CN104371011A - 高纯度替考拉宁精粉的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，将替考拉宁发酵液碱性条件下离心除去发酵液中固体，滤液调至中性经大孔吸附树脂吸附洗脱后，得到65％以上的替考拉宁洗脱液，再经凝胶层析过滤，得到80％的替考拉宁洗脱液；最后将洗脱液浓缩，加入丙酮使其沉淀，离心得乳白色替考拉宁粗品；将粗品用适量水溶解，加样至装有反相硅胶的层析柱，使用乙腈与水的混合液进行梯度洗脱，得到高纯度的替考拉宁洗脱液，加入活性炭脱色，过滤，冷却沉淀除去剩余杂质，清液加丙酮使其完全沉淀，沉淀所得的湿品经红外干燥得到替考拉宁纯品。本发明工艺简单，质量可靠，替考拉宁精粉纯度高，单组分的含量可控，适于工业化规模生产高纯度的替考拉宁。

Description

高纯度替考拉宁精粉的纯化方法

技术领域

本发明具体涉及一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法。

背景技术

替考拉宁(teicoplanin)系替考游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)发酵产生的一种多组份糖肽类抗生素,主要含5个化学结构相似的化合物(A2-1,A2-2,A2-3,A2-4和A2-5)，如图1所示，5个组份的差异仅在于酰基侧链的不同，其中A2-2为主要组份，占各组份相对含量的35％-55％，此外含少量的侧链降解产物A3-1。

替考拉宁的结构式：

作为与万古霉素类似的新糖肽抗生素，替考拉宁具有与万古霉素相似的抗菌谱及抗菌活性，在临床研究中的不良反应更少。随着对替考拉宁提取过程和药理毒理作用研究的不断深入，此类化合物在市场中的需求会日益增加。文献报道的替考拉宁的分离纯化过程较为复杂，且组分含量不易控制，

中国专利申请CN102964430A公开了一种替考拉宁的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：调节替考拉宁发酵液至碱性后进行过滤；将得到的滤液调节至酸性后通过大孔吸附树脂，依次用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液；过滤，滤液通过硅胶层析分离，收集体积比为10-50％乙醇水溶液的洗脱液；再将洗脱液调节至酸性后通过截流分子量为5000～30000Da的超滤膜进行超滤，得到超滤液；超滤液通过截流分子量为100～1000Da的纳滤膜进行纳滤，浓缩得到替考拉宁。该方法的缺陷在于硅胶柱层析分离中的硅胶是一次性使用，洗脱时间较长，且硅胶吸附性较强，对样品吸附量大会损失样品；硅胶柱很难封闭式操作，在有水的情况下分离效果有限，且对上样量有限制。中国专利CN 102690333B公开了一种高纯度替考拉宁的制备方法，该方法包括将替考拉宁粗品用水或缓冲盐溶液溶解，加样至装有纳米聚合物微球的色谱柱，使用极性溶剂与水的混合液进行梯度解析，得到各组分及杂质比例符合要求的替考拉宁解析液，经活性炭脱色或树脂脱色，纳滤脱盐浓缩，结晶、过滤、干燥等岁骤，得到高纯度、比例可控的替考拉宁精粉。该方法使用纳米聚合物微球进行柱层析，纳米聚合物微球的骨架结构具有更高的机械强度和化学稳定性，但在分离效果上不及反相硅胶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，采用吸附法、凝胶层析法和色谱法分离纯化替考拉宁精粉，简便快速，效果好。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将替考拉宁发酵液离心除去发酵液中的固体，得到含替考拉宁的滤液；

(2)将所述滤液进行大孔吸附树脂柱层析，先采用纯水以10L/h的流速洗脱，再用体积比10:90，15:85，20:80，25:75，70:30的丙酮-水溶剂系统以12L/h的流速进行梯度洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，并浓缩，得到浓缩物；

(3)将所述浓缩物经过凝胶层析柱过滤，先用体积比10:90或15:85的甲醇-水洗脱；再用体积比35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液进行洗脱；收集以35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液为洗脱剂的洗脱液，浓缩以获得浓缩液；

(4)往浓缩液中加入丙酮沉淀30min，得替考拉宁粗品；用水溶解替考拉宁粗品，并加样至反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液洗脱2h，再用30％乙腈水溶液洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁各组分的纯度，将满足纯度要求的洗脱液合并；

(5)往洗脱液中加入1.5～2.5％(w/v)的活性炭脱色20min，过滤，冷却沉淀除去杂质，加入6倍于上清液体积的丙酮于上清液中沉淀，低温结晶得晶体，晶体经红外干燥，得到替考拉宁纯品。

进一步地，所述(1)的具体操作方法如下：

将替考拉宁发酵液调pH至11.0，室温保持15min，再回调至PH 7.5，然后4500rpm离心10min，取上清液稀释至2倍体积。

进一步地，所述大孔吸附树脂为HP20树脂、D3520树脂、HZ816树脂或AB-8树脂。

进一步地，所述(3)中的凝胶层析柱是指葡聚糖凝胶层析柱或琼脂糖凝胶层析柱。

进一步地，所述(4)中的反相硅胶层析柱为C8反相硅胶层析柱或C18反相硅胶层析柱。

进一步地，所述(4)中，所述46％乙腈水溶液中含有3.15g/L的NaH₂PO₄，pH为6.5，且采用磷酸调节pH；所述15％、30％乙腈水溶液中均含有4.10g/L的NaH₂PO₄，pH为6.5，且采用磷酸调节pH。

进一步地，所述(4)中的通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁的纯度，其具体操作方法如下：

色谱柱为Ultimate Welch-C18；色谱柱规格是5μm、250mm×4.6mm；流动相A为体积比900:100的3g/L NaH₂PO₄-乙腈，流动相B为体积比300:700的3g/L NaH₂PO₄-乙腈；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL；其中，流动相A和流动相B按下述比例梯度洗脱：

本发明的有益效果在于：工艺简单，质量可靠，替考拉宁精粉纯度高，单组分的含量可控，适用于工业化规模生产高纯度的替考拉宁。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1为欧洲药典标准品替考拉宁对照品的液相色谱图。

图2为本发明中实施例1分离得到的替考拉宁成品的液相色谱图。

具体实施方式

一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，包括以下步骤：

(1)将替考拉宁发酵液离心除去发酵液中的固体，得到含替考拉宁的滤液；具体地：将替考拉宁发酵液调pH至11.0，室温保持15min，再回调至PH 7.5，然后4500rpm离心10min，取上清液稀释至2倍体积。

(2)将所述滤液进行大孔吸附树脂柱层析，先采用纯水以10L/h的流速洗脱，再用体积比10:90，15:85，20:80，25:75，70:30的丙酮-水溶剂系统以12L/h的流速进行梯度洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，并浓缩，得到浓缩物；

所述大孔吸附树脂为HP20树脂、D3520树脂、HZ816树脂或AB-8树脂。

(3)将所述浓缩物经过葡聚糖凝胶层析柱或琼脂糖凝胶层析柱过滤，先用体积比10:90或15:85的甲醇-水洗脱；再用体积比35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液进行洗脱；收集以35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液为洗脱剂的洗脱液，浓缩以获得浓缩液；

(4)往浓缩液中加入丙酮沉淀30min，得替考拉宁粗品；用水溶解替考拉宁粗品，并加样至C8反相硅胶层析柱或C18反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液(含4.10g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱2h，再用30％乙腈水溶液(含4.10g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液(含3.15g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁各组分的纯度，将满足纯度要求的洗脱液合并；即洗脱液中，替考拉宁的各组分的纯度须满足要求：替考拉宁A2组分之和≥80％，35％≤A2-2≤55.0％，A2-1≤20.0％，A2-3≤20.0％，A2-4≤20.0％，A2-5≤20.0％，A3≤15.0％。

所述通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁的纯度，是指替考拉宁的各组分纯度检测采用European Pharmacopoeia(欧洲药典)7.0的方法，具体地：

色谱柱为Ultimate Welch-C18；色谱柱规格是5μm、250mm×4.6mm；流动相A为体积比900:100的3g/L NaH₂PO₄-乙腈，流动相B为体积比300:700的3g/L NaH₂PO₄-乙腈；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL；其中，流动相A和流动相B按下述比例梯度洗脱：

(5)往洗脱液中加入1.5～2.5％(w/v)的活性炭脱色20min，过滤，冷却沉淀除去杂质，加入6倍于上清液体积的丙酮于上清液中沉淀，低温结晶得晶体，晶体经红外干燥，得到替考拉宁纯品。

实施例1

A.将替考拉宁发酵液60L调pH至11.0，室温保持约15min，回调至PH7.5,4500rpm离心10min,取上清液稀释至120L上15L HP20大孔树脂，先用2BV(2倍柱体积)纯水以10L/h的流速洗脱，去除杂质和色素，再依次用10％、15％、20％、25％丙酮水溶液以12L/h流速洗脱去除杂质，然后用70％丙酮水溶液12L/h流速洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，得到216L洗脱液，替考拉宁含量822.03g，收率为88.7％，效价13.70g/L。

B.将216L洗脱液减压浓缩至小体积，上5L葡聚糖凝胶层析柱，先用15％甲醇水以8L/h的流速洗脱，再用体积比35:65的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液(即体积比35:65的甲醇-水溶液为洗脱剂，且所述水溶液为质量分数0.5％的NaHCO₃水溶液)洗脱，并收集35:65的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液洗脱所得的层析液，合并得到33L层析液，替考拉宁含量733.9g，收率为82.6％。

C.将33L层析液浓缩，用丙酮沉淀30min，离心得乳白色替考拉宁粗品617.4g，将替考拉宁粗品用适量水溶解，加样至C18反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液(含4.10g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱2h，再用30％乙腈水溶液(含4.10g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液(含3.15g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液替考拉宁的纯度，根据对各组分纯度的要求，即各组分纯度须满足要求：替考拉宁A2组分总和≥80％，35％≤A2-2≤55.0％，A2-1≤20.0％，A2-3≤20.0％，A2-4≤20.0％，A2-5≤20.0％，A3≤15.0％；然后合并洗脱液共26L。

其中，替考拉宁的各组分纯度采用European Pharmacopoeia(欧洲药典)7.0的方法，色谱柱为Ultimate Welch-C18(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，流动相A为3g/L NaH₂PO₄-乙腈(900:100)，流动相B为3g/L NaH₂PO₄-乙腈(300:700)，按表1比例梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL)。

表1梯度洗脱表

D.加入1.5％(w/v)的糖用活性炭303脱色20min，过滤，-4℃冷却沉淀12h除去剩余杂质，加入6倍于上清液体积的丙酮于上清液中沉淀，沉淀下来的湿品经红外干燥得到替考拉宁538.3g，经液相色谱检测纯度为96.56％(纯度以替考拉宁A2组分之和为基准，液相色谱图见图2)。

实施例2

A.将替考拉宁发酵液60L调pH至11.0，室温保持约15min，回调至PH7.5,4500rpm离心10min,取上清液稀释至120L，取20L稀释液，上装有D3520大孔树脂吸附，先用2BV(倍柱体积)纯水以10L/h的流速洗脱，去除杂质和色素，再依次用10％、15％、20％、25％丙酮水溶液以12L/h流速洗脱去除杂质，然后用70％丙酮水溶液12L/h流速洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，得到81L洗脱液，含量270.8g，效价13.54g/L，回收替考拉宁245.34g，收率为90.6％，产物液相色谱纯度83.01％。

B.将81L洗脱液上5L琼脂糖凝胶层析柱吸附，上样流速6L/h。上柱结束后，先用10％甲醇水以8L/h的流速洗脱，再用体积比40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液洗脱，流速7.5L/h，共收集到用40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液洗脱所得的洗脱液18.11L，效价11.03g/L，共回收替考拉宁199.85g，收率为81.46％，产物液相色谱纯度90.53％。

C.将18.11L洗脱液上5LC8反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液(含4.10g/L NaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱2h，再用30％乙腈水溶液(含4.10g/L NaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液(含3.15g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH6.5)洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液替考拉宁的纯度，将满足纯度要求的洗脱液合并，得洗脱液共4.2L，即洗脱液中替考拉宁各组分纯度须满足要求：替考拉宁A2组分之和≥80％，35％≤A2-2≤55.0％，A2-1≤20.0％，A2-3≤20.0％，A2-4≤20.0％，A2-5≤20.0％，A3≤15.0％；然后合并洗脱液共26L。

其中，替考拉宁的各组分纯度采用European Pharmacopoeia(欧洲药典)7.0的方法，色谱柱为Ultimate Welch-C18(250mm×4.6mm i.d.,5μm)，流动相A为3g/L NaH₂PO₄-乙腈(900:100)，流动相B为3g/L NaH₂PO₄-乙腈(300:700)，按表1比例梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL)。

表1梯度洗脱表

D.加2.5％(w/v)针用活性炭脱色20min，后过滤获得4.15L脱色液；往4.15L脱色液中迅速加入24.9L丙酮，析出白色沉淀，经红外干燥，得到163.4g替考拉宁成品，经液相色谱检测纯度为97.74％(纯度以替考拉宁A2组分之和为基准)。

实施例3：

本部分与实施例l的不同之处在于：

A.取20L稀释液，上HZ816大孔吸附树脂；

得到75L洗脱液，替考拉宁含量210.4g，效价14.04g/L，回收替考拉宁192.30g，收率为91.4％，产物液相色谱纯度81.76％(纯度以替考拉宁A2组分之和为基准)。

实施例4：

本部分与实施例l的不同之处在于：

A.取15L稀释液，上AB-8大孔吸附树脂；

得到64L洗脱液，替考拉宁含量202.5g，效价13.50g/L，回收替考拉宁178.80g，过程收率为88.3％，产物液相色谱纯度84.23％(纯度以替考拉宁A2组分之和为基准)。

本发明将替考拉宁发酵液碱性条件下通过离心除去发酵液中固体，滤液调至中性经大孔吸附树脂吸附洗脱后，得到65％以上的替考拉宁洗脱液，再经凝胶层析过滤，得到80％的替考拉宁洗脱液；最后将洗脱液浓缩，加入丙酮使其沉淀，离心得乳白色替考拉宁粗品；将粗品用适量水溶解，加样至装有反相硅胶的层析柱，使用极性溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，得到高纯度的替考拉宁洗脱液，加入活性炭脱色，过滤，冷却沉淀除去剩余杂质，清液加丙酮使其完全沉淀，沉淀所得的湿品经红外干燥得到替考拉宁纯品。其中，上述纯度均以替考拉宁A2组分之和为基准。

本发明采用C8、C18反相硅胶进行柱层析，C8、C18反相硅胶是在硅胶载体上化学结合了辛烷、十八(烷)基甲硅烷基(Octadecylsilyl)的一种填料，该填料相对紧密的柱层加上高的孔容和比表面积，使得样品与填料之间在较低的操作压力或无外界压力下充分地相互作用，从而能够顺利地获得高的分离效率。本发明将替考拉宁发酵液处理至纯品的工艺可控性强，操作步骤简便，样品回收率高，可用于大量分离纯化高纯度替考拉宁精粉。

本发明使用反相硅胶进行层析，可大幅度提高产品的纯度；通过梯度洗脱，可以有效地去除发酵代谢过程产生的杂质，并且通过检测分段收集的洗脱液，使得到的替考拉宁洗脱液中A2和各组分比例符合要求；本发明工艺简单，质量可靠，替考拉宁精粉纯度高，单组分的含量可控，适于工业化规模生产高纯度的替考拉宁。

Claims (7)

1.一种高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将替考拉宁发酵液离心除去发酵液中的固体，得到含替考拉宁的滤液；

(2)将所述滤液进行大孔吸附树脂柱层析，先采用纯水以10L/h的流速洗脱，再用体积比10:90，15:85，20:80，25:75，70:30的丙酮-水溶剂系统以12L/h的流速进行梯度洗脱，收集以70％丙酮水溶液为洗脱剂的洗脱液，并浓缩，得到浓缩物；

(3)将所述浓缩物经过凝胶层析柱过滤，先用体积比10:90或15:85的甲醇-水洗脱；再用体积比35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液进行洗脱；收集以35:65或40:60的甲醇-0.5％NaHCO₃水溶液为洗脱剂的洗脱液，浓缩以获得浓缩液；

(4)往浓缩液中加入丙酮沉淀30min，得替考拉宁粗品；用水溶解替考拉宁粗品，并加样至反相硅胶层析柱进行层析，先用15％乙腈水溶液洗脱2h，再用30％乙腈水溶液洗脱1.5h，最后用46％乙腈水溶液洗脱，分段收集，通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁各组分的纯度，将满足纯度要求的洗脱液合并；

(5)往洗脱液中加入1.5～2.5％(w/v)的活性炭脱色20min，过滤，冷却沉淀除去杂质，加入6倍于上清液体积的丙酮于上清液中沉淀，低温结晶得晶体，晶体经红外干燥，得到替考拉宁纯品。

2.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(1)的具体操作方法如下：

将替考拉宁发酵液调pH至11.0，室温保持15min，再回调至PH7.5，然后4500rpm离心10min，取上清液稀释至2倍体积。

3.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为HP20树脂、D3520树脂、HZ816树脂或AB-8树脂。

4.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(3)中的凝胶层析柱是指葡聚糖凝胶层析柱或琼脂糖凝胶层析柱。

5.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(4)中的反相硅胶层析柱为C8反相硅胶层析柱或C18反相硅胶层析柱。

6.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：

所述(4)中，所述46％乙腈水溶液中含有3.15g/L的NaH₂PO₄，pH为6.5，且采用磷酸调节pH；所述15％、30％乙腈水溶液中均含有4.10g/L的NaH₂PO₄，pH为6.5，且采用磷酸调节pH。

7.如权利要求1所述的高纯度替考拉宁精粉的纯化方法，其特征在于：所述(4)中的通过HPLC检测各段洗脱液中替考拉宁的纯度，其具体操作方法如下：

色谱柱为Ultimate Welch-C18；色谱柱规格是5μm、250mm×4.6mm；流动相A为体积比900:100的3g/L NaH₂PO₄-乙腈，流动相B为体积比300:700的3g/L NaH₂PO₄-乙腈；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL；其中，流动相A和流动相B按下述比例梯度洗脱：