CN102690333A - 一种高纯度替考拉宁的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度替考拉宁的制备方法，该方法包括将替考拉宁粗品用水或缓冲盐溶液溶解，加样至装有纳米聚合物微球的色谱柱，使用极性溶剂与水的混合液进行梯度解析，得到各组分及杂质比例符合要求的替考拉宁解析液，经活性炭脱色或树脂脱色，纳滤脱盐浓缩，结晶、过滤、干燥等步骤，得到高纯度、比例可控的替考拉宁精粉。该方法工艺简洁，样品处理量大，溶剂消耗少，可以规模化制备药用级替考拉宁精粉。

Description

一种高纯度替考拉宁的制备方法

技术领域

本发明涉及一种工业微生物技术领域中药品原料的制备方法，尤其是一种从发酵培养物制取的替考拉宁粗品制备高纯度替考拉宁的方法。 

背景技术

替考拉宁（Teicoplanin）为游动放线菌属发酵产生的一种糖肽类抗生素，是继万古霉素后开发的新一代糖肽类抗生素，是目前国内临床上最为看好的抗耐药抗生素之一，与万古霉素比较具有更强的脂溶性、半衰期更长，具有良好的体液分布性、药物不良反应轻，可静脉或肌肉给药，应用更方便。 

替考拉宁的作用机制与万古霉素和其它糖肽类抗生素相似，首先非特异性地与细胞壁的外层结构相结合，然后与细胞壁肽聚糖合成的前体UDP-N-乙酰壁氨酸所接五肽的最后两个氨基酸形成的二肽D-丙氨酰-D-丙氨酸特异性结合，抑制细胞壁的生物合成，从而阻碍细菌的生长。同时替考拉宁导致细胞内UDP-N-乙酰壁氨酰五肽的积累，对细菌的生长同样具有抑制作用。替考拉宁主要对革兰氏阳性的需氧或厌氧球菌具有较强的抗菌活性且耐药菌株少，临床上，对皮肤和软组织感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎等深度感染的有效率达80%~90%，同时它与β-内酰胺、氨基糖苷类和碳青霉烯类抗生素联用，对绝大多数革兰氏阳性菌有协同杀菌作用。因此，对替考拉宁的研制与开发具有重要的经济价值和应用前景。 

替考拉宁主要由A_2-1、A_2-2、A_2-3、A_2-4、A_2-5和A_3-16个结构近似的替考拉宁单组份组成。欧洲药典对各组分比例有明确规定，A₂组之和不小于80.0%，其中A_2-2为35.0%~55.0%，A_2-1、A_2-3、A_2-4、A_2-5均不大于20.0%，A_3-1不大于 15.0%，不纯组分不大于5.0%；中国药典对A₂各组分比例未做规定。 

替考拉宁单组份的结构式 

                                                            

      

    

中国专利CN 101302248A公开了一种高纯度替考拉宁的生产方法，需要对替考拉宁粗品进行凝胶层析、大孔树脂分离、脱色、超滤、纳滤、结晶过程，可得到纯度大于93.1%的替考拉宁精粉，但步骤繁琐，而且只控制A₂组比例，未提及到对A₃和A₂各组分的比例控制。美国专利US2005245481A1公开了一种替考拉宁的生产工艺，对大孔树脂粗提液进行活性炭脱色、再次树脂分离、超滤、纳滤、结晶，可得到纯度大于95%的替考拉宁精粉，但是对于A₂各组分比例不能很好的控制，对于生产符合欧洲药典标准的替考拉宁精粉具有较高难度。

微球（microsphere）是指药物分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。制备微球的载体材料主要为天然高分子微球和合成聚合物微球。其中纳米聚合物微球具有刚性大，耐受有机溶剂性能好，pH值的适用范围广等优点，其粒径分布均一、且粒径可控，在实际的层析分离过程中可以有效避免沟流、压力不稳定等缺点，此外，它还具有很大的比表面积，最高可达1000 m²/g以上，在高流速下可以获得更高的分辨率、载量和更低的反压，因此纳米聚合物微球适用于药物的分离和提纯。同葡聚糖凝胶相比较，纳米聚合物微球的骨架结构具有更高的机械强度和化学稳定性，可以更适合能经受高流速高压力操作的液相色谱使用。 

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种制备高纯度、组分比例可控的替考拉宁精粉的方法，该方法工艺简单、质量可靠，可生产药用级替考拉宁原料。 

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 

一种高纯度替考拉宁的制备方法，该方法包括：

步骤1）预处理：将替考拉宁粗品溶解于水或缓冲盐溶液中，制成替考拉宁粗粉溶液；

步骤2）层析：将替考拉宁粗粉溶液加样至纳米聚合物微球色谱柱进行层析，使用极性溶剂和水的混合溶液梯度解析，分段收集替考拉宁解析液，检测各段解析液中各单组分的含量，根据对单组分含量的要求合并解析液，得到替考拉宁各单组份符合要求的替考拉宁解析液；

步骤3）脱色：将替考拉宁解析液加入活性炭或树脂柱中，进行脱色处理，得到替考拉宁脱色液；

步骤4）将替考拉宁脱色液经截留分子量为100Da~800Da的纳滤膜过滤，得到纳滤浓缩液；纳滤浓缩液经结晶、干燥，得纯度大于95.0%的替考拉宁精粉。

本发明的进一步改进在于：所述纳米聚合物微球是聚苯乙烯及其衍生物微球。 

本发明的进一步改进在于：所述纳米聚合物微球为PS-30型纳米聚合物微球或PSA-30型纳米聚合物微球。 

本发明的进一步改进在于：所述步骤2）中极性溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇的其中一种；极性溶剂和水的混合溶液中极性溶剂的体积百分含量为25%~70%。 

本发明的进一步改进在于：所述步骤3）中活性炭为针用活性炭、糖用活性炭的其中一种或两种的混合物；树脂为大孔吸附树脂或离子交换树脂。 

本发明的进一步改进在于：所述步骤4）中纳滤膜是截留分子量为300Da~800Da的纳滤膜。 

本发明的进一步改进在于：所述步骤4）中结晶时使用丙酮做为结晶溶剂，丙酮的加入量为纳滤后纳滤浓缩液体积的5~15倍。 

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于： 

本发明提供的一种高纯度替考拉宁的制备方法，有预处理、层析、脱色、结晶等步骤，工艺简单，质量可靠，适于工业化规模生产高纯度的替考拉宁。制备的替考拉宁精粉纯度高，单组分的含量可控，产品符合欧洲药典的相关规定。

本发明首次采用纳米聚合物微球分离纯化替考拉宁粗品。首先将替考拉宁粗品溶液加样至纳米聚合物微球色谱柱进行层析，然后进行梯度解析，分段收集，通过检测各段的替考拉宁解析液中各单组分的含量，根据对单组分含量的要求合并解析液，可以得到替考拉宁各单组份符合要求的替考拉宁解析液。使用纳米聚合物微球进行层析，可大幅度提高产品的纯度，其中替考拉宁的含量可达95.0%以上。通过梯度解析，可以有效地去除发酵代谢过程产生的杂质，并且通过检测分段收集的解析液，使得到的替考拉宁解析液中A₂和A₃各组分比例符合要求。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。 

本发明一种高纯度替考拉宁的制备方法，包括下述步骤： 

步骤1）预处理：将替考拉宁的发酵液经大孔树脂吸附浓缩、结晶后，制得替考拉宁粗品；将替考拉宁粗品用水溶解或用pH值为2~5的缓冲盐溶液溶解，制成替考拉宁粗粉的水溶液或缓冲盐溶液；其中缓冲盐溶液优选用10%~35%(v/v)甲醇或乙醇配制的pH3.5的磷酸-磷酸氢二铵溶液。

步骤2）层析：将替考拉宁粗粉溶液加样至装有纳米聚合物微球的色谱柱；依次使用浓度由低到高的极性溶剂与水的混合液进行梯度解析，分段收集解析液，并进行高效液相色谱（HPLC）检测，得出各段解析液中A_2-1、A_2-2、A_2-3、A_2-4、A_2-5和A_3-16种替考拉宁单组份的含量，根据A₂和A₃各单组分比例的要求，合并解析液，使合并后的替考拉宁解析液中，A₂组和A₃组各单组分含量符合要求。其中纳米聚合物微球是采用聚苯乙烯及其衍生物制备的，进一步优选为PS-30型纳米聚合物微球或PSA-30型纳米聚合物微球。梯度解析时使用的极性溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇，优选为甲醇、乙醇。极性溶剂在混合溶液中的体积百分含量为25~70%，优选25%~60%。 

步骤3）脱色：将合并后的替考拉宁解析液加入到活性炭或树脂柱中，进行活性炭脱色或树脂脱色，得到替考拉宁脱色液。其中活性炭为针用活性炭、糖用活性炭的其中一种或两种的混合物，优选针用活性炭与糖用活性炭的混合物。树脂为大孔吸附树脂或离子交换树脂，优选离子交换树脂。 

步骤4）将替考拉宁脱色液经截留分子量为100Da~800Da的纳滤膜过滤，脱去盐分和溶剂，浓缩至替考拉宁纳滤浓缩液的浓度为20000~60000μg/mL。向替考拉宁纳滤浓缩液中缓慢加入丙酮，丙酮的加入量为纳滤浓缩液体积的5~15倍，析出替考拉宁固体；经过滤、干燥后得到替考拉宁精粉。优选纳滤膜是截留分子量为300Da~800Da的纳滤膜。 

本发明所使用的替考拉宁粗品为华北制药集团新药研发有限责任公司用微生物培养，经大孔吸附树脂吸附解析得到的。聚合物微球为苏州纳微科技公司生产。乙醇、甲醇等试剂均为市售。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵（Waters公司）。 

实施例1 

取替考拉宁粗品10g，纯度81.4%，用60mL去离子水溶解，制成替考拉宁粗品的水溶液。将粗品水溶液加样于PSA-30型纳米聚合物微球色谱柱，色谱柱尺寸为Ф5.5×50cm，装量为1000mL。使用1000mL 25%（v/v）浓度的乙醇水溶液作为流动相洗涤，后用60%浓度的乙醇作为流动相洗涤至替考拉宁解析完毕，控制乙醇流速为1500mL/h。分段收集解析液，根据对各段解析液中替考拉宁单组份的HPLC检测结果，合并解析液，使六种单组分的含量及A₂和A₃组比例符合欧洲药典的规定，得到解析液1570mL。将解析液通过装量100mL的D301型离子交换树脂柱，进行脱色处理，控制解析液的流速为350mL/h，得到替考拉宁脱色液。脱色液用截留分子大小为600Da的卷式纳滤膜过滤浓缩，补加去离子水，脱去乙醇至乙醇浓度小于1%，浓缩后体积120mL，替考拉宁的纳滤浓缩液浓度为30000μg/mL，在搅拌的条件下向浓缩液中缓慢加入960mL丙酮，析出替考拉宁的结晶。过滤后，得到替考拉宁湿粉。湿粉在45℃下真空干燥，得到6.6g白色替考拉宁精粉。替考拉宁纯度95.6%，其中各组分含量比例如表1所示。制得的产品符合欧洲药典的规定。

实施例2 

取替考拉宁粗品10g，纯度82.6%，加入50mL pH3.5的磷酸-磷酸氢二铵溶液中。配制磷酸-磷酸氢二铵溶液是用5‰浓度的磷酸氢二铵在30%的甲醇中溶解，后用磷酸调节至pH值为3.5。替考拉宁溶解后，制成替考拉宁粗粉的缓冲盐溶液，将溶液加样于PS-30型纳米聚合物微球色谱柱（Ф5.5×50cm），装量为1000mL。使用1000mL 30%浓度甲醇作为流动相洗涤，60%浓度甲醇作为流动相洗涤至替考拉宁完毕，流速为1500mL/h，根据HPLC检测结果合并解析液，使各组分比例符合规定，得到解析液1370mL。向解析液中加入8.7g针用活性炭、8.7g糖用活性炭，室温下搅拌30min，过滤。得到替考拉宁脱色液，脱色液用截留大小为300Da的卷式纳滤膜浓缩，补加去离子水，脱去甲醇与盐分，至甲醇浓度小于1%，浓缩后体积105mL，纳滤浓缩液浓度为50000μg/mL。搅拌下向浓缩液中加入945mL丙酮，过滤，湿粉在45℃下真空干燥，得到6.8g白色替考拉宁精粉，纯度96.5%，各组分比例如表1所示。

实施例3 

取替考拉宁粗品10g，纯度79.2%，加入50mL的磷酸-磷酸氢二铵溶液（用5‰浓度磷酸氢二铵在20%乙醇中溶解，用磷酸调节至pH值2.5）中。溶解后加样于PS-30型纳米聚合物微球色谱柱（Ф5.5×50cm），装量为1000mL，使用1000mL 25%浓度乙醇作为流动相洗涤，55%浓度乙醇作为流动相洗涤至替考拉宁完毕，流速为1500mL/h，根据HPLC检测结果合并解析液，使各组分比例符合规定，得到解析液1025mL，向解析液中加入10g针用活性炭、10g糖用活性炭，室温下搅拌30min，过滤，脱色液用截留大小为400Da的卷式纳滤膜浓缩，补加去离子水，脱去乙醇与盐分，至乙醇浓度小于1%，浓缩后体积105mL，纳滤浓缩液浓度为60000μg/mL。搅拌下向浓缩液中加入1050mL丙酮，过滤，湿粉在45℃下真空干燥，得到6.7g白色替考拉宁精粉，纯度95.1%，各组分比例如表1所示。

实施例4 

取替考拉宁粗品10g，纯度79.6%，加入50mL pH3.5的磷酸-磷酸氢二铵溶液（用5‰浓度的磷酸氢二铵在10%的甲醇中溶解，用磷酸调节至pH值为4.5）中。制成替考拉宁粗粉的缓冲盐溶液，将溶液加样于PSA-30型纳米聚合物微球色谱柱（Ф5.5×50cm），装量为1000mL。依次使用500mL 25%浓度的异丙醇和500mL 40%浓度的异丙醇作为流动相洗涤，最后用65%浓度的异丙醇作为流动相洗涤至替考拉宁完毕，流速为1500mL/h，根据HPLC检测结果合并解析液，使各组分比例符合规定，得到解析液1560mL。将解析液通过装量100mL的LX-98型大孔吸附树脂柱，进行脱色处理，控制解析液的流速为350mL/h，得到替考拉宁脱色液。脱色液用截留大小为500Da的卷式纳滤膜浓缩，补加去离子水，脱去异丙醇与盐分，至异丙醇浓度小于1%，浓缩后体积120mL，纳滤浓缩液浓度为40000μg/mL。搅拌下向浓缩液中加入720mL丙酮，过滤，湿粉在45℃下真空干燥，得到6.6g白色替考拉宁精粉，纯度96.5%，各组分比例如表1所示。

表1   实施例1~4中替考拉宁精粉中各组分及单组分含量 

 

Claims (7)

1.一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：该方法包括，

步骤1）预处理：将替考拉宁粗品溶解于水或缓冲盐溶液中，制成替考拉宁粗品溶液；

步骤2）层析：将替考拉宁粗品溶液加样至纳米聚合物微球色谱柱进行层析，使用极性溶剂和水的混合溶液梯度解析，分段收集替考拉宁解析液，检测各段解析液中各单组分的含量，根据对单组分含量的要求合并解析液，得到替考拉宁各单组份符合要求的替考拉宁解析液；

步骤3）脱色：将替考拉宁解析液加入活性炭或树脂柱中，进行脱色处理，得到替考拉宁脱色液；

步骤4）将替考拉宁脱色液经截留分子量为100Da~800Da的纳滤膜过滤，得到纳滤浓缩液；纳滤浓缩液经结晶、干燥，得到纯度大于95.0%的替考拉宁精粉。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：所述纳米聚合物微球是聚苯乙烯及其衍生物微球。

3.根据权利要求2所述的一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：所述纳米聚合物微球为PS-30型纳米聚合物微球或PSA-30型纳米聚合物微球。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中的极性溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇的其中一种；极性溶剂和水的混合溶液中极性溶剂的体积百分含量为25%~70%。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中活性炭为针用活性炭、糖用活性炭的其中一种或两种的混合物；树脂为大孔吸附树脂或离子交换树脂。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中纳滤膜是截留分子量为300Da~800Da的纳滤膜。

7.根据权利要求1所述的一种高纯度替考拉宁的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中结晶时使用丙酮做为结晶溶剂，丙酮的加入量为纳滤浓缩液体积的5~15倍。