CN107164260B - 一种高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株及其应用 - Google Patents

一种高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明以替考游动放线菌FIM‑68(Actinoplanes teichomycoticus)为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术并筛选得到的诱变菌株，该诱变菌株为替考游动放线菌FIM‑68‑66(Actinoplanes teichomycoticus)，其能够发酵高产替考拉宁，大幅度提高了替考拉宁的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM‑68‑66稳定性良好，连续传代三代其产替考拉宁效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

Description

一种高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株及其应用
【技术领域】
本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株及其应用。
【背景技术】
替考拉宁(teicoplanin)是最新开发的一种抗耐药菌的糖肽类抗生素，与当前国际上公认的抗耐药菌抗生素万古霉素相比，替考拉宁具有与之相似的抗菌活性，相同的作用机制，相近或更优的临床疗效，而且毒性反应更低，特别是肾毒性更低，是目前临床上为数不多的对多重耐药性金葡菌和肠球菌仍有抗菌活性的药物之一。
现有生产方法中，一般采用微生物发酵生产替考拉宁为主，并对发酵获得的替考拉宁粗品进行纯化。发酵液中替考拉宁，包括TAl～TA2，其中TA2是替考拉宁的主要活性成分，主要由5个化学结构十分相似的化合物(TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5)组成。1978年最早发现能产生替考拉宁的菌株，鉴定为放线菌A.teichomyceticus nov.sp.(ATCC31121)，该菌株被美国标准生物品收藏中心(ATCC)收录，即ATCC31121。我国最早从江西省井岗山土壤中分离到1株产生替考拉宁的稀有放线菌SIIA92-363，后经生物学鉴定，定名为替考游动放线菌吉安变种(A.teichomyceticus var.Jisnensis.nov.SIIA92-363)。
目前针对替考拉宁菌株改良的选育技术中主要是采用的是紫外诱变结合不同诱变剂，和原生质体融合技术等育种手段；例如：Cheong等从韩国采集的土样里分离出1株突变株，称为A.teichomyceticus BNG23，为了进一步提高其产能，对其进行紫外处理并获得了菌株A.teichomyceticus BNG2315，该菌株的产能已达ATCC31121菌株的60倍，现在已被保存在韩国菌种保藏中心，编号为KCCM-10601；金志华等对出发菌A.teichomyceticus987-5-74(四川抗菌素菌种保藏中心保藏)进行紫外诱变后，用缬氨酸氧肟酸为筛选剂，获得了1株抗性变株A.teichomyceticus98-1-227，其发酵总效价达2091μg/mL；吴军营等以替考游动放线菌XYU-28为出发菌株，经紫外线诱变处理，将诱变后的孢子悬液涂布在含有0.25％醋酸钠的分离培养基上，筛选醋酸钠抗性突变菌株，得到的04-10-3菌株的发酵单位比出发菌株XYU-28提高了55％；由上可知紫外诱变结合不同诱变剂已取得一定的效果，然而长期使用这些诱变剂处理同一菌种，由于突变的不定向性及突变的累积使得在获得高产的同时菌株在生活能力、产孢量等方面会明显减弱，并且多次诱变往往导致较高的负突变率和抗性饱和，从而使得菌株改善的空间不足。徐波等利用基因组重排(genomeshuffling)技术通过菌丝体制备、原生质体融合、再生方法，获得3株高产菌株，其中SIIA05-03-136菌株的产量(3016μg/mL)；虽然以分子生物学为基础的基因组重排定向构建功能细胞株提供了广阔前景，但要真正实现以这些功能细胞培养来达到改造目标却极其困难；且由于微生物体内代谢网络的复杂性和多结点性，基因操作后菌株的代谢流往往并不朝着预期设计的方向转移，尤其是在产生抗生素等次级代谢产物的复杂体系中，要想得到优良的工业生产菌株是非常有难度的。
有鉴于此，获得一株符合工业化生产且能够高产替考拉宁的菌株是从业人员所迫切期望地。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株，诱变菌株为替考游动放线菌FIM-68-66(Actinoplanes teichom ycoticus)，于2016年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.13469。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本实验室以替考游动放线菌FIM-68(Actinoplanes teichomycoticus)为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术并筛选得到的菌株，对该菌株的理化特性等进行鉴定，最终鉴定其为替考游动放线菌菌属的一株菌株。
同时，本发明揭露了该替考游动放线菌FIM-68-66(Actinoplanesteichomycoticus)在发酵生产替考拉宁中的应用。
本发明的有益效果在于：
提供了一种替考游动放线菌FIM-68-66(Actinoplanes teichomycoticus)，其能够发酵高产替考拉宁，大幅度提高了替考拉宁的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM-68-66稳定性良好，连续传代三代其产替考拉宁效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中致死率曲线。
【具体实施方式】
本发明中替考游动放线菌FIM-68-66(Actinoplanes teichomycoticus)是以替考游动放线菌FIM-68(Actinoplanes teichomycoticus)为出发菌株、并采用常压室温等离子体诱变技术筛选得到的菌株，该菌株能够发酵生产替考拉宁，且产量优异。
实施例1、菌株FIM-68的分离
(1)于福建省南平市武夷山茶园采集土壤，具体地，用取样铲将表层10cm左右的浮土除去，采集10cm处土样10g～25g；称取2g土样并加入10mL无菌生理盐水，振荡后静置30min，取上清液即原液并用无菌生理盐水进行梯度稀释，选用稀释度为10-2、10-3、10-4和10-5的悬浮液；
(2)分别取原液及选用的悬浮液0.1mL涂布于添加50mg/L重铬酸钾的水配制的ISP-4培养基上，每个样重复3个平行板，然后将涂布后的平板置于28℃培养，观察菌落外观、大小、颜色、边缘形状、表面干湿状态等形态特征；
(3)在无菌操作条件下，培养8-12天后挑出菌落圆形或椭圆形，表面呈皱褶，浅橘黄色或暗红色，产色素等具有代表性的单菌落，划线接种于ISP-4培养基斜面，置于28℃条件下培养8-12天，分离纯化得到菌株，将得到的菌株命名为菌株FIM-68，并于-80℃条件下将分离获得的菌株FIM-68以20％甘油保存。
实施例2、菌株FIM-68的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-68在ISP-4培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，30℃培养7～20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝，得到该菌株FIM-68的主要形态及生理生化特性如下：
菌体为革兰氏阳性菌，基内菌丝分枝好，无横隔；孢囊直接着生在基内菌丝上或孢囊梗上，孢囊梗长2.3～2.8μm，直径1.4～1.8μm，无横隔，孢囊呈球形，直径14～17μm；孢囊内孢子不规则排列，孢子呈圆形或椭圆形，直径0.5～0.7×1.0～1.3μm，靠极生单鞭毛游动；在平板上，菌落圆形，菌落培养10d直径达3～4mm，表面呈皱褶、且呈浅橘黄，基内菌丝为褐色，并产褐色可溶性色素；在蛋白胨-明胶培养基上能液化明胶，水解淀粉能力强,还原硝酸盐，可分解纤维素，酪氨酸不水解，酪蛋白水解，产生黑色素，牛奶先胨化后微弱凝固；能很好利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇；对乳糖、水杨素、纤维素利用较弱；不能利用鼠李糖、肌醇和棉籽糖。且此菌株FIM-68为高耗氧菌，生长温度为23～37℃，最适生长温度为28-32℃，生长pH值为5.5～10，最佳生长pH为7且偏碱性。
(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-68的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-68与替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)的序列同源性为100％。
结合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株FIM-68为替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)。
且菌株FIM-68即替考游动放线菌FIM-68(Actinoplanes teichomycoticus)，于2017年02月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.13658。
实施例3、菌株FIM-68-66的获得
(1)、取所述菌株FIM-68并转接至ISP-4培养基上，并于恒温培养箱中培养8-15天，且培养温度为30℃；之后用生理盐水洗下ISP-4培养基上的孢子，玻璃珠打散，经纱布过滤，制成106个/mL的孢子悬液；
(2)、用移液枪吸取10μL步骤(1)制得的孢子悬液于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体、电源功率为110W、工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变系统中，且处理距离为2mm，分别处理15s、30s、40s、45s、50s、55s、60s、65s、70s，将处理后的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线(如图1所示)；从图1中可以看出诱变处理剂量与菌株FIM-68菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高；
(3)、根据步骤(1)的致死率曲线，选择15s、40s、60s三个不同致死剂量的照射时间，对菌株FIM-68的孢子悬液进行等离子体诱变；
(4)、将步骤(3)中三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀，得诱变孢子悬液，备用；
(5)、取步骤(1)中的孢子悬液，并分别涂布于含替考拉宁的平板培养基中，其中平板培养基中替考拉宁浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、7g/L、8g/L；于30℃培养8-15天后，观察不同平板上的菌落生长情况(观察结果如下表1所示)，未长出菌落的平板培养基中对应替考拉宁最低作用浓度为抗自身代谢产物替考拉宁最小抑菌浓度，则由表1确定抗替考拉宁最小抑菌浓度为6g/L；
表1替考拉宁浓度对菌株FIM-68孢子生长的影响
替考拉宁(μg/mL) 500 1000 2000 4000 6000 8000
菌落生长情况 ++ ++ + +- - -
注:+有菌落生长,-无菌落生长。
(6)、将步骤(4)所得诱变孢子悬液进行梯度稀释，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，选取10-4、10-5、10-6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于含6g/L替考拉宁的抗性平板上，于30℃避光培养8-15d；
(7)、将步骤(6)中各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面培养基上培养10天后，以1％的接种量接种于种子培养基中，于30℃、230r/min条件下培养45-50h后得种子液；以10％的接种量将种子液接种于发酵培养基种，于30℃、230r/min条件下培养5-10d，得发酵液；
(8)取步骤(7)中所得发酵液适量，加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、4000r/min离心10min，上清液过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定替考拉宁的产量，通过此方法即筛选出产替考拉宁量最大的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株FIM-68-66，且菌株FIM-68-66于甘油中保存。
实施例4、菌株FIM-68-66的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-68-66在ISP-4培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，30℃培养7～20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝，得到该菌株FIM-68-66的主要形态及生理生化特性如下：
菌体为革兰氏阳性菌，基内菌丝分枝好，无横隔；孢囊直接着生在基内菌丝上或孢囊梗上，孢囊梗长2.3～3.0μm，直径1.5～1.8μm，无横隔，孢囊呈球形，直径14～17μm；孢囊内孢子不规则排列，孢子呈圆形或椭圆形，直径0.5～0.7×1.0～1.3μm，靠极生单鞭毛游动；在平板上，菌落不规则，中心呈草帽状突起，表面呈皱褶、粒状，橘黄色，基内菌丝为褐色，并产褐色可溶性色素，随着培养时间的延长，菌落由橘黄色变成黄褐色；在蛋白胨-明胶培养基上能液化明胶，水解淀粉能力强，还原硝酸盐，可分解纤维素，酪氨酸不水解，酪蛋白水解，产生黑色素，牛奶先胨化后微弱凝固；能很好利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇；对乳糖、水杨素、纤维素利用较弱；不能利用鼠李糖、肌醇和棉籽糖。此菌株FIM-68-66为高耗氧菌，最适生长温度为28-32℃，最适生长pH为7.0-7.5；在摇床转速为210～280r/min，培养5-9d时，替考拉宁产量最高，发酵过程中溶氧对替考拉宁的产生具有显著作用。
(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-68-66的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-68-66与替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)的序列同源性为100％。
结合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株FIM-68-66为替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)。
实施例5、菌株FIM-68-66发酵生产替考拉宁
菌株FIM-68-66的活化：将采用甘油保存的菌株FIM-68-66转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8-15天，且培养温度为30℃；
制备种子液：将菌株FIM-68-66活化所得的单菌落接种于种子培养基(500mL三角瓶内装50mL种子培养基)中，于30℃、230r/min条件下培养45-50h，得种子液；
发酵培养：将制得的种子液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基(500mL三角瓶内装50mL发酵培养基)中，于30℃、230r/min条件下发酵培养6d，之后将所得发酵液进行检测；检测结果：菌株FIM-68-66在发酵培养基上替考拉宁的产量为5800-6035mg/L。
实施例6、菌株FIM-68-66的遗传稳定性验证
将经实施例5验证过的高产替考拉宁的菌株FIM-68-66进行500ml摇瓶连续培养3～5代，以检测其遗传稳定性，菌株传代发酵实验结果如下：
对高产抗性发菌株FIM-68-66连续传代5次：F1、F2、F3、F4、F5，经摇瓶发酵后测定发酵效价，以生长良好的原代菌株(F0)为对照，结果见如下表2。
表2传代对菌株FIM-68-66产替考拉宁的影响
菌株代数 F0 F1 F2 F3 F4 F5
相对效价(％) 100 100.7 99.8 98.6 85.7 77.2
由表2可知，菌株FIM-68-66传三代发酵水平无明显影响，其产替考拉宁效价基本稳定，维持在同一较高水平；从而表明菌株FIM-68-66具有较好的遗传稳定特性，目标菌种即菌株FIM-68-66替考拉宁水平最终维持在5800μg/ml左右，相对于出发菌株即菌株FIM-68(2000μg/ml左右)提高了190％左右，所以突变菌株替考游动放线菌FIM-68-66(Actinoplanes teichomycoticus)能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
另外，需要说明的是，在发明所涉及的各培养基的组分如下：平板培养基、斜面培养基、抗性平板及ISP-4培养基的组分均为：可溶性淀粉1％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O0.1％、NaCl 0.1％、(NH4)2SO4 0.2％、CaCO3 0.2％，FeSO4·7H2O 0.0001％、MnCl2·7H2O0.0001％、琼脂1.8％、余量为蒸馏水补足，pH 7.2-8.0，121℃高压蒸汽灭菌30min；种子培养基的组分为：可溶性淀粉4.0％、黄豆粉2.0％、葡萄糖1.0％、酵母粉0.3％、硫酸镁0.05％、硫酸铵0.2％、碳酸钙0.5％、余量为蒸馏水，pH7.2-8.0，121℃高压蒸汽灭菌30min；发酵培养基的组分为：可溶性淀粉2.0％、糊精1.0％、葡糖糖0.5％、黄豆粉2.5％、棉籽饼粉1.2％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.02％、氯化镁0.04％、硫酸铵0.02％、碳酸钙0.3％、余量为蒸馏水，pH7.2-8.0，121℃高压蒸汽灭菌30min；且在无特殊说明的情形下，本发明中的百分数均为质量百分数。
综上，本发明提供一种替考游动放线菌FIM-68-66(Actinoplanesteichomycoticus)，其能够发酵高产替考拉宁，大幅度提高了替考拉宁的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM-68-66稳定性良好，连续传代三代其产替考拉宁效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省微生物研究所
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ttcggccgca tggttgttgg tggaaagttt ttcggtttgg gatgggctcg cggcctatca 180
gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga 240
ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300
ttgcacaatg ggcggaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt 360
tgtaaacctc tttcagcagg gacgaagcgt aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg 420
ccaactacgt gccagcagcc gcggtaagac gtagggcgcg agcgttgtcc ggatttattg 480
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agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcgggt ctctgggccg 660
atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 720
acgctgtaaa cgttgggcgc taggtgtggg ggacctctcc ggtcttctgc gccgcagcta 780
acgcattaag cgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac 840
gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga tgcaacgcga agaaccttac 900
ctgggtttga catcaccgca aatcttccag agatgggagg tccttcgggg gcggtgacag 960
gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020
gcaaccctcg ttcgatgttg ccagcgcgtt atggcgggga ctcatcgaag actgccgggg 1080
tcaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg ccccttatgt ccagggcttc 1140
acgcatgcta caatggccgg tacaaagggc tgcgaaatcg taaggtggag cgaatcccaa 1200
aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc ccgtgaagtc ggagtcgcta 1260
gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1320
tcacgtcacg aaagtcggca acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt gggagggagc 1380
cgtcga 1386
<210> 2
<211> 1386
<212> DNA
<213> 替考游动放线菌FIM-68-66（A c t i n o p l a n e s t e i c h o m y c o ti c u s）
<400> 2
tgcagtcgag cggaaggccc ttcggggtac tcgagcggcg aacgggtgag taacacgtga 60
gtaacctgcc ccagactttg ggataaccct cggaaacggg ggctaatacc ggatatgacc 120
ttcggccgca tggttgttgg tggaaagttt ttcggtttgg gatgggctcg cggcctatca 180
gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga 240
ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300
ttgcacaatg ggcggaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt 360
tgtaaacctc tttcagcagg gacgaagcgt aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg 420
ccaactacgt gccagcagcc gcggtaagac gtagggcgcg agcgttgtcc ggatttattg 480
ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc gtcgtctgtg aaaacttggg gctcaacccc 540
aagcttgcag tcgatacggg caggctagag ttcggtaggg gagactggaa ttcctggtgt 600
agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcgggt ctctgggccg 660
atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 720
acgctgtaaa cgttgggcgc taggtgtggg ggacctctcc ggtcttctgc gccgcagcta 780
acgcattaag cgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac 840
gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga tgcaacgcga agaaccttac 900
ctgggtttga catcaccgca aatcttccag agatgggagg tccttcgggg gcggtgacag 960
gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020
gcaaccctcg ttcgatgttg ccagcgcgtt atggcgggga ctcatcgaag actgccgggg 1080
tcaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg ccccttatgt ccagggcttc 1140
acgcatgcta caatggccgg tacaaagggc tgcgaaatcg taaggtggag cgaatcccaa 1200
aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc ccgtgaagtc ggagtcgcta 1260
gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1320
tcacgtcacg aaagtcggca acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt gggagggagc 1380
cgtcga 1386

Claims (2)

1.一种高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株，其特征在于：所述诱变菌株为替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)FIM-68-66，于2016年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13469；所述诱变菌株是以替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)FIM-68为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术并筛选得到的菌株。
2.一种权利要求1所述高产替考拉宁的替考游动放线菌诱变菌株的应用，其特征在于：所述替考游动放线菌(Actinoplanes teichomycoticus)FIM-68-66在发酵生产替考拉宁中的应用。
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