CN117362397A - 一种奥利万星的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种奥利万星的纯化方法，具体包括以下步骤：S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至10‑11，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液；S2、层析富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液；S3、解吸并收集，S4、反相填料层析分离解吸处理，S5、后处理，本发明涉及生物发酵技术领域。该奥利万星的纯化方法，可实现通过采用控才多层层析和反向层析的配合使用来使整个奥利万星的纯度达到更高的纯度要求，很好的达到了既高效又充分的对奥利万星进行纯化处理的目的，大大简化了奥利万星的纯化工艺，且使纯化后产物纯度能够达到更高的要求，从而对奥利万星的纯化生产十分有益。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体为一种奥利万星的纯化方法。
背景技术
奥利万星注射液，用于由敏感革兰氏阳性菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA)导致的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSIs)成人患者的治疗，奥利万星是在第一代糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁的基础上开发的第二代新型半合成抗生素，主要通过微生物来源的次级代谢产物A82846B经化学半合成得到。奥利万星是一种可采用单剂量治疗方案的抗生素，也是批准在临床上用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSI)的抗生素药物。其抑菌机制与万古霉素类似，均是通过阻断肽聚糖生物合成时转糖苷作用抑制细菌细胞壁的形成，对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)杀灭效果显著。
参考中国专利公开号为CN113563426B的奥利万星母核A82846B的分离纯化方法，通过采用聚合物色谱填料并在氯化铵-乙醇水洗脱体系下进行洗脱，能够有效去除奥利万星母核中的主要杂质A82846A，相较于常用分离纯化方法，得到纯度大于98％的奥利万星母核A82846B，本发明提供的分离纯化方法更为简单，对设备要求低，且生产过程中不使用有毒试剂。
参考中国专利公开号为CN109988226A的一种奥利万星的纯化方法，通过聚合物微球层析，得到最终高纯度的奥利万星，杂质含量大大下降，该方法仅通过一步层析即可达到奥利万星含量大于98.5％的目标，方法简易，该方法采用磷酸盐、甲醇/乙醇/乙腈作为层析的流动相，易于后续的处理和溶剂的回收，可以通过纳滤膜进行浓缩处理，操作方便，该纯化方法不仅提高了产品品质，而且适合于扩大的商业化生产。
综合分析以上参考专利，可得出以下缺陷：现有的奥利万星的纯化方法操作复杂，且纯化后的产物杂质较多，从而导致产物纯度无法达到要求，不能实现通过采用控才多层层析和反向层析的配合使用来使整个奥利万星的纯度达到更高的纯度要求，无法达到既高效又充分的对奥利万星进行纯化处理的目的，从而对奥利万星的纯化生产十分不利。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种奥利万星的纯化方法，解决了现有的奥利万星的纯化方法操作复杂，且纯化后的产物杂质较多，从而导致产物纯度无法达到要求，不能实现通过采用控才多层层析和反向层析的配合使用来使整个奥利万星的纯度达到更高的纯度要求，无法达到既高效又充分的对奥利万星进行纯化处理的目的的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种奥利万星的纯化方法，具体包括以下步骤：
S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至10-11，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液；
S2、将滤液pH调节至9.0-9.5后导入聚合物微球层析柱进行柱层析，通过微球层析柱内的多层过离子交换树脂进行富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液；
S3、将步骤S2的树脂净化后的层析液用解吸液进行解吸并收集组分，得到奥利万星解吸混合液；
S4、将步骤S3得到的奥利万星解吸混合液通过浓缩设备进行浓缩后，进行反相填料层析分离，然后再次进行解吸处理；
S5、收集步骤S4再次解吸后的解吸液后再次进行浓缩处理，即得到奥利万星浓缩液，再将奥利万星浓缩液搅拌结晶，过滤并冷冻干燥，得到纯度大于98.5％的高纯度奥利万星粉末。
优选的，所述步骤S1中pH调节剂为NaOH溶液、Na2CO3溶液或NH3·H2O溶液中的一种，通过pH调节剂调节发酵液为弱碱性。
优选的，所述步骤S1中通过过滤设备进行过滤处理具体包括以下步骤：
T1、将调节pH后的发酵液通入过滤设备中，通过过滤设备中的过滤膜进行分批次过滤处理；
T2、每次过滤完成后将过滤膜上堆积的固体物质清除再进行下一次过滤；
T3、每次过滤的发酵液体积为6-8mL，重复过滤直至将全部发酵液过滤完成。
优选的，所述步骤T1中过滤膜为陶瓷膜、RO过滤膜、活性炭过滤膜或PP棉过滤膜中的一种，其中陶瓷膜是使原料液在膜管内高速流动，在压力驱动下含小分子组分的澄清渗透液沿与之垂直方向向外透过膜，含大分子组分的混浊浓缩液被膜截留，从而使流体达到分离、浓缩和纯化的目的。
优选的，所述步骤S2中过离子交换树脂是采用型号为LX18、XAD1600、HP20或HZ816的大孔吸附树脂，通过多层大孔吸附树脂对步骤S1得到的滤液进行层层吸附。
优选的，所述步骤S2中洗脱液为氨水溶液或氯化铵乙醇溶液中的一种，通过洗脱液将滤液中的杂质进行溶解，从而滤液中的奥利万星更纯化。
优选的，所述步骤S3中解吸液为0.2％-2％(v/v)的醋酸水溶液，通过使用醋酸水溶液将层析液中的奥利万星成份析出，从而方便收集。
优选的，所述步骤S4中再次进行解吸处理的解吸液为极性溶剂与盐水的混合液，其中极性溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、DMF溶剂或DMSO溶剂中的一种。
优选的，所述步骤S4中反相填料层析分离的具体步骤如下：
E1、将浓缩后的奥利万星解吸混合液向层析柱中从下向上反向通入；
E2、奥利万星解吸混合液通过层析柱中的填料进行反向层析处理。
优选的，所述步骤S5中冷冻干燥是通过冷冻干燥机进行处理，通过冷冻干燥机内的制冷系统、真空系统、加热系统和电器仪表控制系统通过降低压缩空气温度，使压缩空气中的水份析出。
(三)有益效果
本发明提供了一种奥利万星的纯化方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该奥利万星的纯化方法，具体包括以下步骤：S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至10-11，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液；S2、将滤液pH调节至9.0-9.5后导入聚合物微球层析柱进行柱层析，通过微球层析柱内的多层过离子交换树脂进行富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液；S3、将步骤S2的树脂净化后的层析液用解吸液进行解吸并收集组分，得到奥利万星解吸混合液；S4、将步骤S3得到的奥利万星解吸混合液通过浓缩设备进行浓缩后，进行反相填料层析分离，然后再次进行解吸处理；S5、收集步骤S4再次解吸后的解吸液后再次进行浓缩处理，即得到奥利万星浓缩液，再将奥利万星浓缩液搅拌结晶，过滤并冷冻干燥，得到纯度大于98.5％的高纯度奥利万星粉末，可实现通过采用控才多层层析和反向层析的配合使用来使整个奥利万星的纯度达到更高的纯度要求，很好的达到了既高效又充分的对奥利万星进行纯化处理的目的，大大简化了奥利万星的纯化工艺，且使纯化后产物纯度能够达到更高的要求，从而对奥利万星的纯化生产十分有益。
附图说明
图1为本发明纯化方法的流程图；
图2为本发明奥利万星的化学结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明实施例提供三种技术方案：一种奥利万星的纯化方法，具体包括以下实施例：
实施例1
一种奥利万星的纯化方法，具体包括以下步骤：
S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至10.5，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液，pH调节剂为NaOH溶液，通过pH调节剂调节发酵液为弱碱性；
S2、将滤液pH调节至9.25后导入聚合物微球层析柱进行柱层析，通过微球层析柱内的多层过离子交换树脂进行富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液，过离子交换树脂是采用型号为LX18、XAD1600、HP20或HZ816的大孔吸附树脂，通过多层大孔吸附树脂对步骤S1得到的滤液进行层层吸附，洗脱液为氨水溶液，通过洗脱液将滤液中的杂质进行溶解，从而滤液中的奥利万星更纯化；
S3、将步骤S2的树脂净化后的层析液用解吸液进行解吸并收集组分，得到奥利万星解吸混合液，解吸液为1％(v/v)的醋酸水溶液，通过使用醋酸水溶液将层析液中的奥利万星成份析出，从而方便收集；
S4、将步骤S3得到的奥利万星解吸混合液通过浓缩设备进行浓缩后，进行反相填料层析分离，然后再次进行解吸处理，再次进行解吸处理的解吸液为极性溶剂与盐水的混合液，其中极性溶剂为甲醇；
S5、收集步骤S4再次解吸后的解吸液后再次进行浓缩处理，即得到奥利万星浓缩液，再将奥利万星浓缩液搅拌结晶，过滤并冷冻干燥，得到纯度大于98.5％的高纯度奥利万星粉末，冷冻干燥是通过冷冻干燥机进行处理，通过冷冻干燥机内的制冷系统、真空系统、加热系统和电器仪表控制系统通过降低压缩空气温度，使压缩空气中的水份析出。
本发明实施例，步骤S1中通过过滤设备进行过滤处理具体包括以下步骤：
T1、将调节pH后的发酵液通入过滤设备中，通过过滤设备中的过滤膜进行分批次过滤处理，过滤膜为陶瓷膜，其中陶瓷膜是使原料液在膜管内高速流动，在压力驱动下含小分子组分的澄清渗透液沿与之垂直方向向外透过膜，含大分子组分的混浊浓缩液被膜截留，从而使流体达到分离、浓缩和纯化的目的；
T2、每次过滤完成后将过滤膜上堆积的固体物质清除再进行下一次过滤；
T3、每次过滤的发酵液体积为7mL，重复过滤直至将全部发酵液过滤完成。
本发明实施例，步骤S4中反相填料层析分离的具体步骤如下：
E1、将浓缩后的奥利万星解吸混合液向层析柱中从下向上反向通入；
E2、奥利万星解吸混合液通过层析柱中的填料进行反向层析处理。
实施例2
一种奥利万星的纯化方法，具体包括以下步骤：
S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至10，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液，pH调节剂为Na2CO3溶液，通过pH调节剂调节发酵液为弱碱性；
S2、将滤液pH调节至9.0后导入聚合物微球层析柱进行柱层析，通过微球层析柱内的多层过离子交换树脂进行富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液，过离子交换树脂是采用型号为LX18、XAD1600、HP20或HZ816的大孔吸附树脂，通过多层大孔吸附树脂对步骤S1得到的滤液进行层层吸附，洗脱液为氯化铵乙醇溶液，通过洗脱液将滤液中的杂质进行溶解，从而滤液中的奥利万星更纯化；
S3、将步骤S2的树脂净化后的层析液用解吸液进行解吸并收集组分，得到奥利万星解吸混合液，解吸液为0.2％(v/v)的醋酸水溶液，通过使用醋酸水溶液将层析液中的奥利万星成份析出，从而方便收集；
S4、将步骤S3得到的奥利万星解吸混合液通过浓缩设备进行浓缩后，进行反相填料层析分离，然后再次进行解吸处理，再次进行解吸处理的解吸液为极性溶剂与盐水的混合液，其中极性溶剂为乙醇；
S5、收集步骤S4再次解吸后的解吸液后再次进行浓缩处理，即得到奥利万星浓缩液，再将奥利万星浓缩液搅拌结晶，过滤并冷冻干燥，得到纯度大于98.5％的高纯度奥利万星粉末，冷冻干燥是通过冷冻干燥机进行处理，通过冷冻干燥机内的制冷系统、真空系统、加热系统和电器仪表控制系统通过降低压缩空气温度，使压缩空气中的水份析出。
本发明实施例，步骤S1中通过过滤设备进行过滤处理具体包括以下步骤：
T1、将调节pH后的发酵液通入过滤设备中，通过过滤设备中的过滤膜进行分批次过滤处理，过滤膜为RO过滤膜；
T2、每次过滤完成后将过滤膜上堆积的固体物质清除再进行下一次过滤；
T3、每次过滤的发酵液体积为6mL，重复过滤直至将全部发酵液过滤完成。
本发明实施例，步骤S4中反相填料层析分离的具体步骤如下：
E1、将浓缩后的奥利万星解吸混合液向层析柱中从下向上反向通入；
E2、奥利万星解吸混合液通过层析柱中的填料进行反向层析处理。
实施例3
一种奥利万星的纯化方法，具体包括以下步骤：
S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至11，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液，pH调节剂为NH3·H2O溶液，通过pH调节剂调节发酵液为弱碱性；
S2、将滤液pH调节至9.5后导入聚合物微球层析柱进行柱层析，通过微球层析柱内的多层过离子交换树脂进行富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液，过离子交换树脂是采用型号为LX18、XAD1600、HP20或HZ816的大孔吸附树脂，通过多层大孔吸附树脂对步骤S1得到的滤液进行层层吸附，洗脱液为氨水溶液，通过洗脱液将滤液中的杂质进行溶解，从而滤液中的奥利万星更纯化；
S3、将步骤S2的树脂净化后的层析液用解吸液进行解吸并收集组分，得到奥利万星解吸混合液，解吸液为2％(v/v)的醋酸水溶液，通过使用醋酸水溶液将层析液中的奥利万星成份析出，从而方便收集；
S4、将步骤S3得到的奥利万星解吸混合液通过浓缩设备进行浓缩后，进行反相填料层析分离，然后再次进行解吸处理，再次进行解吸处理的解吸液为极性溶剂与盐水的混合液，其中极性溶剂为四氢呋喃；
S5、收集步骤S4再次解吸后的解吸液后再次进行浓缩处理，即得到奥利万星浓缩液，再将奥利万星浓缩液搅拌结晶，过滤并冷冻干燥，得到纯度大于98.5％的高纯度奥利万星粉末，冷冻干燥是通过冷冻干燥机进行处理，通过冷冻干燥机内的制冷系统、真空系统、加热系统和电器仪表控制系统通过降低压缩空气温度，使压缩空气中的水份析出。
本发明实施例，步骤S1中通过过滤设备进行过滤处理具体包括以下步骤：
T1、将调节pH后的发酵液通入过滤设备中，通过过滤设备中的过滤膜进行分批次过滤处理，过滤膜为活性炭过滤膜；
T2、每次过滤完成后将过滤膜上堆积的固体物质清除再进行下一次过滤；
T3、每次过滤的发酵液体积为8mL，重复过滤直至将全部发酵液过滤完成。
本发明实施例，步骤S4中反相填料层析分离的具体步骤如下：
E1、将浓缩后的奥利万星解吸混合液向层析柱中从下向上反向通入；
E2、奥利万星解吸混合液通过层析柱中的填料进行反向层析处理。
应用实例
采用本发明实施例1-3的纯化方法分别对奥利万星进行纯化处理，得到三组纯化后的产物，然后测定这三组纯化产物的纯度，然后与现有纯化方法的产物纯度(对照组)进行对比，详见表1。
表1实验产物纯度数据表
由表1可知采用本发明实施例1-3的纯化方法所得到的产物纯度明显要高于现有的纯化方法产物纯度，因此本发明可实现通过采用控才多层层析和反向层析的配合使用来使整个奥利万星的纯度达到更高的纯度要求，很好的达到了既高效又充分的对奥利万星进行纯化处理的目的，大大简化了奥利万星的纯化工艺，且使纯化后产物纯度能够达到更高的要求，从而对奥利万星的纯化生产十分有益。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、将奥利万星发酵液通过pH调节剂调节至10-11，然后通过过滤设备进行过滤处理，过滤完成后收集过滤液；
S2、将滤液pH调节至9.0-9.5后导入聚合物微球层析柱进行柱层析，通过微球层析柱内的多层过离子交换树脂进行富集，每层吸附过程中要用洗脱液洗脱，收集层析液；
S3、将步骤S2的树脂净化后的层析液用解吸液进行解吸并收集组分，得到奥利万星解吸混合液；
S4、将步骤S3得到的奥利万星解吸混合液通过浓缩设备进行浓缩后，进行反相填料层析分离，然后再次进行解吸处理；
S5、收集步骤S4再次解吸后的解吸液后再次进行浓缩处理，即得到奥利万星浓缩液，再将奥利万星浓缩液搅拌结晶，过滤并冷冻干燥，得到纯度大于98.5％的高纯度奥利万星粉末。
2.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中pH调节剂为NaOH溶液、Na2CO3溶液或NH3·H2O溶液中的一种，通过pH调节剂调节发酵液为弱碱性。
3.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1中通过过滤设备进行过滤处理具体包括以下步骤：
T1、将调节pH后的发酵液通入过滤设备中，通过过滤设备中的过滤膜进行分批次过滤处理；
T2、每次过滤完成后将过滤膜上堆积的固体物质清除再进行下一次过滤；
T3、每次过滤的发酵液体积为6-8mL，重复过滤直至将全部发酵液过滤完成。
4.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤T1中过滤膜为陶瓷膜、RO过滤膜、活性炭过滤膜或PP棉过滤膜中的一种，其中陶瓷膜是使原料液在膜管内高速流动，在压力驱动下含小分子组分的澄清渗透液沿与之垂直方向向外透过膜，含大分子组分的混浊浓缩液被膜截留，从而使流体达到分离、浓缩和纯化的目的。
5.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S2中过离子交换树脂是采用型号为LX18、XAD1600、HP20或HZ816的大孔吸附树脂，通过多层大孔吸附树脂对步骤S1得到的滤液进行层层吸附。
6.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S2中洗脱液为氨水溶液或氯化铵乙醇溶液中的一种，通过洗脱液将滤液中的杂质进行溶解，从而滤液中的奥利万星更纯化。
7.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S3中解吸液为0.2％-2％(v/v)的醋酸水溶液，通过使用醋酸水溶液将层析液中的奥利万星成份析出，从而方便收集。
8.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S4中再次进行解吸处理的解吸液为极性溶剂与盐水的混合液，其中极性溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、DMF溶剂或DMSO溶剂中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S4中反相填料层析分离的具体步骤如下：
E1、将浓缩后的奥利万星解吸混合液向层析柱中从下向上反向通入；
E2、奥利万星解吸混合液通过层析柱中的填料进行反向层析处理。
10.根据权利要求1所述的一种奥利万星的纯化方法，其特征在于：所述步骤S5中冷冻干燥是通过冷冻干燥机进行处理，通过冷冻干燥机内的制冷系统、真空系统、加热系统和电器仪表控制系统通过降低压缩空气温度，使压缩空气中的水份析出。
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