CN102718843A - 一种替考拉宁单组份的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种替考拉宁单组份的制备方法，属于微生物原料药品的制备领域。该方法包括将替考拉宁发酵液通过大孔脱色树脂脱色后，再用大孔吸附树脂吸附、解吸，浓缩后得到含有TA_2-1、TA_2-2、TA_2-3、TA_2-4、TA_2-5和TA_3-1六种组份的替考拉宁粗提物；粗提物用水溶解后借助聚合物微球进行层析分离，得到高纯度的替考拉宁TA_2-1、TA_2-2、TA_2-3、TA_2-4、TA_2-5和TA_3-1六个单组份。本发明使用新型层析介质—聚合物微球，可以从替考拉宁粗提物中同时分离得到六种单组份；该方法工艺简洁，样品处理量大，溶剂消耗少，可以规模化制备替考拉宁单组份，为替考拉宁单组份的病理学、毒理学等深入研究提供样品。

Description

一种替考拉宁单组份的制备方法

技术领域

本发明涉及一种工业微生物技术领域中药品原料的制备方法，尤其是一种从发酵培养物中分离纯化替考拉宁单组份的制备方法。

背景技术

替考拉宁（Teicoplanin），为游动放线菌属(Actinoplanes teichomyceticus)发酵产生的一种糖肽类抗生素。它是由Teicoplanin A₂(TA₂)五种结构相似的糖肽类化合物(TA_2-1~TA_2-5)和去酰基葡糖胺Teicoplanin A₃(TA₃)组成的混合物。替考拉宁是继万古霉素后开发的另一种抗耐药菌糖肽类抗生素，它主要对革兰氏阳性需氧菌和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别对MRSA引起的感染有很好的疗效，是目前临床上为数不多的仍具有对多重耐药性金黄色葡萄球菌和肠球菌有活性的药物之一。与当前国际上公认的抗耐药菌抗生素万古霉素相比，替考拉宁具有与之相似的抗菌活性，相同的作用机理，相近或更优的临床疗效，但毒性更低，特别是更低的肾毒性，不会发生使用万古霉素后引发的“红人综合症”。替考拉宁具有比万古霉素更方便、快捷的给药途径，可以通过静注或肌注给药，应用更方便。此外，它与β-内酰胺类、氨基糖苷类和碳青霉烯类抗生素联用对绝大多数革兰氏阳性菌有协同杀菌作用。因此，对替考拉宁的研究与开发具有重要的经济价值和应用前景。

由于替考拉宁是两性化合物且结构中含有多个羟基，故易溶于水。另外，它易溶于二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇，可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，不溶于无机酸和非极性溶剂。国内外对其分离纯化方法进行了大量的研究，归纳起来主要有溶媒萃取法、吸附法、离子交换法和色谱法。

替考拉宁单组份的结构式为：

欧洲专利EP0137506公开了一种用溶剂萃取技术从发酵液中提取替考拉宁的方法，该方法将水溶性有机溶剂如丙酮、乙腈、正丙醇等直接加入到酸化的发酵液中聚集TA₂,再经离心或过滤除去菌丝体，其溶液部分经浓缩、冷却，沉淀出TA₂粗品，整个过程步骤繁琐，溶剂量消耗量大，产品纯度低。美国专利US2005245481A1公开了一种替考拉宁的生产工艺。该工艺通过对大孔树脂粗提液进行活性炭脱色，再次树脂分离、超滤、纳滤、结晶，可以得到纯度大于95%的替考拉宁精粉，但是对于TA₂各组分比例不能很好的控制。中国专利CN101302248A公开了一种高纯度替考拉宁的生产方法。该方法通过对替考拉宁粗品进行凝胶层析、大孔树脂分离、脱色、超滤、纳滤、结晶等过程，可以得到纯度大于93.1%的替考拉宁精粉，但步骤繁琐，而且只控制TA₂组比例，未提及到TA₂组各单组分的分离和比例控制情况。韩国专利Korean Pat. No.40453公开了一种从TA₂混合物中分离TA₂各个单组份的方法。该方法通过使用硅烷化硅胶柱和高效液相制备色谱，可以得到TA_2-1~TA_2-5五个单组份，但所使用的分离介质重复利用度低，且制备色谱对分离系统要求严格，导致该方法成本高、制备量小。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种工艺简单，收率稳定，成本低廉，可规模化生产替考拉宁单组份的制备工艺。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种替考拉宁单组份的制备方法，该方法包括下述步骤，

步骤1）预处理：在常温条件下，在替考拉宁发酵液中加入碱溶液，调节pH至11.0~13.0；将发酵液固液分离，所得滤液用酸溶液调节pH至7.0~7.5，得到替考拉宁滤液；

步骤2）脱色：将替考拉宁滤液导入大孔脱色树脂进行脱色，得到替考拉宁脱色液；

步骤3）吸附：将替考拉宁脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，吸附后先用低浓度的溶剂（浓度为15%~20%）进行冲洗，去除杂质，然后用高浓度的溶剂（浓度为40%~50%）解吸，所得替考拉宁解吸液，经浓缩、结晶、干燥，得到替考拉宁的粗提物；

步骤4）层析：将替考拉宁粗提物用水溶解，注入聚合物微球层析柱进行层析，然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂梯度洗脱，分别收集各段洗脱液，得到含有TA_2-1、TA_2-2、TA_2-3、TA_2-4、TA_2-5和TA_3-1六种单组份的替考拉宁单组份洗脱液；

步骤5）将六种替考拉宁单组份洗脱液分别浓缩、结晶、干燥，得到替考拉宁的单组份精粉。

本发明的进一步改进在于：所述步骤1）中碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；酸溶液为盐酸、硫酸或有机酸溶液的其中的一种。

本发明的进一步改进在于：所述步骤2）中大孔脱色树脂为LX-98、LSA-700B、DM130或D303树脂的其中的一种。

本发明的进一步改进在于：所述步骤3）中大孔吸附树脂为HZ816、HZ801、D101或D312树脂的其中的一种。所述溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液的其中的一种，解析时溶剂浓度为40%~50%。

本发明的进一步改进在于：所述步骤4）中层析介质为聚合物微球PS25-300、PS30RPC-300或PSA30-300的其中的一种。所述洗脱溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液中的一种，洗脱溶剂浓度为25%~60%。

本发明的进一步改进在于：所述步骤4）中包括如下步骤，

步骤A) 将替考拉宁粗提物用蒸馏水溶解，注入聚合物微球层析柱进行层析，然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂梯度洗脱；

步骤B）根据HPLC对替考拉宁中各单组份的检测结果，分别收集TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2的洗脱液；得到三种替考拉宁单组份洗脱液；

步骤C）根据HPLC对替考拉宁中各单组份的检测结果，分别收集TA_2-2与TA_2-3的HPLC峰面积百分比为1：2的混合液，TA_2-4与TA_2-5峰面积百分比为1：1的混合液；

步骤D）将步骤C）中得到的两种混合液浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球层析柱进行层析分离，然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂梯度洗脱，根据HPLC检测结果，分别收集TA_2-3 、TA_2-4和TA_2-5的洗脱液，得到这三种替考拉宁单组份洗脱液。

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：

本发明首次以聚合物微球为分离介质，通过梯度洗脱，对替考拉宁粗提物进行了进一步的分离纯化，成功制备了可供药品使用的替考拉宁TA_2-1、TA_2-2、TA_2-3、TA_2-4、TA_2-5和TA_3-1六种单组份。所得各单组份由高压液相（HPLC）检测的含量均大于95.0%，层析总收率大于50%。本发明制备工艺简洁合理，所得产品质量可控，溶媒消耗少，样品收率高，可以规模化制备替考拉宁单组份精粉。

步骤1）预处理中，在替考拉宁发酵液中加入碱溶液，调节pH至11.0~13.0；通过调节发酵液的pH值，可以破坏放线菌的细胞壁，使菌丝体中的替考拉宁释放到滤液中，从而提高替考拉宁的收率。

步骤2）脱色中，使用大孔脱色树脂对替考拉宁滤液进行脱色，有效去除了大部分色素和极性大的杂质，提高了滤液的澄清度和质量。

步骤3）吸附中，采用大孔吸附树脂对替考拉宁脱色液进行富集和纯化，先用低浓度的溶剂冲洗饱和树脂去除树脂柱上吸附的大部分多糖、色素和强极性杂质，然后用高浓度的溶剂解吸，使替考拉宁解吸液的质量大幅提高。

步骤4）层析中，新型层析介质—聚合物微球应用在分离纯化替考拉宁粗提物中，然后用洗脱溶剂梯度洗脱，分别收集各段洗脱液，可以从替考拉宁粗提物中同时分离得到六个单组份，样品处理量大，产品纯度高。

附图说明

图1是：替考拉宁TA_2-1单组份的质谱图；

图2是：替考拉宁TA_2-2单组份的质谱图；

图3是：替考拉宁TA_2-3单组份的质谱图；

图4是：替考拉宁TA_2-4单组份的质谱图；

图5是：替考拉宁TA_2-5单组份的质谱图；

图6是：替考拉宁TA_3-1单组份的质谱图；

图7是：替考拉宁TA_2-1单组份的¹³C-NMR谱图；

图8是：替考拉宁TA_2-1单组份的¹H-NMR谱图；

图9是：替考拉宁TA_2-2单组份的¹³C-NMR谱图；

图10是：替考拉宁TA_2-2单组份的¹H-NMR谱图；

图11是：替考拉宁TA_2-3单组份的¹³C-NMR谱图；

图12是：替考拉宁TA_2-3单组份的¹H-NMR谱图；

图13是：替考拉宁TA_2-4单组份的¹³C-NMR谱图；

图14是：替考拉宁TA_2-4单组份的¹H-NMR谱图；

图15是：替考拉宁TA_2-5单组份的¹³C-NMR谱图；

图16是：替考拉宁TA_2-5单组份的¹H-NMR谱图；

图17是：替考拉宁TA_3-1单组份的¹³C-NMR谱图；

图18是：替考拉宁TA_3-1单组份的¹H-NMR谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明一种替考拉宁单组份的制备方法，包括下述步骤：

步骤1）预处理：常温条件下，在替考拉宁发酵液中加入碱溶液，调节pH至11.0~13.0；优选为11.5~12.5。碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，优选为氢氧化钠溶液。将调节好pH的发酵液用真空抽滤、板框压滤或离心的方式使发酵液固液分离，所得滤液用酸溶液调pH至7.0~7.5，得到替考拉宁滤液。酸溶液为盐酸、硫酸或有机酸溶液的其中的一种，优选为盐酸。

步骤2）脱色：将替考拉宁滤液导入大孔脱色树脂脱色，大孔脱色树脂为LX-98、LSA-700B、DM130或D303树脂中的一种，优选为LX-98树脂。得到替考拉宁脱色液。

步骤3）吸附：将替考拉宁脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，大孔吸附树脂为HZ816、HZ801、D101或D312树脂中的一种，优选为HZ801树脂。吸附后先用低浓度的溶剂（浓度为体积百分含量15%~20%）进行冲洗，去除杂质，然后用高浓度的溶剂解吸，溶剂为甲醇的水溶液、乙醇的水溶液或丙酮的水溶液的其中的一种，优选为乙醇的水溶液，解析时溶剂浓度为40%~50%（v/v）。解吸后得到替考拉宁解吸液，将解吸液减压浓缩，控制浓缩后替考拉宁的浓度为80g/L~100g/L，然后缓慢加入6~10倍浓缩液体积的结晶溶剂，得到替考拉宁结晶液，结晶液过滤后经真空干燥，得到替考拉宁粗提物。结晶溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，优选为丙酮。

步骤4）层析：将替考拉宁粗提物用水溶解，注入聚合物微球层析柱进行层析，层析后对层析柱进行解析，用洗脱溶剂梯度洗脱，得到单组份洗脱液；

步骤4-A) 将替考拉宁粗提物用蒸馏水溶解，溶解液浓度为100g/L~120g/L，注入聚合物微球层析柱进行层析，层析介质为聚合物微球PS25-300、PS30RPC-300或PSA30-300的其中一种，优选为PS25-300。然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂进行梯度洗脱，分别收集各阶段的替考拉宁洗脱液，对洗脱液进行HPLC检测。洗脱溶剂为甲醇的水溶液、乙醇的水溶液、丙酮的水溶液的其中的一种，优选为甲醇的水溶液。洗脱溶剂浓度为25%~60%（v/v）；

步骤4-B）根据HPLC对替考拉宁中各单组份的检测结果，分别收集TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2的洗脱液；得到三种替考拉宁单组份洗脱液；

步骤4-C）根据HPLC对替考拉宁中各单组份的检测结果，分别收集TA_2-2与TA_2-3的HPLC峰面积百分比为1：2的混合液和TA_2-4与TA_2-5峰面积百分比为1：1的混合液；

步骤4-D）将两种混合液浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球层析柱进行层析分离，然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂进行梯度洗脱，根据HPLC检测结果，分别收集TA_2-3 、TA_2-4和TA_2-5的洗脱液，得到这三种替考拉宁单组份洗脱液。

步骤5）将替考拉宁单组份洗脱液减压浓缩，要求替考拉宁单组份浓缩后浓度均控制在120g/L~150g/L，然后分别缓慢加入6~10倍浓缩液体积的结晶溶剂，得到替考拉宁结晶液，结晶溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，优选为丙酮。结晶液过滤后真空干燥，得到替考拉宁TA_2-1、TA_2-2、TA_2-3、TA_2-4、TA_2-5和TA_3-1六个单组份纯品。

本发明所使用的替考拉宁发酵液为华北制药集团新药研究开发有限责任公司用微生物培养手段，得到的替考拉宁发酵液。大孔树脂D303、HZ816、HZ801、D312，上海华震科技有限公司。大孔树脂D101、DM130，沧州宝恩树脂厂；LX-98、LSA-700B，西安蓝晓公司。聚合物微球PS25-300、PS30RPC-300、PSA30-300，苏州纳微科技公司。甲醇、乙醇、丙酮等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵，Waters公司；INOVA 500型核磁共振仪，Varian公司；ZMD Micromass型质谱仪，Waters公司。

实施例1 

取替考拉宁发酵液5L，发酵单位为2380μg/mL。用氢氧化钠溶液调节发酵液pH至11.5，抽真空过滤。滤液用盐酸溶液调pH7.0，再以2BV/h的流速通过大孔树脂LX-98柱(装量为1200mL)进行脱色。脱色液以2BV/h的流速导入大孔树脂HZ801柱(装量为1200mL)进行吸附富集，吸附完毕先用15%的甲醇的水溶液洗涤，再用40%的甲醇水溶液解吸，解吸流速控制在0.5BV/h，HPLC检测有替考拉宁流出时开始收集解吸液。解吸完毕，50℃减压浓缩解吸液至替考拉宁浓度为80g/L，缓慢加入浓缩液体积6倍量的乙醇结晶。结晶液过滤、干燥得到替考拉宁粗提物12.8g，用HPLC检测，替考拉宁含量为83.2%，粗提收率为89.5%。

实施例2

取替考拉宁发酵液10L，发酵单位为2700μg/mL。用氢氧化钾溶液调节发酵液pH至12.5，离心过滤。滤液用硫酸溶液调pH7.5，再以2BV/h的流速通过大孔树脂LSA-700B柱(装量为3000mL）进行脱色。脱色液以2BV/h的流速导入大孔树脂HZ816柱(装量为3000mL)进行吸附富集，吸附完毕先用20%的乙醇的水溶液洗涤，再用50%的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在0.5BV/h，HPLC检测有替考拉宁流出时开始收集解吸液。解吸完毕，50℃减压浓缩解吸液至替考拉宁浓度为100g/L，缓慢加入浓缩液体积10倍量的丙酮结晶。结晶液过滤、干燥得到替考拉宁粗提物27.4g，用HPLC检测，替考拉宁含量为85.0%，粗提收率为86.3%。

实施例3

取替考拉宁发酵液100L，发酵单位为2620μg/mL。用氢氧化钠溶液调节发酵液pH至12.0，板框过滤。滤液用盐酸溶液调pH7.2，再以2BV/h的流速通过大孔树脂DM130柱(装量为30L)进行脱色。脱色液以2BV/h的流速导入大孔树脂D101柱(装量为30L)进行吸附富集，吸附完毕先用18%的乙醇的水溶液洗涤，再用45%的乙醇水溶液解吸，解吸流速控制在0.5BV/h，HPLC检测有替考拉宁流出时开始收集解吸液。解吸完毕，50℃减压浓缩解吸液至替考拉宁浓度为90g/L，缓慢加入浓缩液体积8倍量的丙酮结晶。结晶液过滤、干燥得到替考拉宁粗提物264g，用HPLC检测，替考拉宁含量为87.1%，粗提收率为87.8%。

实施例4

取替考拉宁发酵液100L，发酵单位为2580μg/mL。用氢氧化钠溶液调节发酵液pH至11.0，板框过滤。滤液用乙酸溶液调pH7.4，再以2BV/h的流速通过大孔树脂D290柱(装量为30L)进行脱色。脱色液以2BV/h的流速导入大孔树脂D312柱(装量为30L)进行吸附富集，吸附完毕先用20%的乙醇的水溶液洗涤，再用48%的丙酮水溶液解吸，解吸流速控制在0.5BV/h，HPLC检测有替考拉宁流出时开始收集解吸液。解吸完毕，50℃减压浓缩解吸液至替考拉宁浓度为90g/L，缓慢加入浓缩液体积9倍量的甲醇结晶。结晶液过滤、干燥得到替考拉宁粗提物257g，用HPLC检测，替考拉宁含量为86.7%，粗提收率为87.0%。

实施例5

取实施例1得到的替考拉宁粗提物12g（其中六种替考拉宁单组份的重量含量分别为TA_3-111.3%、TA_2-12.9%、TA_2-243.0%、TA_2-39.7%、TA_2-49.9%、TA_2-56.4%）用蒸馏水溶解，溶解浓度为100g/L，注入聚合物微球PS25-300柱（装量为1000mL）进行层析分离，依次用含量为30%、50%、60%的甲醇水溶液进行梯度洗脱。根据HPLC的检测结果，分别收集TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁单组份浓度为130g/L，缓慢加入浓缩液体积8倍的丙酮进行结晶，将结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_3-1粉1.1克（HPLC含量为95.4%），TA_2-1粉0.2克（HPLC含量为95.1%），TA_2-2粉2.8克（HPLC含量为98.2%）。收集TA_2-2与TA_2-3HPLC峰面积百分比为1：2（相对百分含量比为1：2）的混合液，减压浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球PS25-300柱（装量为250mL）进行层析分离，依次用40%、50%的甲醇水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集TA_2-3的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁TA_2-3单组份浓度为120g/L，缓慢加入浓缩液体积10倍的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_2-3粉0.6克（HPLC含量为96.2%）。收集TA_2-4与TA_2-5峰面积百分比为1：1（相对百分含量为1：1）的混合液，减压浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球PS25-300柱（装量为250mL）进行层析分离，依次用55%、60%的甲醇水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集TA_2-4和TA_2-5的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁单组份浓度为120g/L，缓慢加入浓缩液体积8倍量的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_2-4粉0.5克（HPLC含量为97.4%），TA_2-5粉0.3克（HPLC含量为95.6%）。层析总收率为51.1%。如图1~6所示，分别为替考拉宁单组份的质谱图；如图7~18所示，分别为替考拉宁单组份的核磁共振图谱。

实施例6

取实施例3得到的替考拉宁粗提物35g（其中六种替考拉宁单组份的重量含量分别为TA_3-112.1%、TA_2-12.9%、TA_2-245.0%、TA_2-310.5%、TA_2-410.2%、TA_2-56.4%）用蒸馏水溶解，溶解浓度为120g/L，注入聚合物微球PS30RPC-300柱（装量为3000mL）进行层析分离，依次用30%、50%、60%的乙醇的水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，分别收集TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁单组份浓度为140g/L，缓慢加入浓缩液体积6倍的丙酮结晶，结晶液经过滤、干燥得到替考拉宁TA_3-1粉3.2克（HPLC含量为95.6%），TA_2-1粉0.6克（HPLC含量为95.3%），TA_2-2粉8.7克（HPLC含量为98.4%）。收集TA_2-2与TA_2-3的混合液（HPLC面积百分比为1:2）减压浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球PS30RPC-300柱（装量为500mL）进行层析分离，依次用40%、50%乙醇的水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集TA_2-3的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁TA_2-3单组份浓度为150g/L，缓慢加入浓缩液体积10倍量的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_2-3粉1.7克（HPLC含量为95.8%）。收集TA_2-4与TA_2-5的混合液（HPLC面积百分比为1:1）减压浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球PS30RPC-300柱（装量为500mL）进行层析分离，依次用55%、60%乙醇的水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集TA_2-4和TA_2-5的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁单组份浓度为150g/L，缓慢加入浓缩液体积10倍量的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_2-4粉1.5克（HPLC含量为96.8%）、TA_2-5粉0.8克（HPLC含量为95.2%）。层析总收率为52.6%。

实施例7

取实施例3得到的替考拉宁粗提物70g（其中六种替考拉宁单组份的重量含量分别为TA_3-112.1%、TA_2-12.9%、TA_2-245.0%、TA_2-310.5%、TA_2-410.2%、TA_2-56.4%）用蒸馏水溶解，溶解浓度为110g/L，注入聚合物微球PSA30-300柱（装量为6000mL）进行层析分离，依次用25%、40%、50%的丙酮的水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，分别收集TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁单组份浓度为140g/L，缓慢加入浓缩液体积7倍量的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_3-1粉6.5克（HPLC含量为96.1%），TA_2-1粉1.2克（HPLC含量为95.7%），TA_2-2粉17.8克（HPLC含量为98.6%）。收集TA_2-2与TA_2-3的混合液（HPLC面积百分比为1:2）减压浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球PSA30-300柱（装量为1000mL）进行层析分离，依次用30%、40%的丙酮的水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集TA_2-3的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁TA_2-3单组份浓度为130g/L，缓慢加入浓缩液体积8倍量的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_2-3粉3.2克（HPLC含量为95.6%）。收集TA_2-4与TA_2-5的混合液（HPLC面积百分比为1:1）减压浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球PSA30-300柱（装量为1000mL）进行层析分离，依次用45%、50%丙酮的水溶液梯度洗脱。根据HPLC检测结果，收集TA_2-4和TA_2-5的HPLC含量大于95%的洗脱液，50℃减压浓缩洗脱液至替考拉宁单组份浓度为120g/L，缓慢加入浓缩液体积10倍量的丙酮结晶，结晶液过滤、干燥得到替考拉宁TA_2-4粉3.0克（HPLC含量为96.4%）、TA_2-5粉1.7克（HPLC含量为95.2%）。层析总收率为53.3%。 

Claims (6)

1.一种替考拉宁单组份的制备方法，其特征在于：该方法包括下述步骤，

步骤1）预处理：在常温条件下，在替考拉宁发酵液中加入碱溶液，调节pH至11.0~13.0；将发酵液固液分离，所得滤液用酸溶液调节pH至7.0~7.5，得到替考拉宁滤液；

步骤2）脱色：将替考拉宁滤液导入大孔脱色树脂进行脱色，得到替考拉宁脱色液；

步骤3）吸附：将替考拉宁脱色液导入大孔吸附树脂进行吸附，再用溶剂解吸，所得替考拉宁解吸液，经浓缩、结晶、干燥，得到替考拉宁的粗提物；

步骤4）层析：将替考拉宁粗提物用水溶解，注入聚合物微球层析柱进行层析，然后用不同浓度的洗脱溶剂梯度洗脱，分别收集各段洗脱液，得到含有TA_2-1、TA_2-2、TA_2-3、TA_2-4、TA_2-5和TA_3-1六种单组份的替考拉宁单组份洗脱液；

步骤5）将六种替考拉宁单组份洗脱液分别浓缩、结晶、干燥，得到替考拉宁的单组份精粉。

2.根据权利要求1所述的一种替考拉宁单组份的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；酸溶液为盐酸、硫酸或有机酸溶液的其中一种。

3.根据权利要求1 所述的一种替考拉宁单组份的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中大孔脱色树脂为LX-98、LSA-700B、DM130或D303树脂的其中一种。

4.根据权利要求1所述的一种替考拉宁单组份的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中大孔吸附树脂为HZ816、HZ801、D101或D312树脂的其中一种；所述溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液的其中一种，溶剂浓度为40%~50%。

5.根据权利要求1所述的一种替考拉宁单组份的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中层析介质为聚合物微球PS25-300、PS30RPC-300或PSA30-300的其中一种；所述洗脱溶剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液的其中一种，洗脱溶剂浓度为25%~60%。

6.根据权利要求1~5任一项所述的一种替考拉宁单组份的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中包括如下步骤，

步骤A) 将替考拉宁粗提物用蒸馏水溶解，注入聚合物微球层析柱进行层析，然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂梯度洗脱；

步骤B）根据HPLC对替考拉宁中各单组份的检测结果，分别收集TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2的洗脱液；得到TA_3-1、TA_2-1和TA_2-2三种替考拉宁单组份洗脱液；

步骤C）根据HPLC对替考拉宁中各单组份的检测结果，分别收集TA_2-2与TA_2-3的HPLC峰面积百分比为1：2的混合液，TA_2-4与TA_2-5峰面积百分比为1：1的混合液；

步骤D）将步骤C）中得到的两种混合液浓缩至混合液浓度为100g/L，再次注入聚合物微球层析柱进行层析分离，然后依次使用从低浓度到高浓度的洗脱溶剂梯度洗脱，根据HPLC检测结果，分别收集TA_2-3 、TA_2-4和TA_2-5的洗脱液，得到TA_2-3 、TA_2-4和TA_2-5三种替考拉宁单组份洗脱液。

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