CN104910259A - 一种替考拉宁的层析纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种替考拉宁的层析提纯方法,所述层析提纯方法是,用单分散甲基丙烯酸酯微球为柱层析填料,将替考拉宁溶液上样到色谱柱后,以甲醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的替考拉宁。本发明不但能够高纯度和高回收率地对替考拉宁进行层析纯化,而且流动相使用量小,纯化时间短,从而大大缩短生产周期。
Description
技术领域
本发明涉及药物纯化领域,特别是一种替考拉宁的纯化方法。
背景技术
替考拉宁(teicoplanin),又名太古霉素或肽可霉素。是从替考游动放线菌属(Actinoplanes teichomyceticus nov.sp.ATCC第31121号)发酵液中提取得到的糖肽类物质,它是继万古霉素之后的又一目前临床治疗多重耐药菌感染的重要抗生素。替考拉宁的抗菌活性机理是,与敏感细菌细胞壁前体肽聚末端的丙氨酰丙氨酸有高亲和力,通过与之结合,阻断构成细菌细胞壁的高分子肽聚糖合成,导致细胞壁缺损而杀灭细菌。此外,替考拉宁也可能改变细菌细胞膜渗透性,并选择性地抑制RNA的合成。替考拉宁作用特点是:对大多数金黄色葡萄球菌的作用强于万古霉素,对表皮葡萄球菌的作用与万古霉素相似;但对肠球菌杀菌作用弱于去甲万古霉素。由于替考拉宁独特的作用机制,很少出现耐替考拉宁的菌株。所以替考拉宁对青霉素类及头孢菌素类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类、利福平耐药的革兰阳性菌仍有较好的抗菌活性。
替考拉宁主要由A2-1、A2-2、A2-3、A2-4、A2-5和A3-1 6个结构相近的单一组分组成。欧洲药典对各个组分做出了明确的规定,A2组之和不小于80.0%,其中A2-2为35.0%~55.0%,A2-1、A2-3、A2-4、A2-5均不大于20.0%,A3-1不大于15.0%,不纯组分不大于5.0%。替考拉宁的结构式如下:
替考拉宁现已普遍使用液相层析法进行提纯,如中国专利CN101302248A、美国专利US2005245481A1等,但这些专利对于A2各组分比例不能很好的控制,不能达到欧洲药典的标准,并且所使用的流动相用量大,提纯时间长,从而导致生产周期被拉长。
发明内容
本发明的目的是提供一种替考拉宁的层析纯化方法,不仅达到高纯度和高回收率,而且流动相使用量小,纯化时间短,从而大大缩短生产周期。
为达到上述目的,本发明的技术方案是:一种替考拉宁的层析纯化方法,所述层析提纯方法是,用单分散甲基丙烯酸酯微球为柱层析填料,将替考拉宁溶液上样到色谱柱后,以甲醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的替考拉宁。
优选的,所述单分散甲基丙烯酸酯微球是40-500。
优选的,所述甲醇水溶液是35%的甲醇水溶液,其中含50mM磷酸二氢钠,以氢氧化钠调溶液pH 6.0。
40-500是甲基丙烯酸酯通过聚合形成的粒径40um、孔径的单分散微球,由于微球基质的化学组成不同,聚甲基丙烯酸酯基质微球的疏水性弱于聚苯乙烯基质的微球。正是由于40-500特定的微球形态、孔径、孔容、粒径、表面功能团及聚合交联度等的不同,使其作为层析填料或高效液相色谱填料时,具有更优异的耐冲击性、耐高压性及耐老化性,同时具有载量高、脱色效果好等优势。在纯化替考拉宁时,以40-500作为色谱柱的固定相,只需要低浓度的有机相的水溶液及较少量的流动相就可以将吸附在填料上的替考拉宁洗脱下来,达到高纯度及高回收率,同时有很好的脱色效果。
含50mM磷酸二氢钠、以氢氧化钠调溶液pH 6.0的甲醇水溶液,能够更好地把填料上的替考拉宁洗脱下来。
本发明应用单分散甲基丙烯酸酯介质40-500作为柱层析的填料,以含50mM磷酸二氢钠、以氢氧化钠调pH 6.0的甲醇水溶液为流动相,不但能够高纯度和高回收率地对替考拉宁进行层析纯化,而且流动相使用量小,纯化时间短,从而大大缩短生产周期。
附图说明
图1是单分散甲基丙烯酸酯微球40-500的光学显微镜照片。
图2是实施例1中纯化前的替考拉宁粗品的HPLC分析图谱。
图3是实施例1中纯化后的替考拉宁的HPLC分析图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述,但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
以40-500为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,40-500(苏州纳微科技有限公司生产)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的78.6%,上样110ml,色谱柱载量为40mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH 6.0)冲洗15个柱体积(BV),收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的90.6%,回收率为80.5%。
实施例2
以40-500为层析介质做替考拉宁的纯化:采用36*460mm玻璃色谱柱,40-500(苏州纳微科技有限公司生产)为层析填料装填层析柱,装柱体积842ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的77.9%,上样1684ml,色谱柱载量为为40mg/ml。上样后,以40ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH 6.0)冲洗15BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的88.4%,回收率为78.3%。
实施例3
以40-300为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,40-300(苏州纳微科技有限公司生产)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的79.1%,上样110ml,色谱柱载量为40mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH 6.0)冲洗21BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的87.6%,回收率为75.5%。
实施例4
以AmberliteTM XAD 1180为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,AmberliteTM XAD 1180(罗门哈斯的商标)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的78.2%,上样67.5ml,色谱柱载量为为30mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH 6.0)冲洗30BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的83.4%,回收率为36.8%。
实施例5
以AmberliteTM XAD 1600为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,AmberliteTM XAD 1600(罗门哈斯的商标)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的77.8%,上样67.5ml,色谱柱载量为30mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH 6.0)冲洗28BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的84.1%,回收率为32.4%。
实施例6,
以AmberliteTM XAD 7HP为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,AmberliteTM XAD 7HP(罗门哈斯的商标)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的78.5%,上样67.5ml,色谱柱载量为为30mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH6.0)冲洗32BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的82.8%,回收率为37.2%。
实施例7,
以HZ801为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,HZ801(上海华振)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的78.1%,上样110ml,色谱柱载量为为30mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH 6.0)冲洗27BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的81.4%,回收率为38.8%。
实施例8,
以HP20为层析介质做替考拉宁的纯化:采用15*310mm玻璃色谱柱,HP21(三菱化学生产)为层析填料装填层析柱,装柱体积55ml。替考拉宁粗品水溶液浓度为20mg/ml,样品经过0.45um滤膜过滤后经高效液相分析,替考拉宁A2的峰面积为总面积的78.4%,上样67.5ml,色谱柱载量为为30mg/ml。上样后,以10ml/min用35%的甲醇水溶液(含50mM磷酸二氢钠,氢氧化钠调pH6.0)冲洗35BV,收集被洗脱下来的替考拉宁,经高效液相分析,洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的82.9%,回收率为40.7%。
表1将实施例1~8的载量、纯度、收率和流动相消耗量做了比较,其中实施例1、2用40-500为填料,实施例3用40-300为填料,实施例4~8采用市面上可得的其他层析介质为填料来进行纯化,结果表明,实施例4~8不仅在纯化后的最高纯度上低于本发明所用的层析介质的纯化结果,收率低,而且溶剂消耗量大,纯化周期长。
表1各实施例的纯度、收率和流动相消耗量比较
本发明以单分散甲基丙烯酸酯介质作为柱层析的填料,以含50mM磷酸二氢钠、以氢氧化钠调pH 6.0的甲醇水溶液为流动相,不但能够高纯度和高回收率地对替考拉宁进行层析纯化,而且流动相使用量小,纯化时间短,从而大大缩短生产周期。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种替考拉宁的层析纯化方法,其特征在于,所述层析提纯方法是,用单分散甲基丙烯酸酯微球为柱层析填料,将替考拉宁溶液上样到色谱柱后,以甲醇水溶液为流动相洗脱吸附在填料上的替考拉宁。
2.如权利要求1所述的替考拉宁的层析纯化方法,其特征在于,所述单分散甲基丙烯酸酯微球是PMM 40-500。
3.如权利要求1所述的替考拉宁的层析纯化方法,其特征在于,所述甲醇水溶液是35%的甲醇水溶液,其中含50mM磷酸二氢钠,以氢氧化钠调溶液的pH 6.0。
4.如权利要求1所述的一种替考拉宁的层析纯化方法,其特征在于,所述流动相的洗脱量为12-18个柱体积。
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