CN116102571B - 一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物毒素标准物质制备技术领域，涉及一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分(虾夷扇贝毒素与类虾夷扇贝毒素同系物)的分离纯化方法。将有毒的网状原角藻规模化培养后，离心获得藻泥和培养液，藻泥经甲醇辅以超声提取毒素；培养液经大孔径树脂吸附及乙醇洗脱收集毒素，合并提取液，先进行直径较大的C18色谱柱进行毒素液相色谱盲制备，再经过直径较小的C18色谱柱进行液相色谱质谱引导制备，即可获得高纯度的虾夷扇贝毒素与类虾夷扇贝毒素。本发明将网状原角甲藻产生的虾夷扇贝毒素与类虾夷扇贝毒素的同系物，经过提取、去除杂质和纯化，可使这两种毒素得以分离，各自毒素纯度达99％以上，为毒素溶液标准物质研制，保证原料供给。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物毒素标准物质制备技术领域，涉及一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分(虾夷扇贝毒素与类虾夷扇贝毒素同系物)的分离纯化方法。
背景技术
虾夷扇贝毒素(Yessotoxin，YTX)为脂溶性海洋生物毒素，易溶于甲醇，乙醇等有机溶剂。CAS号：112514-54-2。质子化形式分子式：C55H82O21S2(式1)，分子量：1143.4g/mol。类虾夷扇贝毒素(Homoyessotoxin，hYTX)为脂溶性海洋生物毒素，易溶于甲醇，乙醇等有机溶剂。CAS号：196309-94-1。质子化形式分子式：C56H84O21S2，分子量：1157.38g/mol(式2)。
虾夷扇贝毒素组(Yessotoxins，YTXs)是一类大环内酯结构的多醚海洋生物毒素，热稳定，在海洋动物体内易于富集且难降解。1984年，首次从日本虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)体内首次分离出该毒素系列化合物，因而命名为虾夷扇贝毒素。在全世界近海均有分布，已发现了同系物34种(Dinoflagellate polyether withinthe yessotoxin,pectenotoxin and okadaic acid toxin groups:Characterization,analysis and human health implications)。这类毒素是由海洋藻网状原角藻(Protoceratiumreticulatum)、多边舌甲藻(Lingulodiniumpolyedrum)和具刺膝沟藻(Gonyaulaxspinifera)等海洋甲藻产生的，海洋贝类等摄食有毒微藻后可在体内富集，易于累积的毒素组分主要有虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素，对食用人类健康可造成损伤。欧盟规定虾夷扇贝毒素安全食用限量为3.75mg/kg，我国尚无该毒素安全食用限量标准。
我国是海洋大国，海产品生产、贸易与消费居于世界首位。随着全球气温升高和海水酸化、陆源有机物污染物入海排放增加与氮磷营养盐比例失调等不断加剧，全球性的海洋生物毒素污染呈加剧趋势。近年来，在我国沿岸海域动物体内虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素常有检出，且偶有超出欧盟标准现象；进口的海产品中，也常有检出。虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素是海洋生物毒素重要种类，目前检测方法为液相色谱-串联质谱法。因此，虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素标准物质的研制，对于有效开展该毒素监测，保证我国海产品食用安全与加强海洋生态环境保护是极其必要的。虾夷扇贝毒素与类虾夷扇贝毒素是由甲藻产生，虽然在自然条件下，这些毒素易于富集在海洋双壳贝类等体内，但仍十分微量，无法进行野外收集用于生产足够量高纯毒素的需求。
发明内容
本发明目的在于提供一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分(虾夷扇贝毒素与类虾夷扇贝毒素同系物)的分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，将有毒网状原角藻规模化培养，离心获得藻泥和培养液，藻泥经甲醇辅以超声提取毒素；培养液经大孔径树脂吸附与乙醇洗脱收集毒素，合并提取液，先经直径较大的C18色谱柱进行液相色谱盲制备洗脱处理，再经过直径较小的C18色谱柱质谱引导的液相色谱制备进行洗脱处理，即可分别获得纯度超过99％的虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素。
所述规模化培养后分离所得培养液经大孔径(粒径0.3-1.2mm)树脂(HP20)吸附，再用95％乙醇洗脱，经减压旋干后，用无水甲醇溶解和离心后，上清液经有机膜过滤，用于盲制备。
所述规模化培养后分离所得藻泥与无水甲醇按质量体积比为1:1的比例混合超声提取，经减压旋干后，经无水甲醇溶解和离心后，上清液经有机膜过滤后，用于盲制备。上述超声提取，以10000转/分钟进行离心收集沉淀，沉淀物按上述方式再经甲醇溶解超声提取3次；合并超声提取液，经减压旋蒸干后，无水甲醇溶解离心去除沉淀。
所述毒素盲制备，将藻泥和培养液分别处理后的毒液合并，经减压旋干甲醇溶解液体，进行至少3次盲制备的梯度洗脱处理，并且每次处理后通过合并含有毒素的洗脱液用于下一次的盲制备的洗脱处理，此步骤处理后含有毒素的洗脱液，减压旋干甲醇溶解后待用；其中，每次盲制备的梯度洗脱处理采用色谱柱为C18(21.2mm×250mm,10μm)，进样量10mL，流速15mL/min。所述每次盲制备的梯度洗脱处理时洗脱试剂为乙腈和水。
所述经减压旋干甲醇溶解液体，进行3次盲制备的梯度洗脱处理，每次梯度洗脱时乙腈与水的比例设定为，第一次0-40分钟，乙腈比例由20％上升至80％；40-45分钟，乙腈比例上升至90％等；45-60分钟，乙腈比例从90％下降到85％；60-70分钟，乙腈比例降至为35％；70-80分钟乙腈比例降至为20％。经过液相色谱-串联质谱法检测后，收集含有毒素的制备液；经减压旋干后用甲醇溶解液，用于第2次制备，0-40分钟，乙腈比例由20％上升至80％；40-45分钟，乙腈比例上升至85％等；45-60分钟，乙腈比例从85％下降到35％；60-65分钟，乙腈比例降至为20％，制备液经检测和减压旋干后用甲醇溶解液，用于第3次制备，0-20分钟，乙腈比例由20％上升至80％；20-35分钟，乙腈比例上升至85％等；35-40分钟，乙腈比例从85％下降到35％；40-55分钟，乙腈比例降至为20％。
上述进行第1次盲制备，采用色谱柱为C18(21.2mm×250mm,10μm)，进样量10mL，流速15mL/min；第2次制备，再利用色谱柱C18，进样量10mL，流速保持15mL/min；第3次制备，再用色谱为C18，进样量10mL，流速保持15mL/min。
所述进行质谱引导液相色谱制备：采用色谱柱为Xtimate C18(250mm×10mm，5μm)，进样量50μL，流速为3ml/min，洗脱试剂为水和乙腈，经处理后收集洗脱液进行质谱引导制备，所述毒素出峰起止时间收集制备液，虾夷扇贝毒素出峰时间为8.0～8.5分钟；类虾夷扇贝毒素为：7.6～8.6分钟，将收集浓缩液经旋干后甲醇溶解液，而后进行第二次液相色谱处理，收集洗脱液再按上述条件经质谱引导收集浓缩液经旋干，直至样品中毒素含量大于99％。
所述第一次液相色谱处理时洗脱液的设置为0-1分钟，乙腈比例上至20％；1-15分钟，乙腈比例上至90％；15-17分钟，为等洗脱，乙腈比例为90％；20-25分钟，乙腈比例降至20％。
第二次液相色谱处理时洗脱液的设置为，0-1分钟，乙腈比例上至20％；1-15分钟，乙腈比例上至90％；15-17分钟为等洗脱，乙腈比例为90％；17-20分钟，乙腈比例降至20％。
所述收集制备样品旋蒸浓缩冷冻干燥，若纯度不超过99％，按第2制备程序再制备1-2次，直至样品纯度即可达到要求。
所述有毒网状原角藻清洗除杂，取网状原角藻单个细胞，接种至过滤消毒后的海水中进行培养，直至细胞繁殖后于含有F1/2的海水进行扩大培养2周左右，即获得易于室内可连续规模的培养藻株，来获得足够的原料来提取纯化毒素。
进一步的说，取将清洗后的网状原角藻的单个细胞，用毛细管吸入96孔培养板中(每孔只添加一个网状原角藻细胞)，培养液是微孔膜过滤的采集样品海区海水并添加抑制细菌(原位培养液)，抑制细菌物质添加量为100ppm，其中抑制细菌物质为青霉素和制霉菌素；在光照培养箱中培养，控制光照强度3000勒克斯，日光照时间12小时，恒温15℃。每周显微镜下观察，直至网状原角藻细胞得以繁殖至每个细胞培养孔中30个以上再进行扩大培养。
将上述繁殖后网状原角藻细胞，转移到24孔细胞培养板(每孔50个以上网状原角藻细胞)，每孔再每孔添加1毫升原位培养液和1毫升含有F1/2营养盐配方的海水，于恒温箱中以15℃培养至每个细胞培养孔中50个以上；而后将培养获得的细胞接种至100毫升三角烧瓶进一步扩大培养，添加含有F1/2营养盐配方的海水(每瓶添加25-30毫升原位培养液和55-60毫升含有F1/2营养盐配方的海水)，并在室内温度控制15-20℃条件下，光照2000-4000勒克斯，日光照时间12小时，培养2周左右，再添加F1/2营养盐配方海水，逐步扩大1升和5升的三角烧瓶中培养，即可进行规模化培养。
本发明的技术优势：
本发明经网状原甲藻中虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素的，经过提取、去除杂质和纯化，可使这二同系物得以分离，各自毒素纯度达99％以上，并且每1000克以上的有毒藻泥，经提取纯化即可达到100毫克以上，为毒素标准物质研制，保证了原料供给。技术优势为：(1)本发明纯化过程中采用甲醇对藻种提取，辅以大功率非接触式超声波，可将网状原角藻细胞内的毒素提取出来，效率高；同时采用大孔径树脂吸附微藻培养液中的毒素，回收率高，有效利用稀缺的原材料。(2)由于虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素为同系物，结构差异小，均无紫外光谱吸收，紫外等常规制备技术无法分离，进而本发明在盲制备时可去掉大量杂质；而后再经质谱引导制备时用毒素出峰时间收集样品，不仅能进一步去除杂质，还能按实时收集样品，从而保证了制备毒素的纯度。
附图说明
图1为本发明实施例提供的网状原角藻中虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素分离纯化工艺流程图。
图2为本发明实施例提供的所培养的网状原角藻中提取的虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素液相串联质谱(LC-MS/MS)图。
图3为本发明实施例提供的所制备的纯度高于99％的虾夷扇贝毒素液相色谱蒸发光检测器(HPLC-ELSD)谱图。
图4为本发明实施例提供的所制备的纯度高于99％的类虾夷扇贝毒素液相色谱蒸发光检测器(HPLC-ELSD)谱图。
图5为本发明实施例提供的所制备的纯度高于99％的虾夷扇贝毒素固体粉末定量核磁共振法(qNMR)谱图。
图6为本发明实施例提供的所制备的纯度高于99％的类虾夷扇贝毒素固体粉末定量核磁共振法(qNMR)谱图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1
将网状原甲藻(市购)用经过高温消毒的海水，反复冲洗采集到的网状原角藻样品，去除杂质；而后用玻璃毛细管，将含有网状原角藻的样品滴在载玻片上，显微镜下观察水滴中是否还有杂质，若还有杂质，需在显微镜下用毛细管再吸出杂质，直至在显微镜下未再发现杂质。取将上述清洗后的网状原角藻的单个细胞，用毛细管吸入96孔培养板中(每孔只加一个网状原角藻细胞)，并向每孔中添加原位培养液，原位培养液是微孔膜过滤的海水并添加抑制细菌物质，抑制细菌物质添加量为100ppm，其中抑制细菌物质为质量比1:3的青霉素和制霉菌素；在光照培养箱中培养，控制光照强度3000勒克斯，日光照时间12小时，恒温15℃。每周显微镜下观察，直至网状原角藻细胞得以繁殖至每个细胞培养孔中30个以上再进行扩大培养；将上述繁殖后网状原角藻细胞，转移到24孔细胞培养板(每孔50个网状原角藻细胞以上)，每孔再添加1毫升原位培养液和1毫升含有F1/2营养盐配方的海水(其中，F1/2营养盐的添加量占海水体积的1/1000)，于恒温箱中以15℃培养至每个细胞培养孔中50个以上；而后将培养获得细胞接种至100毫升三角烧瓶进一步扩大培养，添加原位培养液和含有F1/2营养盐配方的海水(即，每瓶添加30毫升原位培养液和70毫升含有F1/2营养盐配方的海水(海水中添加1/1000的F1/2培养液))，并在恒温箱内条件下温度15℃，光照3000勒克斯，日光照时间12小时，培养2周左右，再添加F1/2营养盐配方海水，逐步扩大1升和5升的三角烧瓶中培养，培养过程中每次选择状态好的进行扩大培养。在冬季(11月至翌年2月)，在室内条件下，控制室温度15～20℃，光照2000～4000勒克斯，在5升三角烧瓶中规模化培养，2周可以收获1次，将培养液连续流离心机分离，获得藻泥和培养液，用于毒素提取纯化。
实施例2
如图1所示，取上述20000L网状原角藻培养液进行离心机分离(辽阳天兴药机厂GQ75管式分离机)浓缩，转速18000转/分钟，浓缩成藻泥；离心出的海水培养液经大孔径树脂(三菱化学(中国)贸易有限公司大孔径树脂HP20)柱(直径8cm×高45cm)过滤，速度为10升/小时，吸附其中的毒素。
藻泥中提取毒素。按1000克藻泥添加1000毫升无水甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司分析纯(AR)甲醇)的比例，在功率为2200KW的非接触式超声仪(南京肯凡电子科技有限公司KR-2200B非接触式超声波仪)中连续超声破碎6小时后，离心浓缩，转速10000转/分钟(东芝CR22N高速离心机)，收集沉淀物再按照上述超声处理方式重复提取3次，经检测确认藻泥中不再含有毒素。上述连续离心获得培养液经过大孔径树脂HP2吸附，用10升乙醇(95％乙醇)洗脱，流速为0.4升/小时，收集洗脱液中毒素后，经检测在树脂吸附的毒素基本上没有残留。上述藻泥中甲醇提取液和大孔树脂HP20的乙醇洗脱液，减压旋干，用无水甲醇溶解，离心去除沉淀后，再旋蒸浓缩体积小于100毫升液体，-20℃保存。
液相色谱盲制备。取上述提取液，经过0.45μ和0.22μ有机膜过滤后，进行液相色谱制备(谱道(辽宁)科技有限公司制备液相色谱仪P2100型)分离，色谱柱为C18(21.2×mm250mm，10μm)，流速15毫升/分钟，流动相为水和乙腈，梯度洗脱如表1所示，进样量为10毫升。每3分钟收集1管，第一次制备时需接27管，经液相色谱-串联质谱(AB SCIEX,API4000)检测，确定毒素在各管中的含量后，合并收集含有毒素的制备液再旋干，用无水甲醇溶解液，用于第2次制备，仍采用上述色谱柱，流动相水和乙腈，梯度洗脱如表2所示，进样量为10毫升，每3分钟接1管，需接22管，合并收集含有毒素的制备液再旋干，用无水甲醇溶解液，用于第3次制备，仍采用上述色谱柱，流动相水和乙腈，梯度洗脱所表3示，进样量为10毫升，每3分钟接1管，需接19管。收集所有检出毒素样管，旋蒸干用无水甲醇溶解后液体，-20℃保存(参见图2)。
表1盲制备液相流动相梯度
表2盲制备液相流动相梯度
表3盲制备液相流动相梯度
液相色谱质谱引导制备。采用制备液相色谱-质谱仪(安捷伦液相色谱仪1260+质谱检测器MS6120)，色谱柱为Xtimate C18(250mm×10mm，5μm)，流速为3.0mL/min，进样为50μL，流动相水和乙腈，按表4梯度洗脱，收集。对上述收集的洗脱液进行质谱测试，液相色谱质谱条件为：虾夷扇贝毒素SIM离子为1141.5，碰撞电压为-48ev，在出峰时间7.6～8.6分钟收集的样品为虾夷扇贝毒素；类虾夷扇贝毒素SIM离子为1155.5，碰撞电压为-45ev，在出峰时间6.5～7.5收集的样品为类虾夷扇贝毒素。而后对收集的毒素样品旋干甲醇溶解液，用于第二次制备，流动相条件如表5所示，其他与第1遍制备一致。若上述2次制备后所得毒素纯度未达到99％，可按照第2遍制备程序再重复1-2次(本次共进行2次)。经过几次处理后，收集含有毒素的制备液体，旋蒸浓缩，冷冻干燥，固体粉末呈白色。
表4质谱引导制液相流动相梯度
表5质谱引导制液相流动相梯度
白色固体粉末毒素，先用液相色谱-蒸发光检测器(美国奥泰ELSD 6000)检测纯度，超过99％后，再用定量核磁共振仪(Bruker AVANCEⅢ型400MHz)进行验证(参见图3-6)，结果是虾夷扇贝毒素纯度为99.20％，重量为188毫克；类虾夷扇贝毒素纯度为99.24％，重量为132毫克。这两种毒素的纯度和重量，可完全满足标毒素溶液准物质制备要求。
Claims (6)
1.一种网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，其特征在于：将有毒网状原角藻规模化培养，离心获得藻泥和培养液，藻泥经甲醇辅以超声提取毒素；培养液经大孔径树脂吸附与乙醇洗脱收集毒素，合并提取液，先经孔径大的C18色谱柱进行液相色谱盲制备洗脱处理，再经过孔径小的C18色谱柱质谱引导的液相色谱制备进行洗脱处理，即可分别获得纯度超过 99%的虾夷扇贝毒素和类虾夷扇贝毒素；
规模化培养后分离所得培养液经大孔径树脂HP20吸附，再用95%乙醇洗脱，经减压旋干后，用无水甲醇溶解和离心后，上清液经有机膜过滤，用于盲制备；
规模化培养后分离所得藻泥与无水甲醇按质量体积比为 1:1的比例混合超声提取，经减压旋干后，经无水甲醇溶解和离心后，上清液经有机膜过滤后，用于盲制备；
毒素盲制备，将藻泥和培养液分别处理后的毒液合并，经减压旋干甲醇溶解液体，进行至少3次盲制备的梯度洗脱处理，并且每次处理后通过合并含有毒素的洗脱液用于下一次的盲制备，此步骤处理后含有毒素的洗脱液，减压旋干甲醇溶解后待用；其中，每次盲制备的梯度洗脱处理采用色谱柱为 C18，21.2mm×250mm, 10μm，进样量10mL，流速15mL/min，所述每次盲制备的梯度洗脱试剂为乙腈和水。
2.按权利要求1所述的网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，其特征在于：所述经减压旋干甲醇溶解液体，进行3次盲制备的梯度洗脱处理，每次梯度洗脱时乙腈与水的比例设定为，第一次0-40分钟，乙腈比例由20%上升至80%；40-45分钟，乙腈比例上升至90%；45-60分钟，乙腈比例从90%下降到85%；60-70分钟，乙腈比例降至为35%；70-80分钟乙腈比例降至为20%，经过液相色谱-串联质谱法检测后，收集含有毒素的制备液；经减压旋干后用甲醇溶解液，用于第2次制备，0-40分钟，乙腈比例由20%上升至80%；40-45分钟，乙腈比例上升至85%；45-60分钟，乙腈比例从85%下降到35%；60-65分钟，乙腈比例降至为20%，制备液经检测和减压旋干后用甲醇溶解液，用于第3次制备，0-20分钟，乙腈比例由20%上升至80%；20-35分钟，乙腈比例上升至85%；35-40分钟，乙腈比例从85%下降到35%；40-55分钟，乙腈比例降至为20%。
3.按权利要求1所述的网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，其特征在于：进行质谱引导液相色谱制备：采用色谱柱为Xtimate C18，250 mm×10 mm，5μm，进样量50μL，流速为3 ml/min，洗脱试剂为水和乙腈，经处理后收集洗脱液进行质谱引导，所述质谱引导液相制备毒素出峰起止时间收集液体，虾夷扇贝毒素出峰时间为 8.0~8.5分钟；类虾夷扇贝毒素为：7.6~8.6 分钟，将收集浓缩液经旋干后甲醇溶解液，而后进行第二次液相色谱处理，收集洗脱液再按上述条件经质谱引导收集浓缩液经旋干，直至样品中毒素含量大于99%。
4.按权利要求3所述的网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，其特征在于：第一次液相色谱处理时洗脱液的设置为0-1分钟，乙腈比例上至20%；1-15分钟，乙腈比例上至90%；15-17分钟，为等洗脱，乙腈比例为90%；20-25分钟，乙腈比例降至20%；
第二次液相色谱处理时洗脱液的设置为，0-1分钟，乙腈比例上至20%；1-15分钟，乙腈比例上至90%；15-17分钟为等洗脱，乙腈比例为90%；17-20分钟，乙腈比例降至20%。
5.按权利要求3或4所述的网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，其特征在于：收集制备样品旋蒸浓缩冷冻干燥，若纯度不超过99%，按第2制备程序再制备1-2次，直至样品纯度即可达到要求。
6. 按权利要求1所述的网状原角藻中海洋脂溶性毒素组分的分离纯化方法，其特征在于：有毒网状原角藻清洗除杂，取网状原角藻单个细胞，接种至过滤消毒后的海水中进行培养，直至细胞繁殖后于含有 F1/2 的海水进行扩大培养2周左右，即获得易于室内可连续规模的培养藻株，来获得足够的原料来提取纯化毒素。
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| 网状原角藻中虾夷扇贝毒素提取与纯化;姚敬元 等;海洋环境科学;20210228;第40卷(第1期);101-106 * |
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