CN107434823A

CN107434823A - 一种奥利万星中间体a82846b的纯化方法

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Publication number: CN107434823A
Application number: CN201710377633.8A
Authority: CN
Inventors: 陈舟舟; 王宏伟; 彭洁; 李劲; 张也; 湛滢; 任宏杰; 齐艳艳; 崔亚顺
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN107434823B

Abstract

本发明提供了一种奥利万星中间体A82846B的纯化方法。具体而言，该方法包括，将A82846B发酵液上样至离子交换树脂层析柱，经洗脱分离，得到第一洗脱液；再将第一洗脱液上样至以硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱，先进行杂质洗脱，再进行样品洗脱收集第二洗脱液，所获得A82846B纯度大于80％。本发明所述方法不仅能保证产品的品质，而且适合于扩大的商业化市场。同时，本发明还提供了制备奥利万星中间体A82846B盐的方法，以及利用A82846B盐合成奥利万星的方法。

Description

一种奥利万星中间体A82846B的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种抗生素的分离纯化方法，具体而言，涉及一种奥利万星中间体A82846B分离纯化方法，利用以硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱对含A82846B发酵液进行柱层析纯化分离，获得高纯度的奥利万星中间体A82846B。

背景技术

A82846B是一种天然的糖肽，是从土壤中分离的Kibdelosporangium aridum(拟孢囊属)的发酵产物，该糖肽的化学结构除多含一个4-表-万古胺(4-epi-Vancosamine)外与万古霉素相似，分子式是C75H91Cl₂N₉O₂₅，其抗菌活性比万古霉素大4～8倍，其阻断细胞壁合成的作用机理与其他糖肽如万古霉素和Teicoplanin相同，结构如下：

奥利万星(oritavancin)是以A82846B为前体的半合成糖肽类抗生素。奥利万星是最初由美国礼来公司研发，后转让给美国Targanta Therapeutics生物制药公司，对革兰阳性菌有广谱抗菌效果(包括耐万古霉素细菌)，用于治疗皮肤感染、肺炎球菌感染和全身感染的适应征。2014年8月7日FDA批准抗生素Orbactiv(oritavancin，奥利万星)注射液，用于由革兰氏阳性菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA)导致的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSIs)成人患者的治疗。Orbactiv是FDA批准用于治疗的首个和唯一单剂量治疗方案的抗生素。同时，奥利万星作为首个上市的单剂量治疗方案的二代半合成糖肽类抗生素，作用机制与万古霉素、达巴万星和替考拉宁相似，但是，因其生物活性更强，半衰期更长，从而具有诱人的开发前景。随着耐药菌的不断出现，具有良好抗MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和VRE(耐万古霉素肠球菌)作用的抗生素的开发速度却十分的缓慢。因此，奥利万星的出现给临床治疗耐药菌带来了新的希望和突破，而目前，A82846B主要由美国Targanta Therapeutics生物制药公司通过发酵进行生产，但由于A82846B发酵液中存在较多的杂质，尤其是A82846B结构类似物较多，使得纯度普遍不高，要达到色谱纯度美国药典标准有一定的难度。

近些年随着各种介质的色谱分离技术的发展，该技术在分离纯化糖肽类抗生素上得到了广泛的应用。

WO2006061166采用粒径5um的反相硅胶(Octadecyl silica gel)作为色谱介质，以含5mM醋酸铵且pH调节为4.0的3％甲醇溶液作为流动相，同时在流动相中加入2％的戊醇作为解析剂，进而分离获得色谱纯度大于97.5％的盐酸万古霉素。

CN101440127A采用离子交换填料葡聚糖凝胶Sephadex CM-25、琼脂糖SPSepharose或琼脂糖CM Sepharose进行色谱层析，以流动相为4-6％的碳酸氢铵，得到色谱纯度大于95％，小于98％的盐酸万古霉素，再通过加入氯化钠溶液进行盐析沉淀，分离并用乙醇顶洗，烘干得到盐酸万古霉素成品。

CN87106483A采用硅胶LP-1/C18作为色谱载体，以含1％NH₄H₂PO₄的乙腈-水溶液进行梯度洗脱，进而分离获得奥利万星中间体A82846A。而CN1119649A采用water C18Nova-pak柱反相制备A82846B衍生物。

虽然，上述文献都或多或少给出奥利万星中间体类似物的纯化方法或思路，但是由于A82846B发酵液中存在较多的杂质，尤其是A82846B结构类似物较多，为此，上述文献的方法并不能提供高纯度的奥利万星中间体，同时适用于商业化生产的需要，鉴于此，开发一种制备奥利万星中间体A82846B新的方法是非常有必要的。

发明内容

本发明提供了一种奥利万星中间体A82846B的纯化方法，包括：将A82846B发酵液上样至离子交换树脂层析柱，经流动相洗脱分离，得到第一洗脱液；再将第一洗脱液上样至以硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱，先进行杂质洗脱，再进行样品洗脱收集第二洗脱液。

其中，所述C18硅胶的粒径为5-60μm，比表面积在100-300m²/g，所述聚苯乙烯聚合物的粒径为20-100μm，比表面积在500-1200m²/g。

进一步而言，所述杂质洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选甲醇水溶液。所述杂质洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，具体实施例中磷酸盐为磷酸二氢铵或磷酸三铵，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％。

所述样品洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选异丙醇水溶液。

所述样品洗脱所用流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，具体实施例中磷酸盐为磷酸二氢铵或磷酸三铵，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％，优选1-2wt.％。

所述A82846B发酵液可为直接经发酵流程后所获得的发酵液，也可为澄清后的，不论何种发酵液上样至离子交换色谱柱上，经流动相洗脱分离，都可得到第一洗脱液。

本发明所述第二洗脱液中A82846B纯度大于80％，优选大于90％，具体实施例中A82846B纯度为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。进一步而言，为了获得更高纯度A82846B，可将第二洗脱液连续1次以上经过以硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱而获得。其中，可选择但不限于，将两个硅胶C18填料的反相色谱柱串联使用或将硅胶C18填料的反相色谱柱与聚苯乙烯聚合物填料的反相色谱柱串联使用，又或者将两个聚苯乙烯聚合物填料的反相色谱柱串联使用。

本发明所述硅胶C18为十八烷基键合硅胶填料，所述硅胶C18填料可选自但不选于塞分科技公司的HP-C18、上海大友色谱技术公司的DYB71306、纳微公司的Unisil C18，优选塞分科技公司的HP-C18。

本发明所述聚苯乙烯聚合物又称为聚苯乙烯-二乙烯苯树脂，所述聚苯乙烯聚合物填料可选自但不限于罗门哈斯公司的CG161m、CG161s和XAD1600、上海华震公司的色谱3号、HZ830、日本三菱公司的HP20和HP20SS，优选为日本三菱公司的HP20SS。

在研究中我们发现由于A82846B与离子交换树脂层析柱填料间存在特殊的分子作用力，上样时A82846B不易于吸附或载负于填料上，而洗脱时又不易洗脱下来，这样既影响填料的使用量，又损耗A82846B。通常技术人员会选用较高浓度的氨水进行洗脱，而在实验过程中，这样会导致更多的杂质产生，不利于最终的纯化工作。为此，我们选择控制A82846B发酵液上样时温度和经流动相洗脱分离时温度，其中通过控制洗脱时流动相的温度而达到控制洗脱分离时温度。进一步而言，本发明所述发酵液上样时发酵液温度为30-60℃，具体实施例中可为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，所述洗脱分离时流动相温度为50-60℃，具体实施例中可为50℃、52℃、55℃、57℃、60℃。

本发明所述方法还包括第一洗脱液上样前含有pH调节步骤，所述pH＝6.0-9.0，优选pH＝7.5-8.8，具体实施例中pH可为7.5、7.7、7.9、8.1、8.3、8.5、8.8，这样利于样品载负于层硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱，并且确保载负过程中样品的稳定性。

由于A82846B发酵液中存在较多无机性杂质，为了避免发酵液直接上样对离子交换树脂层析柱的物理影响，本发明所述方法还包括A82846B发酵液上样前经固液分离，所述固液分离采用板框压滤、陶瓷膜澄清或连续流离心澄清的方式。所述的陶瓷膜优选孔径0.1-0.2μm、陶瓷膜澄清优选的顶洗体积为3-5倍发酵液体积的pH 9.0-12的氨水水溶液、连续流离心优选的转速4000-6000rpm/min。

本发明所述离子交换树脂层析柱所用的树脂为聚苯乙烯-二乙烯苯系大孔型阳离子树脂，其粒度为300-1200μm，可选自但不限于上海华震树脂公司的HD-8型树脂、安伯莱特树脂公司的FPC22型树脂、安伯莱特树脂公司的FPC23型树脂、日本三菱树脂公司的PK208型树脂，优选为安伯莱特树脂公司的FPC23型树脂、日本三菱树脂公司的PK208型树脂。

本发明所述第一洗脱液上样时流动相洗脱流速为0.5-2.0BV/h，较佳的为1.0BV/h，所述第一洗脱液上样后杂质洗脱时流动相流速4-5BV，所述第一洗脱液洗脱时流动相流速为2-4BV，其中所述的柱体积BV为树脂或填料的湿体积。

本发明所述方法在A82846B发酵液固液分离前还含有发酵液pH调节步骤，便于放线菌分泌的A82846B充分释放到细胞外。所述pH＝9.0-12，优选pH＝10-11，具体实施例中pH可选为10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0。

本发明所述方法还包括将第二洗脱液脱盐的步骤，所述脱盐步骤可采用纳滤、超滤或过树脂柱的方式中一种或多种。其中所述树脂柱可选自但不限于罗门哈斯公司的XAD-1600树脂、上海华震公司的色谱3号和HZ830树脂，优选罗门哈斯公司的XAD-1600树脂。

具体而言，本发明提供一种奥利万星中间体A82846B的纯化方法，包括：

a)调节含有A82846B发酵液的pH＝9.0-12，再经固液分离得澄清发酵液；

b)将澄清发酵液上样至离子交换树脂层析柱，经洗脱分离，得到第一洗脱溶液；

c)将第一洗脱溶液上样至以硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱，先进行杂质洗脱，再进行样品洗脱收集第二洗脱液，优选所述第二洗脱液中A82846B纯度大于80％；

其中,所述杂质洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选甲醇水溶液，所述杂质洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％，所述样品洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选异丙醇水溶液，所述样品洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％，优选1-2wt.％。

本发明所述纯化方法a)步骤中固液分离采用板框压滤、陶瓷膜澄清或连续流离心澄清的方式。

本发明所述b)步骤中A82846B发酵液上样时温度为30-60℃，所述洗脱分离时流动相温度为50-60℃。

本发明还提供了一种制备奥利万星中间体A82846B盐的方法，包括上述所述的奥利万星中间体A82846B的纯化步骤，以及将所获得A82846B与酸成盐的步骤。所述酸选自盐酸、磷酸、硫酸、马来酸、乙酸、甲磺酸、三氟乙酸中一种或多种，优选马来酸、乙酸。

本发明还提供了一种制备奥利万星的方法，包括将A82846B盐与4-(4-氯苯基)苯甲醛反应步骤，再在还原剂条件下还原胺化的步骤，所述还原剂选自硼烷还原剂，优选自氰基硼氢化钠、三乙基硼氢化钠、硼氢化钠。具体实验条件可参考WO9630401A1或Joural.antibiot.1996,49,575-581。

本发明所述的A82846B发酵液指的是依照本领域已知的方法发酵制备A82846B得到的发酵液，例如，依照CN87106483A所公开的工艺来发酵而获得发酵液，所用菌株为Kibdelosporangium aridum(拟孢囊属)NRRL 18098、NRRL 18099或NRRL 18100。这些发酵液中除了含有A82846B外，还含有大量的无机、有机杂质。

本发明的有益效果：

1)为了便于放线菌分泌的A82846B充分释放到细胞外，调节发酵液pH值，同时，为了避免发酵液直接上样对离子交换树脂层析柱的物理影响，纯化方法中还添加固液分离步骤。

2)由于A82846B与硅胶C18或聚苯乙烯聚合物骨架填料间特殊结合问题，我们通过控制A82846B发酵液上样时pH值和经流动相洗脱分离时盐浓度、pH值和有机溶剂比例，一方面减少硅胶C18或聚苯乙烯聚合物骨架填料的使用量，另一方面提高与有关物质的分离度。

3)本发明提供的纯化方法能够获得高质量的A82846B，而且本发明所述方法时溶剂使用量少，能耗低，操作简单，易于工业化放大生产。

具体实施方式

以下通过实例进一步描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：固液分离和阳离子交换树脂预处理

将A82846B发酵液300L(按照CN87106483A所公开的工艺来发酵而获得发酵液，所用菌株为Kibdelosporangium aridum(拟孢囊属)NRRL 18098，用膜孔径为0.1-0.2μm的陶瓷膜进行微滤，补水循环，弃掉菌渣，收集滤液900L。检测A82846B单位为0.47g/L，总量为423.0g。

将澄清液900L调节pH至7.0经60L FPC22树脂柱纯化，依次用2BV纯化水、2BV 70％乙醇洗杂和3BV 50mM氨水溶液洗脱，获得纯度51.9％的A82846B洗脱洗脱液180L。

实施例2：固液分离和阳离子交换树脂预处理

将A82846B发酵液320L，用板框过滤饼并水洗，弃掉滤饼，收集滤液350L。检测A82846B单位为1.25g/L，总量为437.5g。

将滤液350L调节pH至7.0经60L HD-8树脂柱纯化，依次用2BV纯化水、3BV 50％乙醇洗杂和2BV 150mM氨水溶液洗脱，获得纯度41.1％的A82846B洗脱洗脱液120L。

实施例3：固液分离和阳离子交换树脂预处理

将A82846B发酵液320L，用板框过滤饼并水洗，弃掉滤饼，收集滤液340L。检测A82846B单位为1.36g/L，总量为462.4g。

将滤液600L调节pH至7.0经60L HD-8树脂柱纯化，依次用2BV纯化水、3BV 80％乙醇洗杂和2BV 100mM氢氧化钠水溶液洗脱，获得纯度50.2％的A82846B洗脱洗脱液110L。

基于实施例1和2，在样品洗脱过程中，所用洗脱相(氨水溶液)浓度会影响到此步A82846B洗脱液的有相关物质纯度，一般来说，我们会选用45％以上的A82846B洗脱液进行下一步处理，最终可获得较好纯度A82846B，同时，也利于A82846B制备合格奥利万星。

实施例4：阳离子交换树脂预处理工序中发酵液上样温度、洗脱温度对样品纯度和收率的影响

按照表1中参数进行按实施例1中树脂预处理流程(5L树脂)进行实验例1-6，利用HPLC检测样品纯度和含量，并计算此步骤的收率。详细结果见下表。

表1：考察发酵液上样温度、洗脱温度对样品纯度和收率的影响

备注：由于实验2上样液温度为25℃，相对其它实验例来说，其所用树脂量较多，为其他实验例的1.5倍量。

实施例5：考察阳离子交换树脂预处理工序中洗脱液pH对样品纯度和收率影响

按照表2中参数进行按实施例3中树脂预处理流程(5L树脂)进行实验例7-12，HPLC检测样品纯度和含量，计算此步骤的收率。详细结果见下表。

表2：第一洗脱液洗脱pH对纯度和收率的影响

实施例6：反相色谱层析柱纯化方法一

将按实验例3所述方法收集洗脱液用磷酸调节pH至9.0，经50L XAD1600树脂柱纯化，依次用2BV纯化水，6BV pH2.5含0.5％的磷酸二氢铵水溶液洗杂和5BV pH2.5含0.3％的磷酸二氢铵的3％甲醇洗脱，获得纯度92.3％的A82846B洗脱收集液250L。

上述步骤洗脱收集液可以直接进入脱盐工序，也可进行二次纯化：

收集液250L经过40L色谱3号树脂柱纯化，依次用4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵水溶液洗杂和4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵的6.0％甲醇洗脱，获得纯度97.9％的A82846B洗脱收集液160L。

实施例7：反相色谱层析柱纯化方法二

将按实验例3所述方法收集洗脱液用磷酸调节pH至7.5，经50L XAD1600树脂柱纯化，依次用2BV纯化水，8BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵水溶液洗杂和5BV pH4.5含0.3％的磷酸二氢铵的3％异丙醇洗脱，获得纯度93.9％的A82846B洗脱收集液250L。

收集液250L经过40L HZ-830树脂柱纯化，依次用4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵水溶液洗杂和4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵的5.0％乙醇洗脱，获得纯度97.8％的A82846B洗脱收集液160L。

实施例8：反相色谱层析柱纯化方法三

将按实验例3所述方法收集洗脱液用磷酸调节pH至8.0，经50L色谱3号树脂柱纯化，依次用2BV纯化水，6BV pH2.5含0.5％的磷酸二氢钠水溶液洗杂和5BV pH2.5含0.2％的磷酸二氢铵的3％乙醇洗脱，获得纯度94.2％的A82846B洗脱收集液250L。

收集液250L经过40L亲水型反相C8硅胶30μm柱纯化，依次用4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵的1％乙醇水溶液洗杂和8BV pH3.0含0.5％的磷酸二氢铵的6.0％乙醇洗脱，获得纯度99.1％的A82846B洗脱收集液200L。

实施例9：反相色谱层析柱纯化方法四

将按实验例3所述方法收集洗脱液用磷酸调节pH至8.0，经50L HZ-830树脂柱纯化，依次用2BV纯化水，6BV pH2.5含0.5％的磷酸二氢钠水溶液洗杂和5BV pH2.5含0.2％的磷酸二氢钠的3％乙醇洗脱，获得纯度92.9％的A82846B洗脱收集液250L。

收集液250L经过40L亲水型反相C18硅胶60μm柱纯化，依次用4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵的1％异丙醇水溶液洗杂和8BV pH3.0含0.5％的乙酸铵的6.0％异丙醇洗脱，获得纯度96.8％的A82846B洗脱收集液200L。

实施例10：反相色谱层析柱纯化方法五

将按实验例3所述方法收集洗脱液用磷酸调节pH至8.0，经50L亲水型反相C18硅胶100um柱纯化，依次用6BV pH2.5含0.5％的磷酸二氢钠水溶液洗杂和5BV pH2.5含0.2％的磷酸二氢钠的3％乙醇洗脱，获得纯度92.3％的A82846B洗脱收集液250L。

收集液250L经过40L亲水型反相C18硅胶30μm柱纯化，依次用4BV pH5.0含0.5％的磷酸二氢铵的1％异丙醇水溶液洗杂和8BV pH2.0含0.5％的乙酸铵的6.0％异丙醇洗脱，获得纯度98.7％的A82846B洗脱收集液200L。

实施例11：脱盐、浓缩和成盐

将实施例10中经一次反相色谱层析纯化收集液经过25L XAD1600大孔吸附树脂柱脱盐，依次用纯化水脱盐和含0.03％乙酸的水溶液洗脱，获得纯度93.4％的A82846B洗脱液收集液80L。

收集后的料液经截留分子量为360的纳滤膜系统浓缩，除去小分子杂质，得到A82846B浓缩液5L。浓缩液使用真空旋蒸系统浓缩，浓缩至A82846B 200g/L后，加入含0.5M无水乙酸钠的异丙醇溶液10L进行盐析，抽滤收集沉淀；收集的沉淀放入真空干燥箱内，设置温度45℃，干燥时间48h，干燥结束，得A82846B精制品纯度97.5％。

实施例12：脱盐、浓缩和成盐

将实施例9中经一次反相色谱层析纯化收集液经过25L XAD18大孔吸附树脂柱脱盐，依次用纯化水脱盐和含0.03％乙酸的水溶液洗脱，获得纯度93.1％的A82846B洗脱液收集液80L。

收集后的料液经截留分子量为800的纳滤膜系统浓缩，除去小分子杂质，得到A82846B浓缩液5L。浓缩液使用真空旋蒸系统浓缩，浓缩至A82846B 300g/L后，加入含1.0M无水乙酸钠的乙醇溶液5L进行盐析，抽滤收集沉淀；收集的沉淀放入真空干燥箱内，设置温度40℃，干燥时间60h，干燥结束，得A82846B精制品纯度97.8％。

实施例13：脱盐、浓缩和成盐

将实施例8中经二次反相色谱层析纯化收集液经过截留分子量为1KD的超滤膜系统脱盐并浓缩，用4-6BV的水顶洗，获得纯度98.7％的A82846B浓缩液5L。浓缩液使用真空旋蒸系统浓缩，浓缩至A82846B 250g/L后，加入含0.2M无水乙酸钠的甲醇溶液15L进行盐析，抽滤收集沉淀；收集的沉淀放入真空干燥箱内，设置温度35℃，干燥时间72h，干燥结束，得A82846B精制品纯度99.0％。

实施例14：奥利万星中间体A82846B含量和纯度检测方法(HPLC)

色谱柱：YMC AQC18 250*4.6mm

色谱条件：流动相A：0.1％三氟乙酸+1％四氢呋喃-水

流动相B：0.1％三氟乙酸+1％四氢呋喃-水：乙腈(1:1)

柱温：50℃，波长：230nm，样品浓度：1mg/mL，进样体积：20μL

表3：梯度

T(min)	A(％)	B(％)
			0	85	15
40	85	15
			60	0	100
61	85	15
			68	85	15

实施例15：

按两个文献报道中实施例与本文实施例11工艺进行比较样品总纯度和收率，以及对相关特定杂质的去除情况，不难发现，按本发明所述方法获得样品的纯度要好于其他两篇文献报道的方法，且相对于现有方法来说，本发明所述方法能有效的去除A82846B的B异构体(RRT＝0.81，相对保留时间RRT＝B异构体保留时间RT/主峰保留时间RT)、A异构体(RRT＝0.73)和杂质C(RRT＝0.64)，利于后续的奥利万星合成，具体数据表4。

表4：实验对比数据

Claims

1.一种奥利万星中间体A82846B的纯化方法，包括：

将A82846B发酵液上样至离子交换树脂层析柱，经流动相洗脱分离，得到第一洗脱液；再将第一洗脱液上样至以硅胶C18或聚苯乙烯聚合物为填料的反相色谱层析柱，先进行杂质洗脱，再进行样品洗脱收集第二洗脱液，优选所述第二洗脱液中A82846B纯度大于80％。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，所述的C18硅胶的粒径为5-60μm，比表面积在100-300m²/g，所述的聚苯乙烯聚合物的粒径为20-100μm，比表面积在500-1200m²/g。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于第一洗脱液上样前还含有pH调节步骤，所述pH＝6.0-9.0，优选pH＝7.5-8.8。

4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于所述杂质洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选甲醇水溶液。

5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于所述杂质洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％。

6.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于所述样品洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选异丙醇水溶液。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于所述样品洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％，优选1-2wt.％。

8.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于所述A82846B发酵液上样时发酵液温度为30-60℃，所述洗脱分离时流动相温度为50-60℃。

9.根据权利要求1-8任一所述的纯化方法，其特征在于，所述硅胶C18填料选自HP-C18、DYB71306、Unisil C18，优选自HP-C18，所述聚苯乙烯聚合物填料选自CG161m、CG161s、XAD1600、色谱3号、HZ830、HP20和HP20SS，优选为HP20SS。

10.根据权利要求1-9任一所述的纯化方法，其特征在于，还包括A82846B发酵液上样前经固液分离，所述固液分离采用板框压滤、陶瓷膜澄清或连续流离心澄清的方式。

11.根据权利要求10所述的纯化方法，其特征在于在A82846B发酵液固液分离前还含有发酵液pH调节步骤，所述pH＝9.0-12，优选pH＝10-11。

12.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于所述纯化方法还包括将第二洗脱液脱盐的步骤，所述脱盐步骤采用纳滤、超滤或过树脂柱的方式中一种或多种。

13.根据权利要求1-12任一所述的纯化方法，包括：

a)调节A82846B发酵液的pH＝9.0-12.0，再经固液分离得澄清发酵液；

其中，所述杂质洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选甲醇水溶液，所述杂质洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％，所述样品洗脱所用流动相选自甲醇水溶液、乙醇水溶液或异丙醇水溶液中的一种或多种，优选异丙醇水溶液，所述样品洗脱流动相中还含有缓冲盐，选自柠檬酸盐、磷酸盐、Tris-盐酸、硼酸盐、碳酸盐中一种或多种，所述缓冲盐的浓度为0-2wt.％，优选1-2wt.％。

14.根据权利要求13所述的纯化方法，其特征在于所述a)步骤中固液分离采用板框压滤、陶瓷膜澄清或连续流离心澄清的方式。

15.根据权利要求13所述的纯化方法，其特征在于所述b)步骤中A82846B发酵液上样时温度为30-60℃，所述b)步骤中洗脱分离时流动相温度为50-60℃。

16.一种制备奥利万星中间体A82846B盐的方法，包括权利要求1-15所述的纯化步骤，以及将所获得A82846B与酸成盐的步骤，所述酸选自盐酸、磷酸、硫酸、马来酸、乙酸、甲磺酸、三氟乙酸中一种或多种。

17.一种制备奥利万星的方法，包括将权利要求16所获得A82846B盐与4-(4-氯苯基)苯甲醛反应步骤，再在还原剂条件下还原胺化的步骤，所述还原剂选自硼烷还原剂，优选自氰基硼氢化钠、三乙基硼氢化钠、硼氢化钠。