CN103467576A

CN103467576A - 高纯度替考拉宁的分离纯化法

Info

Publication number: CN103467576A
Application number: CN2013101774679A
Authority: CN
Inventors: 吴学华; 贾坤; 吕祖平; 苗玉武
Original assignee: JIANGSU HAIKUP BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: JIANGSU HAIKUP BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-05-15
Also published as: CN103467576B

Abstract

本发明公开了一种高纯度替考拉宁的分离纯化法，是将替考拉宁发酵液用微滤膜除去发酵液中固含，含替考拉宁的微滤液通过纳滤膜浓缩，得到替考拉宁浓缩液；浓缩液再经过两次大孔吸附树脂吸附洗脱后，得到高纯度的替考拉宁洗脱液；最后将洗脱液纳滤浓缩，往浓缩液中加入蛋白沉淀剂丙酮，使浓缩液蛋白质沉淀，过滤除去蛋白质，得到滤液；往滤液中加入活性炭脱色，过滤得到脱色液；最后往脱色液中加入丙酮后低温结晶，晶体经真空干燥，获得纯度大于96%的高纯度的替考拉宁成品。本发明成本低，替考拉宁分离纯度高，适宜商业化大生产。

Description

高纯度替考拉宁的分离纯化法

技术领域

本发明涉及一种高纯度替考拉宁分离纯化方法，属于抗生素分离纯化技术领域。

背景技术

替考拉宁(Teicoplanin)为替考游动放线菌发酵产生的一组糖肽类抗生素，是继国际公认的抗耐药菌抗生素万古霉素后开发的另一种抗耐药菌糖肽类抗生素，主要对革兰氏阳性需氧和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染有很好的疗效，是目前临床上为数不多的仍具有对多重耐药性金黄色葡萄球菌和肠球菌有抗菌活性的药物之一。

替考拉宁是5个化学结构十分相似化合物Teicoplanin A2（TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5）和去酰基葡糖胺Teicoplanin A3 ( T-A3) 组成的混合物，其中TA2-2为主要有效成分多种成分组成的混合物。结构复杂，对热、酸、碱稳定性差，生产过程中容易引起失活和分解，且发酵液中替考拉宁的含量较低，目前采用的分离纯化过程较复杂。替考拉宁主要的提取方法有：溶媒萃取法、吸附法、离子交换法和色谱法。溶媒萃取法由于溶剂使用量大，分离纯化效果差，制备的最终产品纯度低，所以目前该法已经很少采用。离子交换法，由于使用酸性离子交换树脂会增加T-A2 糖基部分的降解，强碱性离子交换树脂却易增加T-A2 的差向异构化，且离子交换树脂因选择性较差也不能有效地用于纯化T- A2，因此该法的应用前景不被看好。色谱法，由于使用的色谱填料昂贵，生产成本高，不利于工业化运用。吸附法采用的主要介质为大孔吸附树脂、活性炭等，其原料易得、价格低廉，替考拉宁纯化效果好，已成为替考拉宁提取的主要方法。

发明内容

本发明提供了一种高纯度替考拉宁的分离纯化法，采用吸附法结合膜分离、结晶等方法，成本低，替考拉宁分离纯度高，适宜商业化大生产。

一种高纯度替考拉宁的分离纯化法，其特征在于步骤如下:

（1）将替考拉宁发酵液用微滤膜除去发酵液中固含，得到含替考拉宁的微滤液；微滤膜可除去发酵液中菌丝体、培养基等固含物质；微滤膜孔径为0.1μm；微滤膜材质为无机陶瓷膜；

（2）滤液通过截留分子量为700～800Da纳滤膜浓缩，得到替考拉宁浓缩液；

通过纳滤膜能减少微滤液中的水分，浓缩替考拉宁产物，减少后续树脂吸附上样的时间；

（3）替考拉宁浓缩液再经过两次树脂吸附洗脱后，得到高纯度的替考拉宁洗脱液；

所述的树脂均为大孔吸附树脂，其中包括AMBERLITE XAD 1180N、AMBERLITE XAD 7HP、DIAION HP20、上海华震HZ801和HZ816等；

所述的洗脱剂可以是丙酮、异丙醇或乙腈水溶液；

洗脱方法是采用低浓度的洗脱溶剂清洗以去除树脂上吸附的杂质和色素，中等浓度的洗脱溶剂对树脂吸附替考拉宁产物进行洗脱；其中,低浓度清洗丙酮、异丙醇和乙腈水溶液浓度分别为15～20%、15%～22%和16%～23%;中等浓度的洗脱溶剂丙酮、异丙醇和乙腈浓度分别为28～30%、25%～34%和30%～35%；

所述的洗脱剂pH为4.5或9.5，其中第一次树脂吸附采用含pH4.5磷酸盐缓冲液的溶剂清洗、洗脱，第二次树脂吸附采用pH9.5溶剂清洗、洗脱获得高纯的的洗脱组分；

（4）最后将洗脱液纳滤浓缩，采用蛋白质沉淀方法，使浓缩液的蛋白质沉淀，过滤除去蛋白质，得到滤液；

所述的蛋白质沉淀剂方法是将丙酮添加到浓缩液直到丙酮量达到60%（v/v）；在此条件下蛋白质从溶液中析出沉淀而替考拉宁产物仍然保留在溶液中，从而可通过过滤方式除去蛋白质；

（5）往滤液中加入活性炭脱色，过滤得到脱色液；

活性炭按照0.9～1.3%（w/v）的量加入，搅拌脱色30min；

（6）脱色液中添加丙酮后低温结晶，晶体经真空干燥后，获得纯度大于96%的高纯度的替考拉宁成品。

丙酮的体积是脱色液体积的3倍，结晶温度为4℃，结晶时间12h；真空的温度是30℃，时间是12h。

附图说明

图1是实施例1所分离的替考拉宁成品的液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

将70L替考拉宁发酵液通过微滤膜（孔径0.1μm,陶瓷微滤膜）去除发酵液中固含，当发酵液进料完成后，加入2倍体积水顶洗固含物，以回收替考拉宁产物。合并得到180L滤液，滤液通过纳滤(截留分子量700～800Da)浓缩至70L，浓缩液效价6.02g/L，替考拉宁含量421.4g。

取17L纳滤浓缩液（替考拉宁含量102.34g），上装有9L AMBERLITE XAD 7HP树脂吸附，上样流速9L/h。上柱结束后，用27L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质，清洗流速18L/h；继续用50L 15%丙酮水溶液（含20g/LNaH₂PO₄,磷酸调pH4.5）清洗树脂去除吸附能力弱的杂质，流速9L/h；最后用28%丙酮水溶液（含20g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH4.5）洗脱，流速9L/min。共收集得到洗脱液10L，效价8.42g/L，回收替考拉宁84.20g，过程收率为82.3%，产物液相色谱纯度78.6%。

将替考拉宁洗脱液用去离子水稀释至丙酮浓度小于20%，后用3M NaOH调pH9.5，上装有4L HZ816树脂柱吸附，上样流速4L/h。上柱结束后，用20L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质和丙酮，清洗流速8L/h；继续用20L 15%异丙醇水溶液（3MNaOH调pH9.5）清洗树脂去除吸附能力弱的杂质，流速4L/h；最后用25%异丙醇水溶液（3MNaOH调pH9.5）洗脱，流速4L/h。共收集得到洗脱液8.17L，效价8.69g/L，回收替考拉宁70.98g，过程收率为84.3%，产物液相色谱纯度87.82%。

将8.17L洗脱液通过纳滤(截留分子量700～800Da)浓缩至0.61L(替考拉宁效价约105g/L)；纳滤过程中，加入去离子水清洗浓缩液以去除异丙醇溶剂和无机盐。

往浓缩液中加入0.92L丙酮至浓度达到60%，静置沉淀蛋白质，后布式漏斗抽滤获得1.46L滤液。称取13.14g(添加量按0.9%（w/v）)药用活性炭，加入到滤液，室温搅拌脱色30min，后过滤获得1.43L脱色液。

往脱色液中迅速加入4.29L丙酮，后放置冰箱4℃结晶12h，后过滤得到晶体。将晶体放置真空干燥箱中，30℃真空干燥12h。最终的得到58.2g替考拉宁成品，经液相色谱检测纯度为96.25%（液相色谱图见图1）。

实例2

取实例1中30L纳滤浓缩液（替考拉宁含量180.6g），上装有10L HZ801树脂吸附，上样流速10L/h。上柱结束后，用30L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质，清洗流速20L/h；继续用50L 16%乙腈水溶液（含20g/LNaH₂PO₄,磷酸调pH4.5）清洗树脂去除吸附能力弱的杂质，流速10L/h；最后用30%乙腈水溶液（含20g/L NaH₂PO₄，磷酸调pH4.5）洗脱，流速10L/h。共收集得到洗脱液14.6L,效价11.4g/L，回收替考拉宁166.44g，过程收率为92.1%，产物液相色谱纯度81.5%。

将替考拉宁洗脱液用去离子水稀释至乙腈浓度小于20%，后用3MNaOH调pH9.5，上装有9L DIAION HP20树脂柱吸附，上样流速9L/h。上柱结束后，用36L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质和乙腈，清洗流速18L/h；继续用45L 20%异丙醇水溶液(3M NaOH调pH9.5)清洗树脂去除吸附能力弱的杂质和色素，流速9L/h；最后用30%异丙醇水溶液（3M NaOH调pH9.5）洗脱，流速9L/h。共收集得到洗脱液15.88L，效价8.92g/L，共回收替考拉宁141.65g，过程收率为85.1%，产物液相色谱纯度88.75%。

将15.88L洗脱液通过纳滤浓缩至1.35L(替考拉宁效价105g/L)；纳滤过程中，加入去离子水清洗浓缩液以去除异丙醇溶剂和无机盐。

往1.35L浓缩液中加入2.1L丙酮至浓度达到60%，静置沉淀蛋白质，后布式漏斗抽滤获得3.4L滤液。称取44.2g(添加量按1.3%（w/v）)药用活性炭，加入到滤液，室温搅拌脱色30min，后过滤获得3.23L脱色液。

往3.23L脱色液中迅速加入9.69L丙酮，后放置冰箱4℃结晶12h，后过滤得到晶体。将晶体放置真空干燥箱中，30℃ 真空干燥12h。最终的得到104.4g替考拉宁成品，经液相色谱检测纯度为96.78%。

实施例3

取实例1中20L纳滤浓缩液（替考拉宁含量120.4g），上装有6L AMBERLITE XAD 1180N树脂吸附，上样流速6L/h。上柱结束后，用24L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质，清洗流速12L/h；继续用24L 22%异丙醇水溶液（含20g/LNaH₂PO₄,磷酸调pH4.5）清洗树脂去除吸附能力弱的杂质，流速10L/h；最后用34%异丙醇水溶液（含20g/L NaH₂PO₄，磷酸调pH4.5）洗脱，流速6L/h。共收集得到洗脱液13.8L,效价7.59g/L，回收替考拉宁104.86g，过程收率为87.1%，产物液相色谱纯度85.5%。

将替考拉宁洗脱液用去离子水稀释至异丙醇浓度小于15%，后用3MNaOH调pH9.5，上装有6.5L HP20树脂柱吸附，上样流速6.5L/h。上柱结束后，用26L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质和异丙醇，清洗流速13L/h；继续用32.5L 23%乙腈水溶液(3M NaOH调pH9.5)清洗树脂去除吸附能力弱的杂质和色素，流速13L/h；最后用35%乙腈水溶液（3M NaOH调pH9.5）洗脱，流速6.5L/h。共收集得到洗脱液13.65L，效价6.73g/L，共回收替考拉宁91.76g，过程收率为87.5%，产物液相色谱纯度89.92%。

将13.65L洗脱液通过纳滤浓缩至0.87L(替考拉宁效价105g/L)；纳滤过程中，加入去离子水清洗浓缩液以去除乙腈溶剂和无机盐。

往0.87L浓缩液中加入1.30L丙酮至浓度达到60%，静置沉淀蛋白质，后布式漏斗抽滤获得2.06L滤液。称取20.60g(添加量按1.0%（w/v）)药用活性炭，加入到滤液，室温搅拌脱色30min，后过滤获得2.01L脱色液。

往2.01L脱色液中迅速加入6.03L丙酮，后放置冰箱4℃结晶12h，后过滤得到晶体。将晶体放置真空干燥箱中，30℃ 真空干燥12h。最终的得到82.58g替考拉宁成品，经液相色谱检测纯度为96.85%。

实施例4

与实施例1的不同内容在于：取17L纳滤浓缩液（替考拉宁含量102.34g），上装有9L AMBERLITE XAD 7HP树脂吸附，上样流速9L/h。上柱结束后，用27L去离子水清洗树脂以除去未吸附的杂质，清洗流速18L/h；继续用50L 20%丙酮水溶液（含20g/LNaH₂PO₄,磷酸调pH4.5）清洗树脂去除吸附能力弱的杂质，流速9L/h；最后用30%丙酮水溶液（含20g/LNaH₂PO₄，磷酸调pH4.5）洗脱，流速9L/min。共收集得到洗脱液10L，效价8.42g/L，回收替考拉宁84.20g，过程收率为82.3%，产物液相色谱纯度78.6%。

上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

Claims

1. 高纯度替考拉宁的分离纯化法，其特征在于，其包括如下步骤:

1）将替考拉宁发酵液用微滤膜除去发酵液中固含，收集滤液；

2）含替考拉宁的滤液通过纳滤膜浓缩，得到替考拉宁浓缩液；

3）替考拉宁浓缩液再经过两次大孔树脂吸附、洗脱后，得到高纯度的替考拉宁洗脱液；

4）最后将洗脱液纳滤浓缩，往浓缩液中加入蛋白质沉淀剂，使浓缩液蛋白质沉淀，过滤除去蛋白质，得到滤液；

5）往滤液中加入活性炭脱色，过滤得到脱色液；

6）最后往脱色液中加入丙酮后，低温结晶，晶体经真空干燥后，获得高纯度的替考拉宁成品。

2. 根据权利要求1 所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（1）所述微滤膜孔径为0.1μm。

3. 根据权利要求1 所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（2）所述纳滤膜截留分子量为700～800Da。

4. 根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（4）所述蛋白质沉淀剂为丙酮，且直至丙酮体积为浓缩液体积的60%。

5. 根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（5）所述滤液活性炭脱色，活性炭添加量为0.9～1.3%（w/v）的量加入，搅拌脱色30min。

6.根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（6）所述的结晶溶剂为丙酮，其体积是脱色液体积的3倍；所述的低温是4℃，结晶时间12h，所述真空干燥的温度是30℃，时间是12h。

7.根据权利要求1所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于步骤（3）大孔树脂洗脱所采用的洗脱剂是丙酮、异丙醇或乙腈水溶液；

第一、二次洗脱采用的洗脱剂的pH值分别为4.5，9.5，其中第一次树脂吸附采用含pH4.5磷酸盐缓冲液的溶剂清洗、洗脱，第二次树脂吸附采用pH9.5溶剂清洗、洗脱获得高纯的的洗脱组分；

洗脱方法是采用低浓度的洗脱溶剂清洗以去除树脂上吸附的杂质和色素，中等浓度的洗脱溶剂对树脂吸附替考拉宁产物进行洗脱；所述的低浓度对于丙酮、异丙醇和乙腈水溶液浓度分别为15～20%、15%～25%和16%～23%;所述的中等浓度的洗脱溶剂对于丙酮、异丙醇和乙腈浓度分别为28～30%、22%～30%和30%～35%。

8.根据权利要求7所述的高纯度替考拉宁分离纯化方法，其特征在于第一、二次洗脱采用的洗脱剂的，分别是含pH4.5磷酸盐缓冲液、pH9.5溶剂。