CN101948826B - 一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，属于微生物菌种筛选领域；通过对除虫链霉菌孢子悬液紫外线诱变后，经过含甲硫氨酸的液体培养基对耐受菌株的进行富集，再进行甲硫氨酸固体平板耐受菌株筛选的结合，然后通过初筛、复筛和遗传稳定性考察，筛选出比出发菌株摇瓶能力提高的菌株，为除虫链霉菌菌种筛选提供可行方法。本发明筛选出的除虫链霉菌菌株摇瓶生产能力提高幅度大，遗传稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌株筛选技术领域，具体是一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法。
背景技术
阿维菌素(avermectins，AVM)是由除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的十六元环内酯类多组份抗生素，按其分子中C-5、C22-23、C26三个位置上的结构差异性可区分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b 8种组份。其中以B1组份，特别是B1a的抗线虫、节肢动物活性最高，而被广泛用于家畜寄生虫感染的治疗和农业虫害防治，成为农牧业的重要抗生素。阿维菌素分为8个活性组分，只有B1a和B1b可以做药用，尤以B1a活性最高。阿维菌素合成代谢中C5-氧甲基化酶催化“B”组份成为“A”组份，使得甲基转移到“B”组份C5羟基上而成为A组份。S-腺苷甲硫氨酸是阿维菌素A组分C5位甲基的来源，通过筛选耐受甲硫氨酸能力强的菌株，提高代谢过程中甲硫氨酸的利用能力，减少甲硫氨酸参与菌体内S-腺苷甲硫氨酸的合成，进而减少了阿维菌素A组分的生物合成，提高了B组分的含量。以液体培养进行耐受性菌株的富集，再通过固体平板分离纯化进行耐受性菌株筛选，通过动态和静态筛选的结合，提高阿维菌素耐受甲硫氨酸的筛选效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，解决现有的菌种选育中大工作量且缺乏定向性的问题。
本发明的技术方案为：
一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，包括以下步骤：
(1)、取生长好的除虫链霉菌斜面一支，作为出发菌种，向内加入适量纯化水，将除虫链霉菌斜面上的孢子刮下得孢子液，将孢子液中的孢子链打碎、过滤得除虫链霉菌单孢子悬液一；
(2)、将除虫链霉菌单孢子悬液一置于紫外线灯下经照射进行诱变处理，然后接入含2-3％甲硫氨酸的液体培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养4-6天，富集耐受2-3％甲硫氨酸的菌株；
(3)、将耐受2-3％甲硫氨酸的菌株接入斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，然后从斜面培养基中取一支成熟斜面，向内加入适量纯化水，轻轻将成熟斜面上的孢子刮下，然后将孢子链打碎后过滤得耐受2-3％甲硫氨酸的除虫链霉菌单孢子悬液二；吸取除虫链霉菌单孢子悬液二稀释成10-4，10-5，10-6梯度浓度，然后分别吸取稀释后的10-4，10-5，10-6梯度浓度的除虫链霉菌单孢子悬液二0.18-0.22ml分别涂在含2-3％甲硫氨酸的平板上，在含2-3％甲硫氨酸的平板培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养5-8天；
(4)、从涂过稀释过的除虫链霉菌单孢子悬液二的上述平板上中选取菌落密度适宜、菌落形态好的平板，从此平板上挑取单菌落接种至斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，然后从培养好的斜面培养基上挖下0.8-0.12cm2的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出效价比出发菌种效价高的菌株；
(5)、将步骤4挑选的效价较高的菌株接种至斜面培养基在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，再从培养好的斜面培养基上挖下0.8-0.12cm2的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出效价比出发菌种效价高的菌株；
(6)、将步骤5挑选的效价较高的菌株进行遗传稳定性考察：即通过斜面培养基进行传代培养，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，从得到的各子代斜面上挖下0.8-0.12cm2的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出遗传稳定性较好的菌株即菌种经斜面传代，各子代斜面的效价之间差异较小。
所述的含2-3％甲硫氨酸的液体培养基中的重量配比为：可溶性淀粉0.4％，酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％，氯化钴0.002％，甲硫氨酸2-3％，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
所述的斜面培养基的重量配比为：葡萄糖1.5％，牛肉浸膏0.3％，天门冬氨酸0.05％，磷酸氢二钾0.05％，琼脂1.8％，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
所述的含2-3％甲硫氨酸的平板培养基的重量配比为：可溶性淀粉0.4％，酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％，氯化钴0.002％，琼脂1.8％，2-3％甲硫氨酸，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
所述的种子培养基的重量配比为：玉米淀粉2.5％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，酵母粉1.0％，氯化钴0.003％，其余为纯化水，调PH值为6.8-7.0。
所述的发酵培养基的重量配比为：玉米淀粉14％，淀粉酶0.003％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉1.0％，氯化钴0.003％，硫酸锰0.0024％，钼酸钠0.0023％，轻质碳酸钙0.1％，其余为纯化水，调PH值为7.4-7.6。
所述的诱变处理是将除虫链霉菌单孢子悬液置于30W紫外线灯下，照射距离控制在30-40cm照射30-60S进行诱变处理。
所述的摇瓶培养时摇瓶的转速为210-230rpm。
本发明提供一种效率高、操作简便的耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，本发明通过对除虫链霉菌孢子悬液紫外线诱变后，经过3％甲硫氨酸液体培养基耐受菌株的富集，再进行甲硫氨酸固体平板耐受菌株筛选的结合，然后通过初筛、复筛和稳定性考察，筛选出比出发菌株摇瓶能力提高的菌株。在正常的发酵条件下，筛选到的菌株产阿维菌素的能力比出发菌株高出10-13％，经斜面传代培养考察稳定性：四代与原种、二代、三代摇瓶生产能力差异在5％以内，而出发菌株四代摇瓶生产能力只有原种的90％以下，证明了本发明筛选出的除虫链霉菌菌株摇瓶生产能力提高幅度大，遗传稳定性好。
具体实施方式
配制培养基：
含3％甲硫氨酸的液体培养基中的重量配比为：可溶性淀粉0.4％，酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％，氯化钴0.002％，甲硫氨酸3％，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
斜面培养基的重量配比为：葡萄糖1.5％，牛肉浸膏0.3％，天门冬氨酸0.05％，磷酸氢二钾0.05％，琼脂1.8％，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
含3％甲硫氨酸的平板培养基的重量配比为：可溶性淀粉0.4％，酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％，氯化钴0.002％，琼脂1.8％，3％甲硫氨酸，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
种子培养基的重量配比为：玉米淀粉2.5％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，酵母粉1.0％，氯化钴0.003％，其余为纯化水，调PH值为6.8-7.0。
发酵培养基的重量配比为：玉米淀粉14％，淀粉酶0.003％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉1.0％，氯化钴0.003％，硫酸锰0.0024％，钼酸钠0.0023％，轻质碳酸钙0.1％，其余为纯化水，调PH值为7.4-7.6。
菌种：除虫链霉菌菌种AV-4、AV-21、AV-36，由浙江工业大学提供。
耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法：
实施例1
(1)、取生长好的除虫链霉菌菌种AV-4的斜面一支作为出发菌种，向内加入适量纯化水，轻轻将其孢子刮下得孢子液，将孢子液吸入装有少量玻璃珠的三角烧瓶内，振荡10-15min将孢子链打碎后过滤得除虫链霉菌单孢子悬液一；
(2)、将除虫链霉菌单孢子悬液置于30W紫外线灯下照射30S，将孢子液接入含3％甲硫氨酸的液体培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养6天，富集耐受3％甲硫氨酸的菌株；
(3)、将富集的耐受3％甲硫氨酸的菌株接入斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养9天，然后从斜面培养基中取一支成熟斜面，向内加入10ml纯化水，轻轻将成熟斜面上的孢子刮下，经玻璃珠打碎后过滤得耐受3％甲硫氨酸的除虫链霉菌单孢子悬液二，除虫链霉菌单孢子悬液二的浓度计为原孢子悬液浓度的10-1，吸取耐受3％甲硫氨酸的除虫链霉菌单孢子悬液1ml，加入9ml纯化水，得10-2浓度的孢子液，以此类推将耐受3％甲硫氨酸的除虫链霉菌单孢子悬液分别稀释至10-5，10-6，10-7，分别吸取10-5，10-6，10-7的孢子液0.2ml各自涂在含3％甲硫氨酸的平板上，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养8天；
(4)、从涂过稀释过的除虫链霉菌单孢子悬液二的含2-3％甲硫氨酸的平板上选取菌落密度适宜、菌落形态好的平板，根据菌落形态、大小和颜色挑取46个单菌落接种至斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养9天，进行摇瓶初筛；摇瓶初筛方法：从培养好的斜面培养基上挖下长有菌苔的琼脂块1cm2接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％、转速220rpm条件下培养260h，然后测定效价，与出发菌种比较，有7株效价较高的菌株；
(5)、将7株效价较高的菌株进行菌种保藏，同时接种至斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养9天，进行摇瓶复筛；摇瓶复筛方法同摇瓶初筛方法一致，通过两轮复筛，与出发菌种比较，有2株效价较高的菌株，最高增幅为11.6％；
(6)、将2株效价较高的菌株进行遗传稳定性考察，即将2株效价较高的菌株接种至斜面培养基上传代培养，获得F2、F3、F4代的传代斜面，即将2株效价较高的菌株在27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养9天，然后选取培养好的斜面F1代重复进行培养得到F2、F3、F4代的传代斜面，从得到的培养好的各子代斜面上挖下长有菌苔的琼脂块1cm2接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％、转速220rpm条件下培养28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％、转速220rpm条件下培养260h，测定效价F3，F4代效价基本无差异。
一、阿维菌素效价测定：
阿维菌素含量测定采用HPLC方法；
色谱柱：C18反相柱，4.6×200mm；流动相：甲醇/水＝88/12；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：245nm；
对照溶液配制：精确称取20mg B1a含量已知的阿维菌素样品作为对照品，液相色谱级甲醇溶解并定容至100ml，放置冰箱中冷藏保存备用，保存期1个月；
分析方法：精确取发酵液1ml，加入5ml甲醇，充分振荡20min，离心取上清，稀释约至对照效价，使用0.45um微孔滤膜过滤后检测；
样品效价＝样品B1a组分面积/对照溶液B1a组分面积*对照溶液浓度*对照溶液中B1a的含量*1000*样品稀释倍数。
二、平板耐甲硫氨酸的菌种筛选：
阿维菌素出发菌种的孢子在3％浓度的甲硫氨酸平板上几乎不长，经过紫外诱变，加入到3％甲硫氨酸的液体培养基中富集培养，传斜面后生长的的孢子在3％的平板上能够生长，但代谢偏慢，根据菌落形态、大小和颜色挑取46个单菌落进行斜面培养；
三、耐甲硫氨酸的菌种生产能力考察：
对46支单孢斜面进行摇瓶发酵能力考察：以出发菌种AV-4为对照，结果见下表1，46支中有7支高于对照，最高效价5187u/ml，提高率为11.6％。
表1：耐甲硫氨酸的菌株摇瓶初筛结果
将初筛中的7支效价较高菌株进行菌种保藏，同时接种至斜面培养基进行复筛，复筛结果见下表2，7支中有2支高于对照；
表2耐甲硫氨酸的菌株摇瓶复筛结果
四、AVm1-16和AVm1-38传代稳定性考察：
将AVm1-16、AVm1-38和出发菌种进行斜面传代，得到的各子代斜面与相应的代数的出发菌种斜面进行摇瓶发酵能力考察，结果见下表3，经过4代考察，两菌株其F4代与F1摇瓶发酵能力相比没有明显的下降趋势，而出发菌种的F4代与F1代比较明显下降，说明本方法筛选的菌株其有较好的遗传稳定性。
表3耐甲硫氨酸的菌株与出发菌种遗传稳定性考察
实施例2
采用与实施例1完全相同的步骤，只是将出发菌种AV-4菌种替换为AV-21。
实施例2对46支单孢斜面进行摇瓶发酵能力考察。以出发菌种AV-21为对照，结果见下表4，46支中有6支高于对照，最高效价5058u/ml，提高率为10.2％。
表4耐甲硫氨酸的菌株摇瓶初筛结果
将初筛中的6支效价较高菌株进行菌种保藏，同时接种至斜面培养基进行复筛，复筛结果见下表5，6支中有3支高于对照。
表5耐甲硫氨酸的菌株摇瓶复筛结果
将AVm2-3、AVm2-4、AVm2-22和出发菌种进行斜面传代，得到的各子代斜面与相应的代数的出发菌种斜面进行摇瓶发酵能力考察，
表6耐甲硫氨酸的菌株与出发菌种遗传稳定性考察
实施例3
采用与实施例1完全相同的步骤，只是将出发菌种AV-4菌种替换为AV-36。
实施例3对46支单孢斜面进行摇瓶发酵能力考察。以出发菌种AV-36为对照，结果见下表7，46支中有3支高于对照，最高效价5348u/ml，提高率为12.3％。
表7耐甲硫氨酸的菌株摇瓶初筛结果
将初筛中的3支效价较高菌株进行菌种保藏，同时接种至斜面培养基进行复筛，复筛结果见下表8，3支中有1支高于对照。
表8耐甲硫氨酸的菌株摇瓶复筛结果
将AVm3-6和出发菌种进行斜面传代，得到的各子代斜面与相应的代数的出发菌种斜面进行摇瓶发酵能力考察，
表9耐甲硫氨酸的菌株与出发菌种遗传稳定性考察
Claims (8)
1.一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、取生长好的除虫链霉菌斜面一支，作为出发菌种，向内加入适量纯化水，将除虫链霉菌斜面上的孢子刮下得孢子液，将孢子液中的孢子链打碎、过滤得除虫链霉菌单孢子悬液一；
(2)、将除虫链霉菌单孢子悬液一置于紫外线灯下经照射进行诱变处理，然后接入含2-3％甲硫氨酸的液体培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养4-6天，富集耐受2-3％甲硫氨酸的菌株；
(3)、将耐受2-3％甲硫氨酸的菌株接入斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，然后从斜面培养基中取一支成熟斜面，向内加入适量纯化水，轻轻将成熟斜面上的孢子刮下，然后将孢子链打碎后过滤得耐受2-3％甲硫氨酸的除虫链霉菌单孢子悬液二；吸取除虫链霉菌单孢子悬液二稀释成10-4，10-5，10-6梯度浓度，然后分别吸取稀释后的10-4，10-5，10-6梯度浓度的除虫链霉菌单孢子悬液二0.18-0.22ml分别涂在含2-3％甲硫氨酸的平板上，在含2-3％甲硫氨酸的平板培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养5-8天；
(4)、从涂过稀释过的除虫链霉菌单孢子悬液二的上述平板上中选取菌落密度适宜、菌落形态好的平板，从此平板上挑取单菌落接种至斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，然后从培养好的斜面培养基上挖下0.8-0.12cm2的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出效价比出发菌种效价高的菌株；
(5)、将步骤4挑选的效价较高的菌株接种至斜面培养基在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，再从培养好的斜面培养基上挖下0.8-0.12cm2的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出效价比出发菌种效价高的菌株；
(6)、将步骤5挑选的效价较高的菌株进行遗传稳定性考察：即通过斜面培养基进行传代培养，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，从得到的各子代斜面上挖下0.8-0.12cm2的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出遗传稳定性较好的菌株即菌种经斜面传代，各子代斜面的效价之间差异较小。
2.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的含2-3％甲硫氨酸的液体培养基中的重量配比为：可溶性淀粉0.4％，酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％，氯化钴0.002％，甲硫氨酸2-3％，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的斜面培养基的重量配比为：葡萄糖1.5％，牛肉浸膏0.3％，天门冬氨酸0.05％，磷酸氢二钾0.05％，琼脂1.8％，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
4.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的含2-3％甲硫氨酸的平板培养基的重量配比为：可溶性淀粉0.4％，酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％，氯化钴0.002％，琼脂1.8％，2-3％甲硫氨酸，其余为纯化水，调PH值为7.2-7.4。
5.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的种子培养基的重量配比为：玉米淀粉2.5％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，酵母粉1.0％，氯化钴0.003％，其余为纯化水，调PH值为6.8-7.0。
6.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的发酵培养基的重量配比为：玉米淀粉14％，淀粉酶0.003％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉1.0％，氯化钴0.003％，硫酸锰0.0024％，钼酸钠0.0023％，轻质碳酸钙0.1％，其余为纯化水，调PH值为7.4-7.6。
7.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的诱变处理是将除虫链霉菌单孢子悬液置于30W紫外线灯下照射进行诱变处理，照射距离控制在30-40cm，照射时间为30-60S。
8.根据权利要求1所述的一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，其特征在于：所述的摇瓶培养时摇瓶的转速为210-230rpm。
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