CN100447147C

CN100447147C - 氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法

Info

Publication number: CN100447147C
Application number: CNB2006101353449A
Authority: CN
Inventors: 陈剑锋
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2006-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2008-12-31
Anticipated expiration: 2026-12-20
Also published as: CN1974586A

Abstract

本发明提供氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法。该方法为将含有氨基糖苷类抗生素的溶液，在pH值8.0～9.5条件下，用大孔吸附树脂吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用4～8倍树脂量(V/V)的30～65%的亲水性溶剂水溶液，以1～3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱氨基糖苷类抗生素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成氨基糖苷类抗生素产品。本发明构思新颖，工艺简单，产品品质高，生产成本低，可应用于不同来源的氨基糖苷类抗生素溶液的进一步分离纯化，具有较大推广性。

Description

氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法

技术领域

本发明涉及一种抗生素的分离纯化方法，更具体涉及一种采用大孔吸附树脂富集纯化分子结构中含有2-脱氧链霉胺的氨基糖苷类抗生素的方法。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是一类结构中含有氨基糖以糖苷键形式与氨基糖环己醇结合的化合物，是继青霉素之后发现较早的一类重要抗生素。目前已报道的天然和半合成氨基糖苷类抗生素的总数已超过3000种，其中微生物产生的天然氨基糖苷类抗生素有近200种，有临床使用价值的30余种，如链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、小诺霉素、核糖霉素、妥布霉素和西索米星等，还有一些半合成的抗生素如丁胺卡那、阿米卡星、奈替米星和依替米星等相继问世，并被用于临床。

根据氨基糖苷类抗生素的分子结构可分为链霉胺衍生物(如链霉素)、2-脱氧链霉胺衍生物(包括4，6-双取代衍生物的卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、小诺霉素和西索米星；4，5-双取代衍生物的新霉素、巴龙霉素和核糖霉素等；单取代衍生物的越霉素)和氨基己醇衍生物(如山梨醇菌素)等。

目前，临床使用的氨基糖苷类抗生素85％以上为分子结构中含有2-脱氧链霉胺的衍生物，且大多都列入中国国家基本药物名录，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌有很强的抗菌作用。在市场上占有相当的份额，中国生产的氨基糖苷类抗生素原料药约占世界产量的70％。因此，研究氨基糖苷类抗生素的制备方法具有一定的指导意义和广阔的市场前景。

含有2-脱氧链霉胺结构的氨基糖苷类抗生素是一种水溶性、多元弱碱性抗生素。通常，分子中含有3～5个氨基和1～2个甲氨基，在水溶液中存在多级离解平衡。因此，氨基糖苷类抗生素在不同pH值的水溶液体系中，能以不同的电化学状态存在，不同价态离子呈现多级解离平衡状态，随着溶液的pH值由高到低而出现逐级解离。较高pH值时，氨基糖苷类抗生素以零价形式存在；中性pH值时，则以低价阳离子形式存在；酸性pH值时，则以高价阳离子形式存在。

由于氨基糖苷类抗生素为多元弱碱性生物有机碱，根据离子交换理论，在酸性和中性条件下，氨基糖苷类抗生素是以阳离子状态存在，可选用阳离子交换树脂提取氨基糖苷类抗生素，但在碱性条件下，尤其是pH值＞8.0时，氨基糖苷类抗生素主要以分子状态存在，宜选用大孔吸附树脂进行分离纯化。

国内生产流通的主要大孔吸附树脂商品，根据树脂骨架的化学组成划分则主要有苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系和氯乙烯系等大孔吸附树脂产品；根据树脂的极性可划分成非极性树脂(如HZ802、HZ803、HZ816、HZ818、DA201、Amberlite XAD-2、Amberlite XAD-4、1300、1400)、弱极性树脂(如HZ801、HZ841、DK110、Amberlite IRC-84、D113)、中等极性树脂(如HZ806、D101、AB-8)和极性树脂(如NKA-9)等大孔吸附树脂产品。

氨基糖苷类抗生素纯品多为白色无定形粉末，是一种水溶性有机生物碱，分子量约为400～800，易溶于热水以及甲醇、乙醇等亲水性溶剂中，微溶于氯仿，在石油醚、苯中不溶；其硫酸盐易溶于水，不溶于有机溶剂。因此，对吸附在大孔树脂上的氨基糖苷类抗生素生物碱，可采用甲醇、乙醇等亲水性溶剂进行洗脱。

发明内容

本发明的目的在于提供氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，该方法不仅设备简单、分离效果好、产品收率高，而且树脂使用寿命长、生产成本低。

本发明的氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法是这样实现的：将含有氨基糖苷类抗生素的溶液，在pH值8.0～9.5条件下，用大孔吸附树脂吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用4～8倍树脂量(V/V)的30～65％的亲水性溶剂水溶液，以1～3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱氨基糖苷类抗生素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成氨基糖苷类抗生素产品。

本发明亲水性溶剂优先选用甲醇或丙酮的主要优点为：虽然甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇等亲水性溶剂对氨基糖苷类抗生素的洗脱效果相当，但相对于其它亲水性溶剂而言，甲醇或丙酮的沸点更低、溶剂回收时能耗更小，能显著降低氨基糖苷类抗生素产品的制备成本。

本发明制备方法的主要优点在于：充分利用了pH值8.0～9.5条件下大孔吸附树脂对目标活性物质氨基糖苷类抗生素的吸附力与对蛋白质、氨基酸、多糖、色素、无机盐等杂质的吸附力的不同，以及氨基糖苷类抗生素与蛋白质、氨基酸、多糖、色素、无机盐等杂质在亲水性溶剂水溶液中溶解度的差异，真正达到了氨基糖苷类抗生素与杂质的高效分离。

具体实施方式

本发明氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，其主要步骤为：含有氨基糖苷类抗生素的溶液，在pH值8.0～9.5条件下，用大孔吸附树脂吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用4～8倍树脂量(V/V)的30～65％的亲水性溶剂水溶液，以1～3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱氨基糖苷类抗生素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成氨基糖苷类抗生素产品。

其中，含有氨基糖苷类抗生素的溶液可以是来源于微生物合成的氨基糖苷类抗生素发酵液滤液滤液、氨基糖苷类抗生素结晶母液和氨基糖苷类抗生素提取液、洗脱液或脱色液中的一种或几种。

大孔吸附树脂可以优先选用聚苯乙烯骨架的HZ801、HZ802、HZ803、HZ806、HZ816、HZ818、HZ841、Amberlite XAD-2、Amberlite XAD-4中的一种或几种，也可以优先选用聚丙烯酸骨架的D101、DK110、Amberlite IRC-84、AB-8、D113中的一种或几种。

亲水性溶剂可以是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂，优先选用甲醇或丙酮。

本发明理化参数测定方法如下：

(1)氨基糖苷类抗生素含量的测定：采用高效液相色谱法，以邻苯二甲醛和巯基乙酸为衍生化试剂，对氨基糖苷类抗生素进行柱前衍生。测定条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-Pak C₁₈色谱柱(Ф4.6×150mm，5μm)，流动相为甲醇∶水∶乙酸(内含庚烷磺酸钠12mmol/L，pH6.3)＝70∶25∶5(V/V/V)，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长250nm。以各种氨基糖苷类抗生素标准品(纯度99％)(购自Sigma公司)为对照。

(2)多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖或D-半乳糖为对照。蛋白质含量测定采用FoLin-酚法，以小牛血清白蛋白为对照。无机离子含量测定采用试剂盒测定，其中SO₄ ^2-的测定采用氯化钡沉淀法，Cl^-定采用硝酸银沉淀法，Ca²⁺和Mg²⁺的测定采用甲基百里香酚蓝络合法。

(3)喷雾干燥条件为：进料液浓度10～20波美度(60℃)，PG-5型喷雾干燥机进口温度160～250℃，出口温度60～110℃，离心转头工作压力1.6～3.0kgf/cm²。

本发明制备方法的实施例陈述如下：

实施例1

pH值为7.36、小诺霉素浓度为0.72g/L的发酵液滤液，用氢氧化钠溶液调pH值至8.0后，采用D101大孔吸附树脂，以2.0倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用4倍树脂量的48％甲醇水溶液(V/V)，以2倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱小诺霉素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成小诺霉素产品。经测定，小诺霉素的回收率90.5％、纯度76.5％。

实施例2

pH值为8.32、妥布霉素浓度为176.2g/L的提取液，用盐酸调pH值至8.0，采用AmberliteXAD-4大孔吸附树脂，在75r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用7倍树脂量的30％甲醇水溶液(V/V)，以3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱妥布霉素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成妥布霉素产品。经测定，妥布霉素的回收率89.8％、纯度75.3％。

实施例3

pH值为7.56、新霉素浓度为12.9g/L的发酵液滤液，用氢氧化钠溶液调pH值至8.2，采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂，以1.2倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用5倍树脂量的65％甲醇水溶液(V/V)，以1倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱新霉素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成新霉素产品。经测定，新霉素的回收率90.1％、纯度77.2％。

实施例4

pH值为7.23、西索米星浓度为1.1g/L的发酵液滤液，用氢氧化钠溶液调pH值至9.3后，采用HZ806大孔吸附树脂，以1.23倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用8倍树脂量的65％乙醇水溶液(V/V)，以3倍树脂量/小时的流流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成西索米星产品。经测定，西索米星的回收率90.9％、纯度78.1％。

实施例5

pH值为9.54、卡那霉素浓度为257.2g/L的结晶母液，用盐酸溶液调pH值至8.7，采用HZ801∶HZ802(2∶1)(V/V)大孔吸附树脂，在75r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用6倍树脂量的49％浓度的甲醇∶乙醇(1∶1)水溶液(V/V)，以1倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱卡那霉素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成卡那霉素产品。经测定，卡那霉素的回收率91.6％、纯度78.3％。

实施例6

pH值为7.58、卡那霉素浓度为8.0g/L的发酵液滤液，用氢氧化钠溶液调pH值至8.6，采用HZ816大孔吸附树脂，在75r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用8倍树脂量的30％乙醇水溶液(V/V)，以2倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱卡那霉素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成卡那霉素产品。经测定，卡那霉素的回收率89.0％、纯度75.2％。

实施例7

pH值为7.39、庆大霉素C1a浓度为1.2g/L的发酵液滤液，用氢氧化钠溶液调pH值至9.5后，采用D113大孔吸附树脂，以1.8倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用4倍树脂量的30％丙酮水溶液(V/V)，以1倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱庆大霉素C1a组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成庆大霉素C1a产品。经测定，庆大霉素C1a的回收率90.8％、纯度76.09％。

实施例8

pH值为7.38、核糖霉素浓度为2.0g/L的发酵液滤液，用氢氧化钠溶液调pH值至8.9，采用HZ801大孔吸附树脂，在105r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用4倍树脂量的65％丙酮水溶液(V/V)，以2倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱核糖霉素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成核糖霉素产品。经测定，核糖霉素的回收率90.4％、纯度72％。

实施例9

pH值为9.05、西索米星浓度为186.7g/L的氨水洗脱液，用氢氧化钠溶液调pH值至9.5后，采用HZ803大孔吸附树脂，以0.25倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于1.5倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用8倍树脂量的55％浓度的甲醇∶丙酮(3∶1)水溶液(V/V)，以3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、真空喷雾干燥成西索米星产品。经测定，西索米星的回收率92.7％、纯度78.5％。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明构思新颖，工艺简单，产品品质高，生产成本低，可用于不同来源的氨基糖苷类抗生素溶液的进一步分离纯化，具有较大的推广意义。

Claims

1.一种氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，其特征在于：将含有氨基糖苷类抗生素的溶液，在pH值为8.0～9.5条件下，用大孔吸附树脂吸附至饱和，先用按体积比不少于1.5倍树脂量的水洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用按体积比4～8倍树脂量的30～65％的亲水性溶剂水溶液，按体积比以1～3倍树脂量/小时的流速洗脱氨基糖苷类抗生素组分，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成氨基糖苷类抗生素产品；所述氨基糖苷类抗生素为小诺霉素、妥布霉素、新霉素、西索米星、卡那霉素、庆大霉素C_1a或核糖霉素中的一种。

2.根据权利要求1所述的氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，其特征在于：所述的喷雾干燥条件为：进料液浓度10～20波美度，所述波美度是在60℃下测的波美度，PG-5型喷雾干燥机进口温度160～250℃，出口温度60～110℃，离心转头工作压力1.6～3.0kgf/cm²。

3.根据权利要求1所述的氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂骨架选用聚苯乙烯或聚丙烯酸。

4.根据权利要求1所述的氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，其特征在于：所述亲水性溶剂是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或几种混合溶剂。

5.根据权利要求1所述的氨基糖苷类抗生素的大孔吸附树脂富集纯化方法，其特征在于：所述含有氨基糖苷类抗生素的溶液为微生物合成的氨基糖苷类抗生素发酵液滤液、氨基糖苷类抗生素结晶母液和氨基糖苷类抗生素提取液、洗脱液或脱色液中的一种或几种。