CN105461768B

CN105461768B - 一种2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的制备方法

Info

Publication number: CN105461768B
Application number: CN201410421427.9A
Authority: CN
Inventors: 张守雨; 那可; 赵文杰
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2014-08-25
Publication date: 2018-10-30
Anticipated expiration: 2034-08-25
Also published as: CN105461768A

Abstract

本发明公开了一种2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)的制备方法，所述方法包括步骤：将含有AA‑2G的溶液与阴离子交换树脂接触并被吸附，用0.01‑0.1mol/L的酸进行洗脱，收集洗脱液得到2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)。

Description

一种2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的制备方法

技术领域

本发明涉及分离纯化，尤其涉及一种2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的制备方法。

背景技术

AA-2G是一种维生素C的衍生物，具有美白、抗氧化、促进胶原蛋白合成的作用。目前在化妆品、食品和保健品等行业有广泛的应用。在化妆品行业中，AA-2G可以作为美白剂，还原表皮中黑色素；促进胶原蛋白合成，延缓衰老；抗色斑，防止皮肤脂肪过氧化。

目前已报道的AA-2G的分离纯化方法，主要有CN201280010888.6和EP03105024.0。中国专利(CN201280010888.6)公开的方法共有七个操作单元，较为繁琐，而且精制步骤用到柱色谱的操作方法，对设备要求高。欧洲专利(EP03105024.0)公开的洗脱液酸度较高，解吸液pH较低，一方面调节pH会重新引入无机盐杂质(过低的pH会使AA-2G在浓缩过程中降解)，不利于后续的浓缩，结晶操作；另一方面产生的废水也不利于环境。此外，这两个专利都使用了阴、阳两种离子交换树脂，树脂再生较繁琐。

因此本领域迫切需要提供一种操作步骤少、离子交换树脂种类少、柱分离洗脱液有利于后续浓缩的AA-2G的制备方法。

发明内容

本发明旨在提供一种从酶转化液中制备高纯度AA-2G的纯化方法。

在本发明中，提供了一种2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的制备方法，所述方法包括步骤：

将含有AA-2G的溶液与阴离子交换树脂接触并被吸附，用0.01-0.1mol/L的盐酸进行洗脱，收集洗脱液得到2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)。

在另一优选例中，用于洗脱的酸的浓度为0.01-0.09mol/L；更优选地，酸浓度为0.03-0.08mol/L。

在另一优选例中，含有AA-2G的溶液是将AA-2G的酶转化液经固液分离而得到的澄清液。

在另一优选例中，澄清液中含有的AA-2G经高效液相检测色谱峰纯度为40-60％，更优选为45-55％。

在另一优选例中，所述阴离子交换树脂为大孔强碱型阴离子交换树脂。

在另一优选例中，所述大孔强碱型阴离子交换树脂是中极性的；所述中极性的大孔型阴离子交换树脂的骨架为丙烯酸，主要成分为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。

在另一优选例中，用酸洗脱前先用去离子水洗使洗涤液中不含糖。

在另一优选例中，收集AA-2G色谱峰纯度在87％或以上的洗脱液。

在另一优选例中，将收集的AA-2G色谱峰纯度在87％或以上的洗脱液浓缩、降温结晶得到AA-2G晶体。

在另一优选例中，所述方法由下述步骤构成：

(1)将AA-2G的酶转化液经固液分离得到含有AA-2G的澄清液；

(2)将澄清液与阴离子交换树脂接触并被吸附，用去离子水洗涤直至洗涤液中不含糖，再用0.01-0.1N的酸进行洗脱，收集AA-2G色谱峰纯度在87％或以上的洗脱液；和

(3)将收集的AA-2G峰纯度在87％或以上的洗脱液浓缩、降温结晶得到AA-2G晶体。

据此，本发明提供了一种操作步骤少、离子交换树脂种类少、柱分离洗脱液有利于后续浓缩的AA-2G的制备方法。

附图说明

图1显示了本发明实施例获得的AA-2G晶体的质谱图，图谱中有M+23(361)峰和M+1(339)峰说明物质分子量为338与AA-2G的分子量符合。

图2显示了本发明实施例获得的AA-2G晶体在显微镜下的样貌。

具体实施方式

发明人经过广泛深入的研究，发现可以不必使用阳离子交换树脂，并使用低浓度的酸作为洗脱液可以达到从AA-2G酶转化液中纯化AA-2G的目的。在此基础上，完成了本发明。

本发明提供了一种AA-2G的制备方法，即从AA-2G的酶转化液中得到高纯度AA-2G的方法，所述方法不使用阳离子交换树脂(例如将AA-2G的酶转化液或将AA-2G的酶转化液进行固液分离得到的澄清液用阳离子树脂除盐等)，采用固液分离、中极性的大孔强碱型阴离子交换树脂(骨架为丙烯酸类，主要成分为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA))吸附解吸、浓缩、降温结晶的分离纯化方法，从AA-2G的酶转化液中制备高纯度的AA-2G。具体包括步骤：

第一步，AA-2G的酶转化液经过固液分离后获得含AA-2G的澄清液；

第二步，将获取的澄清液用中极性的大孔强碱型阴离子交换树脂吸附，去离子水洗后用低浓度的酸脱，洗脱液用HPLC检测后收集AA-2G色谱峰纯度在87％以上部分，得到AA-2G的纯化液备用；和

第三步，收集的AA-2G的纯化液浓缩后降温结晶，获得AA-2G的晶体。

上述第一步中涉及的酶转化液可来自本领域常规的通过酶触反应获得AA-2G的反应液，例如但不限于，反应底物溶液经环糊精葡萄糖基转移酶和葡萄糖淀粉酶依次作用催化后生成的含有AA-2G的混合溶液，其中包含反应底物Vc和淀粉等糖基供体、酶、产物等。

上述第一步中经过固液分离得到的澄清液中含有AA-2G和杂质；所述杂质包括维生素C、糖、酶转化的副产物，例如但不限于，AA-5G、AA-6G等。澄清液经HPLC检测AA-2G的色谱峰纯度为40-60％，优选为45-55％。所述固液分离可以使用本领域的常规方法进行，例如但不限于，膜滤、抽滤、离心等。

在本发明的一种优选方式中，为了提高收率，在第二步之前可先对澄清液初步分离去除杂质。具体操作是将第一步中获取的澄清液过中极性的大孔强碱型阴离子交换树脂吸附，用去离子水洗至流出液不含糖，再用低浓度的酸进行洗脱，收集AA-2G色谱峰纯度在80％上的洗脱液，与上柱的流出液合并，进行第二步操作。

上述提供的方法中所用的中极性的大孔强碱型阴离子交换树脂，其骨架为丙烯酸类，主要成分为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；优选使用FPA98(OH)、FPA53(OH)和IRA67(OH)等。

本发明提供的方法中所述用于洗脱的酸优选为无机酸，更优选为盐酸。本发明提供的方法中所述用于洗脱的酸的浓度范围在0.01mol/L-0.1mol/L，优选0.01mol/L-0.09mol/L，更优选0.03mol/L-0.08mol/L，最优选0.04mol/L-0.06mol/L。上述提供的方法中，将获取的澄清液用中极性的大孔强碱型阴离子交换树脂吸附后，先用离子水洗至洗涤液不含糖，再用低浓度的酸行洗脱。

上述第二步中，优选收集AA-2G色谱峰纯度在87％以上洗脱液作为纯化液备用。

上述第三步中，可以采用膜浓缩(反渗透膜、纳滤膜)，或减压浓缩等方式进行浓缩。采用减压浓缩方法温度在30℃—50℃，优选35℃—45℃。浓缩后使纯化液中AA-2G的浓度在650mg/ml—820mg/ml,优选680mg/ml以上。

上述第三步中，在本发明的一种实施方式中，将浓缩液置于结晶罐中进行降温结晶。结晶初始温度在35℃-50℃之间，优选40℃-45℃，降温终点温度在0℃-20℃之间，优选10℃-18℃。

如本文所用，“AA-2G纯度”即HPLC色谱峰纯度，指将得到的含AA-2G的固液或溶液，经过HPLC检测，根据所得到的色谱图谱，进行面积归一法而得到的如式I所示化合物的峰面积在所有峰面积总和中所占有的百分数。

所述的HPLC检测方法如下：

色谱柱：C18反向硅胶(XAqua—C184.6mm×250mm，5μm)；

柱温：30℃；

流动相：甲醇:磷酸二氢钾水溶液(2g/L)＝0.5:99.5(V/V)，用磷酸调pH至1.5，流速为0.7ml/min，进样量为5μl

检测器：紫外检测(λ＝238nm)

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明提供的制备方法操作步骤较少，不必用阳离子交换树脂进行脱盐处理。

2、本发明提供的制备方法中所用的洗脱剂酸度较低，解吸液不需要调节pH值，有利于后续浓缩结晶过程。

3、采用本发明提供的制备方法，经阴离子交换树脂解吸后所得的AA-2G解吸液高效液相色谱法检测峰纯度可达93.4％，获取的最终产品纯度可达99.81％。

4、本发明提供的制备方法更有利于AA-2G的工业化分离制备。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

取AA-2G的生物酶转化液2L，用超滤膜过滤，再用800ml去离子水顶洗，即可得到AA-2G的澄清滤液，备用。

取540ml滤液上柱，柱床体积为180ml，填料为FPA98(OH)(丙烯酸系)阴离子树脂，流速为1/40BV。上柱完毕后，用0.05mol/L的盐酸进行洗脱，洗脱液用HPLC检测，收集峰纯度在87％以上的部分，收率85％。

将收集的洗脱液减压浓缩，温度40℃，浓缩液浓度为721mg/ml，将浓缩液置于50ml结晶罐中，升温至40℃，按1.8‰(W/V)的比例加入晶种，搅拌，缓慢降温至10℃。过滤，洗晶，获得晶体，纯度为99.70％。

实施例2

取540ml滤液上柱，柱床体积为180ml，填料为FPA98(OH)(丙烯酸系)阴离子树脂，流速为1/40BV。上柱完毕后，用0.05mol/L的盐酸进行洗脱，洗脱液用HPLC检测，收集峰纯度在87％以上的部分，将该溶液与上柱的流出液部分合并。此操作步骤可以使目标产物(AA-2G)的峰纯度由54.8％提高到67.3％。

将上述合并液pH调至5.0-6.5，柱床体积为180ml，填料为FPA98(OH)(丙烯酸系)阴离子树脂，流速为1/40BV。上柱完毕后，用2BV纯水冲洗，用0.05mol/L的盐酸进行洗脱，洗脱液用HPLC检测，收集峰纯度在87％以上的部分，该步骤收率95％。

将收集的纯化液减压浓缩，温度40℃，最终获取的浓缩纯化液浓度为820mg/ml，置于50ml结晶罐中，升温至40℃，按1.8‰(W/V)的比例加入晶种，搅拌，缓慢降温至10℃。过滤，洗晶，获得晶体。经过HPLC方法检测，纯度为99.81％。

实施例3

其它操作同实施例1，不同之处在于洗脱液浓度为0.01mol/L的盐酸，收集峰纯度在87％以上洗脱液，收率93％，而后浓缩结晶，得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.60％。

实施例4

其它操作同实施例1，不同之处在于装柱所用填料为FPA53(OH)(丙烯酸系)，最后收集峰纯度在87％以上的洗脱液，收率57％，浓缩结晶，烘干得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.47％。

实施例5

其它操作同实施例1，不同之处在于装柱所用的填料为IRA67(OH)(丙烯酸系)，最后收集峰纯度在87％以上的洗脱液，收率55％，浓缩结晶，烘干获得晶体。经HPLC方法检测，样品纯度为99.53％。

实施例6

其它操作同实施例1，不同之处在于，结晶过程温度骤降至10℃，烘干得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.60％。

实施例7

其它操作同实施例1，不同之处在于，纯化液最后浓缩的浓度为580mg/ml，然后在40℃水浴条件下，加入无水乙醇至有微量固体析出，而后加入晶种，缓慢降温结晶。经HPLC方法检测，纯度为99.30％。

实施例8

其它操作同实施例1，不同之处在于洗脱液浓度为0.15mol/L的盐酸，收集峰纯度在87以上的洗脱液，收率49％，而后进行浓缩，结晶，获得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.20％。

实施例9

其它操作同实施例1，不同之处在于洗脱液浓度为0.1mol/L的盐酸，收集峰纯度在87％以上的洗脱液，收率61％，而后进行浓缩，结晶，获得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.24％。

实施例10

其它操作同实施例1，不同之处在于洗脱液浓度为0.08mol/L的盐酸，收集峰纯度在87％以上的洗脱液，收率78％，而后进行浓缩，结晶，获得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.31％。

对比实施例1

其它操作同实施例1，不同之处在于洗脱液浓度为0.2mol/L的盐酸，收集峰纯度在87％以上的洗脱液，收率33％，而后进行浓缩，结晶，获得晶体。经HPLC方法检测，纯度为99.13％。

对比实施例2

其它操作同实施例1，不同之处在于装柱所用填料为IRA410(OH)(骨架为苯乙烯—二乙烯苯(PS/DVB))，最后收集峰纯度在80％以上的洗脱液，收率40％，而后浓缩，结晶未能成功，加入酒精得沉淀烘干。经HPLC方法检测，纯度为89.20％。

对比实施例3

其它操作同实施例1，不同之处在于洗脱液为0.025mol/L的硫酸，经试验不能将目标产物与杂质分开。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的制备方法，其特征在于，所述方法由下述步骤构成：

(1)将AA-2G的酶转化液经固液分离得到含有AA-2G的澄清液；

(2)将澄清液与阴离子交换树脂接触并被吸附，用去离子水洗涤直至洗涤液中不含糖，再用0.01-0.09mol/L的盐酸进行洗脱，收集AA-2G色谱峰纯度在87％或以上的洗脱液；所述阴离子交换树脂的骨架为丙烯酸，主要成分为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA；和

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酸浓度为0.03-0.08mol/L。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，澄清液中含有的AA-2G经高效液相检测色谱峰纯度为40-60％。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，澄清液中含有的AA-2G经高效液相检测色谱峰纯度为45-55％。