CN1432068A - 柄型菌素的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纯化柄型菌素的改良方法。
Description
技术领域
本发明涉及柄型菌素(ansamitocin),特别是能转变为美登木醇的柄型菌素的制备方法。
背景技术
美国专利5,208,020描述了强细胞毒性美登木素生物碱(maytansinoid)药物和它们的治疗应用。这些药物能从诸如束丝放线菌属之类的微生物发酵生产的柄型菌素前体制备。
在规定的培养条件下,珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)等束丝放线菌(Actinosynnema spp.)产生多种相关的柄型菌素。主要的产物是在C-3位置带有异丁酰部分的柄型菌素P-3。次要产物是仅在C-3酰基支链中有区别的其他的柄型菌素,P-1(ethionyl moiety),P-2(丙酰基部分),P-3′(丁酰基部分),P-4(异戊酰基部分)和P-4′(戊酰基部分)。所有这些化合物可以通过还原裂解产生一种共同的产物美登木醇(形成P-0)。另外,还以低水平产生多种其他柄型菌素,它们在分子的其他的位置被修饰(羟基化或n-脱甲基)。这些不能通过脱酰作用产生所希望的P-0。
美国专利4,162,940;4,228,239;4,356,265;和4,450,234描述了从束丝放线菌生产柄型菌素P-3的方法。总之,这些方法需要将助滤剂和与水混溶的溶剂加入到整个发酵液中,清除固体,用不与水混溶的溶剂萃取含水成分,浓缩和用石油醚沉淀,采用硅层析纯化沉淀物,结晶后进一步层析纯化或重结晶。其它方法用Diaion HP-10吸附取代硅层析,随后进一步用溶剂萃取并结晶。
这些方法能获得可接受的柄型菌素P-3的产率,但是这些方法涉及很多个在大规模生产操作中受到限制的阶段,这些限制可以是柄型菌素化合物的极强毒性以及保证操作人员安全的必要性所造成的。因此,需要另外的,更安全、采用更少和更多受限步骤的方法。
发明概述
本发明的一个方面是提供包括如下步骤的制备纯化的柄型菌素的方法:a.在液体培养基中培养能产生柄型菌素的微生物;b.为便于用溶剂萃取柄型菌素而处理培养基;c.采用芳香烃溶剂从培养基中萃取柄型菌素;e.浓缩所萃取的柄型菌素和 f.通过结晶纯化柄型菌素。
本发明的另一个方面是提供包括如下步骤的制备纯化的柄型菌素的方法:a.在液体培养基中培养能产生柄型菌素的微生物;b.采用芳香烃溶剂从培养基中萃取柄型菌素;c.浓缩所萃取的柄型菌素;d.通过结晶纯化柄型菌素。
发明详述
本说明书中引用的所有的出版物,包括但不局限于专利和专利申请,已全文引入本文作为参考。
本发明提供了不含过滤步骤的制备纯化的柄型菌素的方法。
这些方法包括如下步骤,在液体培养基中培养能产生柄型菌素的微生物,处理培养基,使柄型菌素从这些微生物释放至培养基中,以便用溶剂萃取,用芳香烃溶剂从处理过的培养基中萃取柄型菌素,浓缩所萃取的柄型菌素,并用结晶法纯化柄型菌素。或者,可以省略处理步骤。
纯化的柄型菌素可以还原为美登木醇,它们包括柄型菌素P-3,P-1,P-2,P-3′,P-4和P-4′。纯化的柄型菌素仅含有非常少的非必需柄型菌素,它们在分子中的其他位置上带有修饰。产生柄型菌素的优选微生物是束丝放线菌。特别优选珍贵束丝放线菌ATCC 31565。也特别优选珍贵束丝放线菌ATCC31281。按照众所周知的发酵培养技术例如美国专利4,450,234所公开的技术可培养这些微生物。
本发明方法的一个实施方案通过处理微生物来促进细胞内柄型菌素的释放并使与细胞结合的柄型菌素更易于被溶剂萃取。处理方法实例包括超声法,加压法或升温法。优选加热处理。热处理可以在约60℃~80℃进行。优选在约75℃进行热处理,在这个温度可杀死这些微生物并有助于用溶剂萃取柄型菌素。在另一个实施方案中,在萃取之前不进行处理,因为柄型菌素总量的近60%在培养基中。
柄型菌素可以采用芳香烃溶剂从培养基中萃取。这种芳香烃在众多发酵液成分中对于柄型菌素具有特别的选择性,从而确保只需要简单的后续处理方法就可以分离得到纯产物。优选的芳香烃溶剂是甲苯或二甲苯。由于甲苯更易于在低温蒸发,因此更优选甲苯。甲苯和二甲苯具有在重力下易于与水层分离而不需要机械分离的特性,因此使这种方法处理能力更大,并可提高操作人员的安全性。萃取可在约20℃到约60℃之间进行。优选萃取温度为约45℃。萃取之前水溶液的pH应该在3到9的范围内。pH优选接近中性,也就是6到8之间。
一般情况下,萃取溶剂与整个培养液的体积比优选为1∶1。可供选择的比率范围可以是2∶1到1∶4。溶液在缓慢搅拌条件下混合,搅拌该混合物直到约80%以上的柄型菌素被萃取进入有机层为止。混合物优选在重力作用下在15℃到50℃的温度区间下静置分层,优选静置温度约45℃。
取出有机层,通过在真空中缩减溶剂的体积或采用本领域熟知的其它方法浓缩萃取物。在减少体积后,浓缩的萃取物可以任选溶于极性溶剂如甲醇中,采用例如PTFE之类的滤膜或诸如硅或氧化铝之类的深度过滤器使之澄清。
通过减少不希望得到的柄型菌素的量,使用结晶法纯化所希望得到的柄型菌素,特别是P-3。用于结晶法的优选的溶剂混合物是乙酸乙酯和庚烷。按照常规方式进行结晶。为了帮助固体结晶,可以在加入乙酸乙酯之前加入少量的甲醇或类似的极性溶剂,然后用大量的庚烷进行处理,可选择搅拌并冷却直至得到结晶产物。这些产物可以按照同样的步骤进行重结晶。
或者,在结晶之前,从发酵液萃取的不纯的柄型菌素可以使用硅胶纯化,例如将溶剂萃取溶液通过硅胶床。层析所用的溶剂可以是甲苯和甲苯-甲醇的混合物。其他的技术上众所周知的溶剂也可以使用。收集含柄型菌素P-3的分馏物,减压浓缩。
本发明还提供了通过HPLC分析柄型菌素的方法。柄型菌素P-3的定量和柄型菌素比率的分析都可以采用这种方法。下面的实施例采用了这些方法。
发酵液和萃取样品中柄型菌素P-3的定量在4.6×250mm的C18 WatersQ Spherisorb S5 ODS2柱上进行,该柱配有10mm的外层保护柱。紫外探测在252nm和205nm进行。采用60% MeCN(0.05% TFA)的水溶液(0.05%TFA)以1ml/min等速流动,注入体积为20μl。
对下游处理样品中柄型菌素比率的分析可以在没有防护柱的C8 WatersSymmetry Shield柱(3.9×150mm)中进行。紫外探测在252nm和205nm进行。使用梯度为35-45%的MeCN(0.05% TFA)水溶液(0.05% TFA)以1ml/min流动30分钟,在40℃重平衡10分钟,注入体积为10μl。
层析分馏物和最终产物中柄型菌素比率的分析可以在不带防护柱的C8Waters Symmetry Shield柱(3.9×150mm)上,采用LC-MS探测系统,大气压电喷离子化+ve离子模式进行。采用完全扫描MS(从600到700amu with quad1)经30V cone电压Mass探测对各个峰进行鉴定。采用相同的梯度系统,通过MS-MS片段化(fragmentation)确定柄型菌素的类别。流速为1ml/min,梯度流动相为30分钟内35-45% MeCN(0.05% TFA)的水溶液(0.05% TFA),在40℃重新平衡10分钟,注入体积为10微升。
对废液和其他低含量样品中柄型菌素P-3的定量分析需要高的灵敏度,可在配有10mm防护柱的C18 Waters Spherisorb S5 ODS2柱(4.6×250mm)上采用LC-MS-MS大气压电喷离子化探测系统,+ve离子模式,30V cone电压进行。为了测定结构类型,选择主要种类的分子离子,观测到的片段化模式表明,主要是N-甲基化的547离子和N-脱甲基化的533。采用60% MeCN(0.05% TFA)的水溶液(0.05% TFA)作为均匀流动相,流速为1ml/min,注入体积为20微升。
本发明的方法可用于制造细胞粘合剂/美登木素生物碱复合物,这种复合物可作为活化瘤的前体药物使用。本发明的方法制备的柄型菌素可通过还原性裂解形成美登木醇,美登木醇可按照美国专利5,208,020的描述生产含N-甲基-L-丙氨酸的美登木素生物碱衍生物。这些衍生物然后与细胞粘合剂(优选抗体)通过各种接头例如二硫键进行偶联。
细胞粘合剂/美登木素生物碱复合物的一个实例可采用含如下步骤的方法制备:
(1)将通过本发明方法制备的柄型菌素还原为美登木醇;
(2)用N-甲基-L-丙氨酸衍生物使美登木醇酯化,形成含二硫键的美登木酯(maytansinoid ester);
(3)将通过步骤(2)制备的含二硫键的美登木酯还原为含巯基的美登木素生物碱;
(4)将二硫代吡啶基引入细胞粘合剂;和
(5)将步骤(3)产生的含巯基的美登木素生物碱与步骤(4)的二硫代吡啶基细胞粘合剂通过二硫键连接。
本发明参考以下具体的、非限定的实施例进行描述。
实施例1
珍贵束丝放线菌培养液的萃取和柄型菌素的纯化
37升含有生产菌株珍贵束丝放线菌ATCC 31565的完整培养物(柄型菌素P-3 titer 86.3 mg/L)原位在75℃加热60分钟,以杀死微生物并使柄型菌素的溶剂萃取更容易。加入40升甲苯,将混合物加热到45℃。搅拌,使上层相的甲苯进入下层相的培养液,但未乳化或完全长为均相。在16个小时内完成萃取,在2小时内利用重力分离。
采用虹吸管收集含80mg/L P-3的39升的甲苯,采用20升旋转蒸发仪(浴温40℃到45℃,速率约9L/hr)蒸发。在蒸发后,产生含有3.1g P-3;(27.6%w/w)的11.2g的流动油。萃取产物通过溶于甲苯而转移到烧瓶中,并重新蒸发(萃取阶段产率=97%)。
萃取物被萃取至120ml甲苯中并用375ml甲苯(三倍床体积,3bv)加载至硅胶柱(Kieselgel 60,125ml床体积装载甲苯,4cm diam.x 10cm)中。用2bv甲苯洗柱,然后用2% MeOH的甲苯溶液以2bv洗脱4次,再用4% MeOH的甲苯溶液以1bv洗脱12次。以40ml/min的速度洗脱,产生紧密的色带。将含有柄型菌素P-3的层析馏分7~10汇总并蒸发,得到3.2g的油状固体,它含有2.5g的P-3。采用LC-MS和MS-MS分析这种物质。
在这个阶段,产物含有85.1%的柄型菌素P-3,93.9%的所希望得到的柄型菌素(层析柱阶段的产率=80.6%)
从硅胶柱获得的产物放入加热到40℃的200ml EtOAc中。加入庚烷(200mL)并冷却溶液。在该溶液中加入1mg纯的P-3晶体(在烧瓶中其他位置也自发结晶)。室温4小时后,采用HPLC分析上清液,测量说明0.8g P-3(30%)仍然在溶液中。进一步加入庚烷150ml并将烧瓶再放置3小时并重新分析。0.4g的P-3(16%)仍在溶液中。烧瓶在4℃下过夜。随后的分析表明仅有70mg的P-3(3%)保留在溶液中。采用多孔滤膜流水线吸去母液。用15mL 1∶3 EtOAc:庚烷清洗白色针状晶体2次。在30℃下在旋转蒸发仪上,真空原位干燥这些晶体10小时。获得2.5g晶体(结晶产率=86%)。
最后的产物含有86%的柄型菌素P-3,所需酰化柄型菌素(P-1,P-2,P-3,P-3′,P-4,P-4′)总量为98.4%。
实施例2
珍贵束丝放线菌培养液的萃取和柄型菌素的纯化
1,100L含有生产菌株珍贵束丝放线菌ATCC 31565的完全培养液(柄型菌素P-3 titer 75.1 mg/L,82.6g P-3),在75℃原位加热60分钟杀死这些微生物并使柄型菌素的溶液萃取更容易。在加热杀死微生物的过程后保留有77.6g的P-3。加入等体积的预热到45℃的甲苯并将混合物保持45℃的温度。搅拌,使上层相的甲苯被萃取至下层相的培养液中,但未乳化或完全成为均相。萃取进行45个小时,然后在重力作用下分离30分钟(萃取阶段产率90.3%)。
含有柄型菌素的1127L甲苯萃取液采用降膜蒸发器(FFE)浓缩至22L。将浓缩物转移到50L的旋转蒸发仪并蒸发以使体积缩小(蒸发速率14.6L/hr)。采用20L甲苯洗FFE2次,并使洗液流经蒸发仪以确保产物的完全转移。浓缩物蒸发到干燥。
干的萃取物加入7.2L的含有4%甲醇的甲苯中并加载到硅胶柱(Kieselgel 60,4.8L床体积装了含4%甲醇的甲苯,15.0cm diam.x 27.0cm,加载速率120mL/min)。采用含4%甲醇的甲苯以227-384mL/min的流速等相洗脱此柱,获得紧密的层析带。初始分馏物是一个床体积,分馏物3到6按半个床体积收集。采用TLC(Kieselgel 60 F254 plates,在含5%甲醇的二氯甲烷中运行,254nm紫外显象)监测分馏物并用HPLC和LC-MS监测含有柄型菌素的馏分。根据HPLC和LC-MS对于馏分的分析选择结晶的馏分,以便最佳回收柄型菌素P-3并使不需要的柄型菌素馏分减至最小。含有柄型菌素P-3的馏分5到10被收集起来并蒸发,产生含有54.6g P-3的固体。在这个阶段,产物含有77.1%的柄型菌素P-3,96.1%的全部所希望的柄型菌素(层析柱阶段产率=92.5%).。
将硅胶层析柱的产物加入预热到46℃的91ml的甲醇中,再加入加热到同样温度的546ml乙酸乙酯中。再加入等份的甲醇帮助溶解这些固体。总量为166ml的甲醇被加入到所述混合物中。在刚开始产生云雾时加入已加热到50℃的100ml庚烷,然后使溶液冷却至室温,从而开始结晶。在4小时后,再加入1324ml庚烷(室温)。采用HPLC分析上清液,经测定6.6g P-3仍留在溶液中。将混合物在冰上冷却并再加入等份的庚烷(200和400ml),直到在母液中还有3.9g的P-3(6.8%)。
母液采用多孔滤膜装配线吸去。用2×150mL 1∶3乙酸乙酯∶庚烷洗涤晶体。使这些晶体在旋转蒸发仪中30℃原位干燥88.5小时,干燥始于低真空,然后高真空(1.0-1.3mbar)。获得76.4g晶体。
最终产物含有74.5%柄型菌素P-3(56.9g),所希望酰化的柄型菌素总量为97.8%(总产率=69%)。
实施例3
柄型菌素的硅胶层析和结晶
基本如实施例1所述对含有64.8mg/L柄型菌素P-3的1008L珍贵束丝放线菌完整培养液进行加热处理,用甲苯萃取并蒸发。
将含34.5g柄型菌素P-3的浓缩液加入3L甲苯中,加载至硅胶层析柱(Kieselgel 60,3.0L床体积充填甲苯,13.8cm diam.x 16.6cm)。柱用4cm的沙封顶。用5L甲苯洗柱,然后用20L2%MeOH的甲苯溶液洗柱,收集5L馏分。层析柱然后用20L4%的MeOH甲苯溶液洗脱,收集2.5L馏分。柄型菌素洗脱在馏分9到15。根据HPLC和LC-MS对于馏分的分析选择结晶的馏分,使柄型菌素P-3的回收最佳并使不希望的柄型菌素量最少。将馏分10到12汇总并经蒸发干燥,产生含有32.5g柄型菌素P-3的油。
在这个阶段产物含有91.8%的柄型菌素P-3,含有总量为95.3%的所希望获得的酰化柄型菌素(层析柱阶段产率=94.2%)。
来自汇总的硅馏分的浓缩物在50℃水浴中预温,并用最小体积的热甲醇/乙酸乙酯(50℃)溶解。先加入60ml甲醇,然后慢慢加入300ml乙酸乙酯。进一步加入20ml热的甲醇,此时浓缩物完全溶解。加入200ml热的庚烷(50℃)并从水浴中移出结晶溶液。结晶开始,在200ml等份中加入庚烷直到加入的总体积为800ml。混合物在冰浴内冷却18个小时。通过HPLC分析母液来监测结晶。在18个小时的时候,母液中保有6.3%的柄型菌素P-3。再加入200ml庚烷,并进一步将混合物冷却5小时。HPLC分析表明4.0%柄型菌素保持在母液中。
通过吸出暗褐色的母液而回收晶体。所述晶体用50ml的庚烷∶乙酸乙酯3∶1洗三遍并在真空(0.8mBar)中干燥过夜。晶体是均匀、细小、米色针状,含28.2g柄型菌素P-3(结晶阶段产率=86.9%)。
最终的产物含93.1%的柄型菌素P-3和总量98.4%的所希望的酰化柄型菌素。
实施例4
从甲苯萃取物中纯化和结晶柄型菌素
基本如实施例1所述,对含有74.5g/L柄型菌素P-3的1001L珍贵束丝放线菌完整培养液进行加热处理,用甲苯萃取并蒸发,得到含有54.7g柄型菌素P-3的9.5L浓缩萃取物。
将此浓缩物加热到45℃并用33分钟加入14.5L庚烷,以便柄型菌素沉淀。混合物在冰上冷却。再加入5L庚烷并将混合物静置过夜。吸出母液并用10L甲苯∶庚烷1∶1的溶液冲洗沉淀。HPLC分析表明母液含有6.5%的柄型菌素P-3,清洗液含1.8%P-3。沉淀溶于2L甲醇中,用0.2微米的过滤器过滤。
使甲醇溶液蒸发干燥,重新溶于50℃的85ml甲醇中。向该溶液中加入510ml乙酸乙酯,再加入200ml庚烷。将混合物冷却到室温,当结晶开始时缓慢加入990ml庚烷。母液中含有4.14g柄型菌素P-3。再加入400ml庚烷并在冰上冷却。母液中保留有2.7g的柄型菌素P-3。
吸出母液并在50℃将晶体溶于110mL的甲醇和520ml的乙酸乙酯中。再加入两个75ml等份的庚烷,混合物冷却到环境温度并再加入900ml。再加入400ml的庚烷并将混合物在冰上冷却,静置过夜,使其结晶。HPLC分析表明母液中留有2.3g的柄型菌素P-3。吸出母液并用庚烷∶乙酸乙酯=3∶1的溶液冲洗晶体,在真空(0.6mBar)下干燥过夜。47.8g晶体含有84.3%的柄型菌素P-3,和总量97.0%的所希望的酰化柄型菌素。
实施例5
用二甲苯萃取珍贵束丝放线菌培养液并纯化柄型菌素
220mL加热处理过的珍贵束丝放线菌与44μg/ml柄型菌素P-3放在45℃的水浴中,加入等体积的二甲苯。混合各相,使二甲苯进入下层液相中但未形成乳液。在20小时后,64%的柄型菌素P-3被萃取至二甲苯相中。
在重力作用下分离混合物并取出170ml二甲苯。将二甲苯萃取物蒸发干燥。采用硅胶层析纯化二甲苯萃取物。使萃取物溶于2ml含4%甲醇的甲苯溶液,加载并用相同的溶剂混合物洗脱。收集馏分(0.5ml),采用TLC(Kieselgel 60 F254 plates,在20∶1的二氯甲烷∶甲醇中)进行分析。采用前面的实施例所述的方案使含柄型菌素P-3的馏分结晶。结晶产物与发酵液的甲苯萃取所得结晶产物在色泽和纯度方面品质相当。
本发明可以收录到其他的形式而不脱离总的精神或基本贡献,因此,本发明的范围应参考附加的权利要求,而不是前述说明。
Claims (16)
1、一种制备纯化的柄型菌素的方法,包括如下步骤:
a.在液体培养基中培养能产生柄型菌素的微生物;
b.处理这些培养基以便有助于用溶剂萃取柄型菌素;
c.用芳香烃溶剂从培养基中萃取柄型菌素。
d.浓缩所萃取的柄型菌素;
e.采用结晶法纯化柄型菌素。
2、一种制备纯化的柄型菌素的方法,包括如下步骤:
a.在液体培养基中培养能产生柄型菌素的微生物;
b.用芳香烃溶剂从培养基中萃取柄型菌素;
c.浓缩所萃取的柄型菌素;
d.采用结晶法纯化柄型菌素。
3、权利要求1或2的方法,其中产生柄型菌素的微生物是束丝放线菌。
4、权利要求3的方法,其中的束丝放线菌是珍贵束丝放线菌ATCC31565。
5、权利要求3的方法,其中的束丝放线菌是珍贵束丝放线菌ATCC31281。
6、权利要求1的方法,其中的处理是在约75℃进行热处理。
7、权利要求1或2的方法,其中的溶剂是甲苯。
8、权利要求7的方法,其中甲苯与热处理后培养基的比例是约1∶1。
9、权利要求8的方法,其中的萃取温度是约45℃。
10、权利要求1或2的方法,其中的溶剂是二甲苯。
11、权利要求10的方法,其中的二甲苯与热处理后培养基的比例是约1∶1。
12、权利要求11的方法,其中的萃取温度是约45℃。
13、权利要求1或2的方法,其中的柄型菌素包括能通过还原性裂解形成美登木醇的酰化柄型菌素。
14、采用权利要求1或2的方法制备的柄型菌素。
15、一种细胞粘合剂美登木素生物碱复合物,其通过将权利要求1或2的方法制备的柄型菌素转化为细胞粘合剂美登木素生物碱复合物而制备。
16、权利要求15的细胞粘合剂美登木素生物碱复合物,其是一种抗体。
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