子)和均值效应(分散度因子)，田口试验最终确定的各项因素最优水平为：A2、B2、C1、D2、E2、F3、G3、H1。
实施例10：培养基中加入前体配比的考察
基于实施例9，在基础培养基中加入前体混合物(总甲硫氨酸0.3％、异亮氨酸0.3％、异丁醇0.3％)在信噪比效应与均值效应中，均显示应加入前体混合物。但部分前体如异丁醇，流补过量对菌体生长会产生抑制作用。进一步对发酵培养过程甲硫氨酸、异亮氨酸、异丁醇每日流补量进行响应面三因素Box-Behnken考察。
上述的因素分别为：1.葡萄糖的补入速度与葡萄糖阻遏反馈的平衡，有必要筛选补料过程速率；2.磷酸戊糖途径产出的赤藓糖-4-磷酸与糖酵解途径产出的磷酸烯醇式丙酮酸结合形成AHBA，有必要结合AHBA前体喂养实验，缬氨酸、异丁醇、甲硫氨酸前体途径进行二次响应面分析；3.逆境状态下，微生物会代谢路径会更加偏向磷酸戊糖途径。
以此为基础筛选甲硫氨酸、异亮氨酸和异丁醇比例，其正交因子如下，
实验设计如下：
| 实验编号 | X水平(％) | Y水平(％) | Z水平(％) | AP-3效价(ug/ml) |
| 5-1 | -1 | -1 | 0 | 368 |
| 5-2 | 1 | -1 | 0 | 472 |
| 5-3 | -1 | 1 | 0 | 386 |
| 5-4 | 1 | 1 | 0 | 650 |
| 5-5 | -1 | 0 | -1 | 398 |
| 5-6 | 1 | 0 | -1 | 652 |
| 5-7 | -1 | 0 | 1 | 344 |
| 5-8 | 1 | 0 | 1 | 490 |
| 5-9 | 0 | -1 | -1 | 392 |
| 5-10 | 0 | 1 | -1 | 502 |
| 5-11 | 0 | -1 | 1 | 306 |
| 5-12 | 0 | 1 | 1 | 380 |
| 5-13 | 0 | 0 | 0 | 524 |
| 5-14 | 0 | 0 | 0 | 550 |
| 5-15 | 0 | 0 | 0 | 532 |
实验分析：根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量(X甲硫氨酸、Y异亮氨酸、Z异丁醇每日流补量)与响应值(AP-3效价(ug/ml))的多元二次回归方程；
AP-3效价(ug/ml)＝103.7+3100X甲硫氨酸(％)+10725Y异亮氨酸(％)+10425Z异丁醇(％)+12083X甲硫氨酸(％)*X甲硫氨酸(％)-177917Y异亮氨酸(％)*Y异亮氨酸(％)-172917Z异丁醇(％)*Z异丁醇(％)+100000X甲硫氨酸(％)*Y异亮氨酸(％)-67500X甲硫氨酸(％)*Z异丁醇(％)-22500Y异亮氨酸(％)*Z异丁醇(％)
各响应变量(X甲硫氨酸、Y异亮氨酸、Z异丁醇每日流补量)与响应值(AP-3效价(ug/ml))关系的显著性，由方差分析表中本设计模型的整体F值为173，P值为0(＜0.05％)，故本模型设计是显著的。
进而对X甲硫氨酸、Y异亮氨酸、Z异丁醇各响应变量，响应变量平方，响应变量双因子交互作用F值与P值进行分析。得出X甲硫氨酸、Y异亮氨酸、Z异丁醇、Y异亮氨酸*Y异亮氨酸、Z异丁醇*Z异丁醇、X甲硫氨酸*Y异亮氨酸、X甲硫氨酸*Z异丁醇之间对模型影响呈显著性。
各响应变量(X甲硫氨酸、Y异亮氨酸、Z异丁醇每日流补量)交互作用等值线图和曲面图分析以及使用mintab多响应预测，模型预测结果见附图2，其中P-3发酵效价(ug/ml)与前体量(％)的等值线图见附图3～5；
本方案具体预测结果为：
实验结论：经过上述流补前体正交实验和数据分析可知，每日流补前体的配比为，甲硫氨酸0.05％，异亮氨酸0.043％，异丁醇0.018％。
Claims (10)
- 一种安丝菌素P-3的发酵方法，其包括发酵培养和自发酵培养起即始的每日流补，所述每日流补所添加的补料按质量体积比包括30～60％葡萄糖及安丝菌素代谢合成前体0.02～0.2％；所述的安丝菌素代谢合成前体包括甲硫氨酸、异亮氨酸和异丁醇。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其中，所述流补前体甲硫氨酸的含量为0.01～0.1％，优选为0.03～0.06％，更优选为0.05％；和/或，所述流补前体异亮氨酸的含量为0.01～0.1％，优选为0.03～0.06％，更优选为0.04～0.05％；和/或，所述流补前体异丁醇的含量为0.01～0.1％，优选为0.01～0.04％，更优选为0.015～0.02％。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其中，所述的发酵培养的培养基按质量体积比包括：速效碳源0.2～5％，缓释碳源0.5～5％，速效氮源0.2～5％，缓释氮源0.5～5％，无机盐0.2～1.5％；和/或，所述的速效碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油或乳糖中的一种或多种；和/或，所述的缓释碳源选自玉米粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、糯米粉或可溶性淀粉中的一种或多种；和/或，所述的速效氮源选自麦芽提取物、酵母提取物或酵母浸粉中的一种或多种；和/或，所述的缓释氮源选自玉米蛋白粉、大豆蛋白粉、棉籽精粉、大豆粉、黄豆饼粉或玉米浆干粉中的一种或多种；和/或，所述的无机盐选自碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或氯化物，优选为碳酸钙、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌和硫酸亚铁。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其中，所述发酵培养的培养基按质量体积比包括：葡萄糖0.1～2％，甘油0.1～2％，果糖0.1～2％，可溶性淀粉0.5～2.5％，马铃薯淀粉0.5～2.5％，酵母抽提物0.1～1％，棉籽精粉0.1～1％，碳酸钙0.1～1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.01～0.1％。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其中，所述发酵培养基的pH为6.5～7.5；和/或，所述发酵培养的温度为25～30℃；和/或，所述的发酵投料后的体积可为0～50000L；和/或，所述的发酵培养周期为12～14天。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其包括以下步骤：a.发酵培养：称取各原料，以重量体积比计为，葡萄糖0.1～2％、果糖0.1～2％、甘油0.1～2％、马铃薯淀粉0.5～2.5％、可溶性淀粉0.5～2.5％、酵母抽提物0.1～1％、棉籽精粉0.1～1％、碳酸钙0.1～1％、磷酸二氢钾0.01～0.1％、硫酸镁0.01～0.1％和硫酸亚铁 0.01～0.1％；发酵罐内加入消泡剂和水，边搅拌边投入原料，用氢氧化钠调节pH至6.8～7.5，灭菌，保温保压；用无菌空气把种子液压入发酵罐，发酵罐于罐温25～30℃培养；b.每日流补：发酵培养开始后即进行每日流补，流补30～60％葡萄糖，维持发酵体系残糖检测0.5％～1％，并流补0.02～0.2％的安丝菌素生物合成前体异丁醇、甲硫氨酸和异亮氨酸；c.放罐：发酵培养12～14天后，发酵结束。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其中，所述发酵培养基按质量提及比包括葡萄糖0.5％，甘油0.8％，果糖0.5％，可溶性淀粉2％，马铃薯淀粉3.2％，酵母抽提物0.8％，棉籽精粉0.4％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钙0.5％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％；和/或，葡萄糖0.5％；甘油3.2％；果糖0.2％；可溶性淀粉2％；马铃薯淀粉3.2％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉0.4％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；硫酸亚铁0.001％；和/或，葡萄糖1.0％；甘油6.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉2.0％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；硫酸亚铁0.001％。
- 培养基在制备安丝菌素P-3中的应用，所述的培养基按质量体积比包括：葡萄糖0.1～2％，甘油0.1～2％，果糖0.1～2％，可溶性淀粉0.5～2.5％，马铃薯淀粉0.5～2.5％，酵母抽提物0.1～1％，棉籽精粉0.1～1％，碳酸钙0.1～1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.01～0.1％。
- 如权利要求8所述的培养基在制备安丝菌素P-3中的应用，所述的培养基按质量体积比包括：葡萄糖0.5％，甘油0.8％，果糖0.5％，可溶性淀粉2％，马铃薯淀粉3.2％，酵母抽提物0.8％，棉籽精粉0.4％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钙0.5％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％；和/或，葡萄糖0.5％；甘油3.2％；果糖0.2％；可溶性淀粉2％；马铃薯淀粉3.2％；酵母抽提物0.5％；棉籽精粉0.4％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；硫酸亚铁0.001％；和/或，葡萄糖1.0％；甘油6.0％；果糖0.5％；可溶性淀粉4.0％；马铃薯淀粉6.0％；酵母抽提物1.0％；棉籽精粉2.0％；碳酸钙0.5％；磷酸二氢钾0.05％；硫酸镁0.05％；硫酸亚铁0.001％。
- 一种如权利要求1所述的安丝菌素P-3的发酵方法，其中，所述流补前体的含量为甲硫氨酸0.05％，异亮氨酸0.043％，异丁醇0.018％。
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