CN110117626A - 一种制备安丝菌素p3的发酵工艺 - Google Patents

一种制备安丝菌素p3的发酵工艺 Download PDF

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CN110117626A CN201810115481.9A CN201810115481A CN110117626A CN 110117626 A CN110117626 A CN 110117626A CN 201810115481 A CN201810115481 A CN 201810115481A CN 110117626 A CN110117626 A CN 110117626A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

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Abstract

本发明涉及一种制备安丝菌素P3的发酵工艺，所述发酵工艺包括以下步骤：(1)将橙色珍贵束丝放线菌菌种进行产孢培养，获得分生孢子；(2)将分生孢子转接液体种子培养基进行培养，获得液体种子；(3)将液体种子接种于液体种子培养基中进行发酵培养，得含有安丝菌素P3的发酵液。

Description

一种制备安丝菌素P3的发酵工艺
技术领域
本发明涉及一种药物生产发酵技术，特别涉及一种用于生产安丝菌素P3同系物的微生物发酵工艺及其相对应的培养基。
背景技术
近年来，抗体偶联药物(ADCs)因其高靶向性、低副作用的特点，逐渐成为抗癌化疗药物研发的热点，此类药物被形象的称之为“生物导弹”。生物导弹的弹头化合物选择要求很高，目前已完成开发成功上市的商品制剂屈指可数，其中，美登素类化合物成为独具优势的明星品种。但由于存在于天然植物中的美登素含量极低，不具备商品开发的可能性，因而必须从其它具有工业化生产潜力的制备渠道中合成美登素或是其替代品。
安丝菌素(Ansamitocin)是一类具有相同母核的大环内酯类同系物的总称。依据其C-3侧链的不同，其种类达二十几种。结构如下式所示：
已知有数种放线菌，如珍贵束丝放线菌、奇迹束丝放线菌等的代谢产物中均能检测到安丝菌素同系物，其中橙色珍贵束丝放线菌 (ATCC 31565)的代谢产物中，就可以检出P2/P3/P4/P4’四种同系物。但从实际生理活性及后期化学修饰的可行性方面考虑，上述组分中安丝菌素P3(Ansamitocin P3)，分子式为C32H43C1N2O9，结构式如下：
是生理活性最接近天然美登素的前体化合物，且相对含量也是四个组分中最高的，因而成为目前该研究领域中最受关注的安丝菌素同系物组分。
当前，该研究领域中普遍采用ATCC 31565及其高产突变株作为研究对象，对发酵生产安丝菌素的工艺或代谢机理进行研究。但已有的文献报道中，两大重要技术指标：目标产物浓度及P3在各同系物中所占比例(以下简称“P3％”)的报道水平参差不齐，且总体水平较低。发酵液中P3浓度方面，文献报道范围为20～200mg/L，P3％为50％～90％。
发明内容
本发明所要解决的问题是为了克服现有发酵工艺(及其相应的培养基)用于发酵生产安丝菌素P3时的产物浓度及P3％均处于较低水平的现状，提供了一种新的发酵工艺，本发明使用新的种子及新的发酵培养基。通过本发明的发酵工艺，可显著提高安丝菌素的发酵水平；尤其是P3％，大大高于所有已发表的文献报道。
本发明利用橙色珍贵束丝放线菌为生产菌，采用优选的制种、发酵控制工艺，并配合相应的培养基配方，从而实现安丝菌素总产素和 P3单一组分占比(P3％)均达到一个较高的水平。发酵液中的安丝菌素浓度达到200～400mg/L水平，其中P3％可达90％以上。
为此，本发明提供一种制备安丝菌素P3的发酵工艺，所述发酵工艺包括以下步骤：
(1)将橙色珍贵束丝放线菌菌种进行产孢培养，获得分生孢子；
(2)将分生孢子转接液体种子培养基进行培养，获得液体种子；
(3)将液体种子接种于液体种子培养基中进行发酵培养，得含有安丝菌素P3的发酵液。
优选的，本发明所述的发酵工艺，步骤如下：
(1)将橙色珍贵束丝放线菌菌种先进行单菌分离并进行产孢培养，获得细胞纯的单菌落及其分生孢子；所述的产孢培养温度为20-40℃；所述的产孢培养时间为5-10天；
(2)将所述的分生孢子进行孵化后，转接液体种子培养基进行培养，获得液体种子；所述的液体种子培养温度为20-40℃；所述的液体种子培养时间为1-4天；
(3)将获得的上述液体种子接种于发酵培养基中进行发酵培养，根据需要结合补料工艺，即得含有安丝菌素P3同系物的发酵液；所述的发酵培养温度为20-40℃；所述的发酵培养周期为5-30天。
其中
其中，步骤(1)中，采用无菌生理盐水对菌种进行稀释后涂布在分离平板进行恒温培养；其中培养基为产孢培养基；所述的产孢培养基包含碳源、氮源、任选的还可含有生长因子或微量元素；所述碳源选自：淀粉、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖；所述氮源选自：牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、硝酸盐、铵盐；所述产孢培养基的pH值在6.0-8.0之间。
优选的，所述碳源选自：可溶性淀粉或糊精；所述可溶性淀粉或糊精的浓度为5-30g/L；所述氮源选自：牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物；所述氮源的浓度为1-3g/L；所述产孢培养基的pH值为6.5-7.5。
其中，
步骤(2)中，所述的分生孢子孵化，是将采集到的分生孢子接入装有合适的液体放线菌培养基的试管中进行静态培养后再对液体种子进行接种；其中，所述的液体放线菌培养基可为该领域常用的放线菌培养基为标准链霉菌培养基ISP2液体剂型；所述的孵化培养温度为 20-40℃；所述的孵化培养时间为24-48小时。步骤(2)中，所述的液体种子培养方法为恒温振荡培养；所述的温度为22-30℃，所述的振荡转速为200-250rpm；所述的培养周期，为1-3天。
步骤(2)中，所述的液体种子培养方法为恒温振荡培养；所述液体种子培养基，包含碳源、氮源、矿物质或微量元素；其中所述碳源选自：淀粉、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、甘油；所述氮源选自：黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨；所述矿物质为碳酸钙；所述液体种子培养基的pH值在6.0-8.0之间。
优选的，其中所述碳源选自：可溶性淀粉、葡萄糖，可溶性淀粉的浓度为20-50g/L，葡萄糖浓度为0-30g/L；所述氮源选自：黄豆饼粉、玉米浆和蛋白胨，其中，黄豆饼粉浓度为5-30g/L，玉米浆浓度为 5-30g/L，蛋白胨浓度为0-10g/L；所述碳酸钙浓度为0-5g/L；所述液体种子培养基的pH值6.5-7.5。
其中，
步骤(3)中，所述的液体种子接种于发酵培养基的接种量为5％-15％，所述的发酵培养温度为22-30℃，所述的发酵培养周期，如结合补料工艺，为10-15天。
步骤(3)中，所述的补料工艺是指将含有碳源、氮源以及P3前体物质的补料液加入到正在运行的发酵液中；所述的碳源为糖类或淀粉水解产物；所述的氮源为选自：黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉；所述的P3前体物质为异丁醇；
步骤(3)中，所述的含有安丝菌素P3同系物的发酵液的分离纯化方法为，以有机溶剂与发酵液进行充分混合后再离心或过滤进行固液分离，取上清液或滤液，再通过常规纯化手段进行纯化。
步骤(3)中，所述将液体种子接种于液体种子培养基中进行发酵培养，其中所述的发酵培养基包含碳源、氮源、矿物质或微量元素，以及产物合成所必需的前体物质；所述碳源选自：淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖、甘油；所述氮源选自：棉籽饼粉、黄豆饼粉、酵母提取物、玉米浆；所述矿物质或微量元素为氯化钙，所述产物合成所必需的前体物质为异丁醇，所述的发酵培养基的pH值为6-8。
优选的，所述碳源选自：麦芽糖、麦芽糊精，所述的麦芽糖浓度为 20-40g/L；所述的麦芽糊精浓度为20-40g/L；所述氮源选自：棉籽饼粉、酵母提取物和玉米浆，所述棉籽饼粉的浓度为10-30g/L，酵母提取物浓度为0-10g/L，玉米浆浓度为0-10g/L，且酵母提取物和玉米浆浓度不同时为零；所述矿物质或微量元素为氯化钙，浓度为0-15g/L；所述产物合成所必需的前体物质为异丁醇，其浓度为 0-20g/L；所述的发酵培养基的pH值为6.5-7.5。
本发明最优选的发酵工艺，步骤如下：
单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2；
孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化24-48 小时，所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10 g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2；
一级摇瓶种培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有 50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃，220rpm 振荡培养48小时，所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L；pH7.2±0.2；
二级摇瓶种培养：将上述的一级摇瓶种，按5％接种量接种装有125mL 液体种子培养基的500mL三角瓶中，在摇床上26℃，200rpm振荡培养48小时，所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖 20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L；pH7.2±0.2；
主发酵：将前述的培养完成的液体种子以10％接种量转接入装有6L T3 培养基(已灭菌)的10L发酵罐中，采用火圈法接种；发酵起始pH7.2，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.8-1.2kg/cm2；全程 pH自然，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等手段保证DO水平不低于30％，所述的T3培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物10g/L；玉米浆10g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L；
补料：发酵运行至48小时启动补料。补料含80g/L的麦芽糊精，120g/L 的棉籽饼粉及4g/L异丁醇。补料方式为蠕动泵恒速补入，速率设定为每天200mL。
本发明提供了一种利用橙色珍贵束丝放线菌发酵生产安丝菌素的产孢培养基，所述的产孢培养基包含碳源、氮源、生长因子或微量元素。所述的产孢培养基中，所述碳源包括淀粉、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖等常见发酵用碳源；较佳的为可溶性淀粉或糊精；所述可溶性淀粉或糊精的浓度为5-30g/L；较佳的为10-15g/L。所述的产孢培养基中，所述氮源包括牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、各种硝酸盐、铵盐等有机和无机氮源；较佳的为牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物等有机氮源；所述有机氮源的浓度为1-3g/L。所述产孢培养基应在配制完成后用本领域常用酸碱调节剂调节pH值在6.0-8.0之间；较佳的为6.5-7.5。
本发明还提供了一种利用橙色珍贵束丝放线菌发酵生产安丝菌素的种子培养基，所述的种子培养基包含碳源、氮源、矿物质或微量元素。所述的种子培养基中，碳源为淀粉、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、甘油等常见发酵碳源；较佳的为可溶性淀粉、葡萄糖。所述可溶性淀粉的浓度为20-50g/L，葡萄糖浓度为0-30g/L。所述的种子培养基中，氮源为本领域各种常见的有机氮源或无机氮源；所述的有机氮源包含黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨等；较佳的为黄豆饼粉、玉米浆和蛋白胨。其中，黄豆饼粉浓度为5-30g/L，玉米浆浓度为5-30g/L，蛋白胨浓度为0-10g/L。所述的种子培养基中，所述矿物质为碳酸钙；所述碳酸钙浓度为0-5g/L。所述种子培养基应在配制完成后用本领域常用酸碱调节剂调节pH值在6.0-8.0之间；较佳的为6.5-7.5。
本发明还提供了一种利用橙色珍贵束丝放线菌发酵生产安丝菌素的发酵培养基，所述的发酵培养基包含碳源、氮源、矿物质或微量元素，以及产物合成所必需的前体物质。所述的发酵培养基中，所述碳源包含淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖、甘油等本领域常见发酵用碳源；较佳的为麦芽糖、麦芽糊精。所述的麦芽糖浓度为20-40g/L；所述的麦芽糊精浓度为20-40g/L。所述的发酵培养基中，所述氮源包含棉籽饼粉、黄豆饼粉、酵母提取物、玉米浆等常用有机氮源；较优的为棉籽饼粉、酵母提取物和玉米浆。所述棉籽饼粉的浓度为 10-30g/L，酵母提取物浓度为0-10g/L，玉米浆浓度为0-10g/L，且酵母提取物和玉米浆浓度不同时为零。所述的发酵培养基中，所述矿物质或微量元素包含本领域常见的缓冲盐，较优的为氯化钙，浓度为0-15g/L。所述的发酵培养基中，所述产物合成所必需的前体物质为异丁醇，其浓度为0-20g/L，较优的为0-10g/L。所述的发酵培养基的pH值，应采用本领域常见的酸碱调节剂调节为6-8，较优的为 6.5-7.5。
上述各优选条件按实际需要进行组合后，可得本发明的各较佳实施例。
本发明的有益效果在于：
本发明在制种流程中创造性的提出了静态孵化工艺，使得后续的主发酵阶段可获得高质量种子，结合本发明所提供的培养基和发酵控制工艺，使得安丝菌素同系物表达量超过绝大多数已报道文献，达到 200-400mg/L水平，其中，主产物安丝菌素P3单组分所占比例 (P3％)高达90％以上，高于所有文献报道水平，极大提高了后期获得P3纯品的提取收率。
以下为本发明和现有技术在各项指标上的比较数据：
以上数据显示，本发明在各项技术指标上优于现有技术。
附图说明
图1是典型发酵液HPLC分析图谱；
图2是实施例4的发酵液HPLC分析图谱；
图3是实施例5的产素曲线；
图4是实施例5所得安丝菌素P3组分的高精度质谱检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实例和附图，进一步说明本发明内容。
实施例1
1.单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。
其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2。
2.孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化 24-48小时。
所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2。
3.摇瓶种子培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃， 220rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L；pH7.2 ±0.2。
4.摇瓶发酵：将前述的培养完成的液体种子以5-10％接种量转接入装有30mLY3YM培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃，220 rpm振荡培养7-10天。
所述的Y3YM培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物5g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L；pH7.5 ±0.2。
5.产物检测：取适量发酵液，与等体积的甲醇、乙醇、正丙醇等常用有机溶媒混合，浸泡2小时，摇匀后10000rpm离心2-5分钟，取上清液送HPLC检测。
HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(填料粒径3.5μm)；柱温 30℃；检测波长254nm；进样量5μL；流动相——乙腈:水＝63:37；流速0.8mL/min；检测时长25-30分钟。
本实施例中，测得的摇瓶发酵水平为：发酵10天放瓶，安丝菌素各同系物(P2/P3/P3’/P4/P4’)总浓度250ppm，P3％(P3单组份所占比例)≥97％。该产物浓度水平高于大多数已知的文献报道，其中，P3％更是远高于所有文献报道水平。
实施例2
1.单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。
其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2。
2.孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化 24-48小时。
所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2。
3.摇瓶种子培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃， 220rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L； pH7.2±0.2。
4.摇瓶发酵：将前述的培养完成的液体种子以5-10％接种量转接入装有30mL T3培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃，220 rpm振荡培养7-10天。
所述的T3培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物10g/L；玉米浆10g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L。
5.产物检测：取适量发酵液，与等体积的甲醇、乙醇、正丙醇等常用有机溶媒混合，浸泡2小时，摇匀后10000rpm离心2-5分钟，取上清液送HPLC检测。
HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(填料粒径3.5μm)；柱温 30℃；检测波长254nm；进样量5μL；流动相——乙腈:水＝63:37；流速0.8mL/min；检测时长25-30分钟。
本实施例中，测得的摇瓶发酵水平为：发酵10天放瓶，安丝菌素各同系物(P2/P3/P3’/P4/P4’)总浓度330ppm，P3％(P3单组份所占比例)≥97％。该产物浓度水平高于大多数已知的文献报道，其中，P3％更是远高于所有文献报道水平。
实施例3
1.单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。
其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2。
2.孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化 24-48小时。
所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2。
3.一级摇瓶种培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃， 220rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L； pH7.2±0.2。
4.二级摇瓶种培养：将上述的一级摇瓶种，按5％接种量接种装有125mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在摇床上26℃，200 rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L； pH7.2±0.2。
5.主发酵：将前述的培养完成的液体种子以10％接种量转接入装有6L Y3YM培养基(已灭菌)的10L发酵罐中，采用火圈法接种；发酵起始pH7.2，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.8-1.2 kg/cm2；全程pH自然，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等手段保证DO水平不低于30％。
所述的Y3YM培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物5g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L。
6.产物检测：罐上发酵每24小时取样检测产物含量及其他与发酵有关的生化指标。产物浓度检测方法是：取适量发酵液，与等体积的甲醇、乙醇、正丙醇等常用有机溶媒混合，浸泡2小时，摇匀后 10000rpm离心2-5分钟，取上清液送HPLC检测。
HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(填料粒径3.5μm)；柱温 30℃；检测波长254nm；进样量5μL；流动相——乙腈:水＝63:37；流速0.8mL/min；检测时长25-30分钟。
残糖检测采用DNS法；总氮检测采用凯氏定氮法。
本实施例中，测得的发酵水平为：发酵11天放罐，安丝菌素各同系物(P2/P3/P3’/P4/P4’)总浓度240ppm，P3％(P3单组份所占比例)≥93.5％。该产物浓度水平高于大多数已知的文献报道，其中，P3％更是远高于所有文献报道的罐上发酵水平。
实施例4
1.单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。
其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2。
2.孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化 24-48小时。
所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2。
3.一级摇瓶种培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃， 220rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L； pH7.2±0.2。
4.二级摇瓶种培养：将上述的一级摇瓶种，按5％接种量接种装有125mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在摇床上26℃，200 rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L；pH7.2±0.2。
5.主发酵：将前述的培养完成的液体种子以10％接种量转接入装有6L T3培养基(已灭菌)的10L发酵罐中，采用火圈法接种；发酵起始pH7.2，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.8-1.2 kg/cm2；全程pH自然，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等手段保证DO水平不低于30％。
所述的T3培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物10g/L；玉米浆10g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L。
6.产物检测：罐上发酵每24小时取样检测产物含量及其他与发酵有关的生化指标。产物浓度检测方法是：取适量发酵液，与等体积的甲醇、乙醇、正丙醇等常用有机溶媒混合，浸泡2小时，摇匀后 10000rpm离心2-5分钟，取上清液送HPLC检测。
HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(填料粒径3.5μm)；柱温 30℃；检测波长254nm；进样量5μL；流动相——乙腈:水＝63:37；流速0.8mL/min；检测时长25-30分钟。
残糖检测采用DNS法；总氮检测采用凯氏定氮法。
本实施例中，测得的发酵水平为：发酵11天放罐，安丝菌素各同系物(P2/P3/P3’/P4/P4’)总浓度280ppm，P3％(P3单组份所占比例)≥90％。该产物浓度水平高于大多数已知的文献报道，其中，P3％也高于大多数文献报道的罐上发酵水平。
实施例5
1.单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。
其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2。
2.孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化 24-48小时。
所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2。
3.一级摇瓶种培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃， 220rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L； pH7.2±0.2。
4.二级摇瓶种培养：将上述的一级摇瓶种，按5％接种量接种装有125mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在摇床上26℃，200 rpm振荡培养48小时。
所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L； pH7.2±0.2。
5.主发酵：将前述的培养完成的液体种子以10％接种量转接入装有6L T3培养基(已灭菌)的10L发酵罐中，采用火圈法接种；发酵起始pH7.2，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.8-1.2 kg/cm2；全程pH自然，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等手段保证DO水平不低于30％。
所述的T3培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物10g/L；玉米浆10g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L。
6.补料：发酵运行至48小时启动补料。补料含80g/L的麦芽糊精，120g/L的棉籽饼粉及4g/L异丁醇。补料方式为蠕动泵恒速补入，速率设定为每天200mL。
7.产物检测：罐上发酵每24小时取样检测产物含量及其他与发酵有关的生化指标。产物浓度检测方法是：取适量发酵液，与等体积的甲醇、乙醇、正丙醇等常用有机溶媒混合，浸泡2小时，摇匀后 10000rpm离心2-5分钟，取上清液送HPLC检测。
HPLC检测条件为：C18反相色谱柱(填料粒径3.5μm)；柱温 30℃；检测波长254nm；进样量5μL；流动相——乙腈:水＝63:37；流速0.8mL/min；检测时长25-30分钟。
残糖检测采用DNS法；总氮检测采用凯氏定氮法。
本实施例中，测得的发酵水平为：发酵培养13天，安丝菌素各同系物(P2/P3/P3’/P4/P4’)总浓度453ppm，P3％(P3单组份所占比例)≥96％。该产物浓度水平高于绝大多数已知的文献报道，其中，P3％更是远高于所有文献报道的罐上发酵水平。

Claims (10)

1.一种制备安丝菌素P3的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将橙色珍贵束丝放线菌菌种先进行单菌分离并进行产孢培养，获得细胞纯的单菌落及其分生孢子；所述的产孢培养温度为20-40℃；所述的产孢培养时间为5-10天；
(2)将所述的分生孢子进行孵化后，转接液体种子培养基进行培养，获得液体种子；所述的液体种子培养温度为20-40℃；所述的液体种子培养时间为1-4天；
(3)将获得的上述液体种子接种于发酵培养基中进行发酵培养，根据需要结合补料工艺，即得含有安丝菌素P3同系物的发酵液；所述的发酵培养温度为20-40℃；所述的发酵培养周期为5-30天。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，
步骤(2)中，所述的分生孢子孵化，是将采集到的分生孢子接入装有合适的液体放线菌培养基的试管中进行静态培养后再对液体种子进行接种；其中，所述的液体放线菌培养基可为该领域常用的放线菌培养基为标准链霉菌培养基ISP2液体剂型；所述的孵化培养温度为20-40℃；所述的孵化培养时间为24-48小时。
步骤(2)中，所述的液体种子培养方法为恒温振荡培养；所述的温度为22-30℃，所述的振荡转速为200-250rpm；所述的培养周期，为1-3天。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，
步骤(3)中，所述的液体种子接种于发酵培养基的接种量为5％-15％，所述的发酵培养温度为22-30℃，所述的发酵培养周期，如结合补料工艺，为10-15天。
步骤(3)中，所述的补料工艺是指将含有碳源、氮源以及P3前体物质的补料液加入到正在运行的发酵液中；所述的碳源为糖类或淀粉水解产物；所述的氮源为选自：黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉；所述的P3前体物质为异丁醇；
步骤(3)中，所述的含有安丝菌素P3同系物的发酵液的分离纯化方法为，以有机溶剂与发酵液进行充分混合后再离心或过滤进行固液分离，取上清液或滤液，再通过常规纯化手段进行纯化。
4.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，采用无菌生理盐水对菌种进行稀释后涂布在分离平板进行恒温培养；其中培养基为产孢培养基；所述的产孢培养基包含碳源、氮源、任选的还可含有生长因子或微量元素；所述碳源选自：淀粉、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖；所述氮源选自：牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、硝酸盐、铵盐；所述产孢培养基的pH值在6.0-8.0之间。
5.根据权利要求4所述的发酵工艺，其特征在于，其中，所述碳源选自：可溶性淀粉或糊精；所述可溶性淀粉或糊精的浓度为5-30g/L；所述氮源选自：牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物；所述氮源的浓度为1-3g/L；所述产孢培养基的pH值为6.5-7.5。
6.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述的液体种子培养方法为恒温振荡培养；所述液体种子培养基，包含碳源、氮源、矿物质或微量元素；其中所述碳源选自：淀粉、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、甘油；所述氮源选自：黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨；所述矿物质为碳酸钙；所述液体种子培养基的pH值在6.0-8.0之间。
7.根据权利要求6所述的发酵工艺，其特征在于，
其中所述碳源选自：可溶性淀粉、葡萄糖，可溶性淀粉的浓度为20-50g/L，葡萄糖浓度为0-30g/L；所述氮源选自：黄豆饼粉、玉米浆和蛋白胨，其中，黄豆饼粉浓度为5-30g/L，玉米浆浓度为5-30g/L，蛋白胨浓度为0-10g/L；所述碳酸钙浓度为0-5g/L；所述液体种子培养基的pH值6.5-7.5。
8.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述将液体种子接种于液体种子培养基中进行发酵培养，其中所述的发酵培养基包含碳源、氮源、矿物质或微量元素，以及产物合成所必需的前体物质；所述碳源选自：淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖、甘油；所述氮源选自：棉籽饼粉、黄豆饼粉、酵母提取物、玉米浆；所述矿物质或微量元素为氯化钙，所述产物合成所必需的前体物质为异丁醇，所述的发酵培养基的pH值为6-8。
9.根据权利要求8所述的发酵工艺，其特征在于，所述碳源选自：麦芽糖、麦芽糊精，所述的麦芽糖浓度为20-40g/L；所述的麦芽糊精浓度为20-40g/L；所述氮源选自：棉籽饼粉、酵母提取物和玉米浆，所述棉籽饼粉的浓度为10-30g/L，酵母提取物浓度为0-10g/L，玉米浆浓度为0-10g/L，且酵母提取物和玉米浆浓度不同时为零；所述矿物质或微量元素为氯化钙，浓度为0-15g/L；所述产物合成所必需的前体物质为异丁醇，其浓度为0-20g/L；所述的发酵培养基的pH值为6.5-7.5。
10.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤如下：
单菌分离和产孢培养：取橙色珍贵束丝放线菌ATCC 31565或其同谱系衍生菌株的甘油保藏管，以无菌生理盐水进行梯度稀释后，取适当浓度的细胞悬液在产孢培养基平板上进行涂布；将所述的涂布菌悬液的产孢平板放置于26℃恒温培养箱中培养8-10天。其中，产孢培养基配方为：可溶性淀粉10g/L；酵母提取物1.5g/L；琼脂粉15g/L；pH7.2±0.2；
孢子孵化：上述产孢平板上长出菌落并产生分生孢子后，收集所产孢子，转入装有适量ISP2培养基的孵化试管中，26℃静置孵化24-48小时，所述的ISP2培养基配方为：酵母提取物4g/L；麦芽提取物10g/L；葡萄糖4g/L；pH7.2±0.2；
一级摇瓶种培养：将上述的经过孵化培养的孢子悬液，全部转入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在摇床上26℃，220rpm振荡培养48小时，所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L；pH7.2±0.2；
二级摇瓶种培养：将上述的一级摇瓶种，按5％接种量接种装有125mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，在摇床上26℃，200rpm振荡培养48小时，所述的液体种子配方为：可溶性淀粉30g/L；葡萄糖20g/L；黄豆饼粉10g/L；玉米浆10g/L；大豆蛋白胨5g/L；碳酸钙5g/L；pH7.2±0.2；
主发酵：将前述的培养完成的液体种子以10％接种量转接入装有6L T3培养基(已灭菌)的10L发酵罐中，采用火圈法接种；发酵起始pH7.2，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.8-1.2kg/cm2；全程pH自然，通过调节通气量、搅拌转速、罐压等手段保证DO水平不低于30％，所述的T3培养基配方为：麦芽糖25g/L；糊精30g/L；棉籽饼粉30g/L；酵母提取物10g/L；玉米浆10g/L；氯化钙10g/L；异丁醇4g/L；
补料：发酵运行至48小时启动补料。补料含80g/L的麦芽糊精，120g/L的棉籽饼粉及4g/L异丁醇。补料方式为蠕动泵恒速补入，速率设定为每天200mL。
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