CN107245460B - 一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株及其应用 - Google Patents

一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明以吸水链霉菌FIM‑311(Streptomyces hygroscopicus)为出发菌株、并采用常压室温等离子体诱变技术筛选得到的菌株，该菌株为吸水链霉菌FIM‑311‑80(Streptomyces hygroscopicus)，其能够发酵高产子囊霉素，大幅度提高了子囊霉素的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM‑311‑80稳定性良好，连续传代四代其产子囊霉素效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

Description

一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株及其应用
【技术领域】
本发明属于微生物领域，具体涉及一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株及其应用。
【背景技术】
大环内酯类免疫抑制剂是一类具有经体内外研究证明具有显著的免疫抑制作用的大环内酯结构的免疫抑制剂，其代表物质为子囊霉素(ascomycin，FK-520)及其衍生物、他克莫司(tacrolimus,FK506)、西罗莫司(sirolimus,rapamycin)等。大环内酯类免疫抑制剂可被用于治疗器官移植的排异反应和自身免疫相关性疾病等。
子囊霉素是一种由二十三元环组成的大环内酯类化合物，其药用机理与他克莫司相似，可应用于治疗特应性皮炎、变应性接触性皮炎、银屑病、红斑狼疮、扁平苔癣、白癜风、Netherton综合症和抑制宿主病等自身免疫疾病的治疗。近年来，一系列研究发现子囊霉素及其衍生物还具有抗痉挛、抗疟疾、神经保护再生等功能活性。子囊霉素衍生物“吡美莫司”于2001年被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市，是治疗特异性皮炎早起缓解和长期控制的非甾体类药物；据报道，2006年子囊霉素美国的市场售价为150000美元/Kg，其衍生物“吡美莫司”的市场售价为500000美元/Kg，吡美莫司在美国的销售额达159248000美元。子囊霉素及其衍生物的药用价值和市场价值巨大，子囊霉素一般采用微生物发酵生产，现有菌株发酵生产子囊霉素的产量相对较低，发酵水平相对较低，国内仅有131.7mg/L，国外虽然高达350～400mg/L，但成本过高是限制它使用的一个主要原因。因此，选育高产菌株，研究菌株特性及发酵行为，对于提高子囊霉素的生产性能，具有重要科学价值。
目前常用的菌种选育技术(strain improvement)根据其原理可分成随机选育(random screening)和理性选育(rationalizedselection)两大类。虽然以分子生物学为基础的基因工程、代谢工程以及由各种组学组成的系统生物学研究为定向构建功能细胞株提供了广阔前景，但要真正实现以这些功能细胞培养来达到改造目标却极其困难。由于微生物体内代谢网络的复杂性和多结点性，基因操作后菌株的代谢流往往并不朝着预期设计的方向转移。尤其是在产生抗生素等次级代谢产物的复杂体系中，要想得到优良的工业生产菌株，主要还是采用随机选育技术。长期以来针对吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)菌株改良的随机选育技术中主要采用的是紫外诱变和NTG诱变等传统的育种手段，且已取得一定的效果，然而长期使用这些诱变剂处理同一菌种，由于突变的不定向性及突变的累积使得在获得高产的同时菌株在生活能力、产孢量等方面会明显减弱，并且多次诱变往往导致较高的负突变率和抗性饱和，从而使得菌株改善的空间不足。
有鉴于此，获得一株能够高产子囊霉素并且具有良好改善空间的菌株是从业人员所迫切期望地。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株，诱变菌株为吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)，于2016年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.13470。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本实验室以吸水链霉菌FIM-311(Streptomyces hygroscopicus)为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术并筛选得到的菌株，对该菌株的理化特性等进行鉴定，最终鉴定其为吸水链霉菌菌属的一株菌株。
同时，本发明揭露了该吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)在发酵生产子囊霉素中的应用。
本发明的有益效果在于：
提供一种吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)，其能够发酵高产子囊霉素，大幅度提高了子囊霉素的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM-311-80稳定性良好，连续传代四代其产子囊霉素效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中致死率曲线。
【具体实施方式】
本发明中吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)是以吸水链霉菌FIM-311(Streptomyces hygroscopicus)为出发菌株、并采用常压室温等离子体诱变技术筛选得到的菌株，该菌株能够发酵生产子囊霉素，且产量优异。
实施例1、菌株FIM-311的分离
(1)于福建省福州市鼓岭树林下采集土壤，具体地，用取样铲将表层10cm左右的浮土除去，采集10cm处土样10g～25g；称取2g土样并加入10mL无菌生理盐水，振荡后静置30min，取上清液即原液并用无菌生理盐水进行梯度稀释，选用稀释度为10-2、10-3、10-4和10-5的悬浮液；
(2)分别取原液及选用的悬浮液0.1mL涂布于添加50mg/L重铬酸钾的水配制的燕麦琼脂培养基平板上，每个样重复3个平行板，然后将涂布后的平板置于28℃培养，观察菌落外观、大小、颜色、边缘形状、表面干湿状态等形态特征；
(3)无菌操作条件下，培养8-12天后挑出菌落圆形、菌落中心突起、表面呈皱褶、浅灰色或灰黑色、气生菌丝吸水等具有代表性的单菌落，并划线接种于燕麦琼脂培养基斜面，置于28℃条件下培养，分离纯化得到菌株，并将得到的菌株命名为菌株FIM-311，然后于-80℃条件下将分离获得的菌株FIM-311以20％甘油保存。
实施例2、菌株FIM-311的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-311在燕麦琼脂培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片,28℃培养7～20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。得到该菌株FIM-311的主要形态及生理生化特性如下：
成熟孢子链有10～42个孢子，孢子形状呈椭圆或圆柱形状，0.5～0.7×0.7～0.8μm。孢子聚集成堆，产生黑色斑点；在平板上，菌落圆形，菌落培养10d直径约5～6mm，中心突起，表面呈皱褶，浅灰色或灰黑色，基内菌丝为浅黄褐色，产可溶性色素，气生菌丝吸水，随着培养时间的延长，菌落由灰色变成黑色；可利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、柠檬酸钠，不利用阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉籽糖、醋酸钠，在马铃薯块-明胶培养基上明胶液化，牛奶胨化，淀粉水解，纤维素上生长好，产生类黑色素和酪氨酸酶；此菌株FIM-311为高耗氧菌，生长温度为18～35℃，最适生长温度为24-30℃，生长pH值为4.5～9.5，最佳生长pH为5～8。
(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-311的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-311与吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的序列同源性为100％。
结合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株FIM-311属于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)菌属。
且菌株FIM-311即水链霉菌FIM-311(Streptomyces hygroscopicus)，于2017年02月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.13659。
实施例3、菌株FIM-311-80的获得
(1)、取所述菌株FIM-311并转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8-12天，且培养温度为28℃；之后用生理盐水洗下斜面培养基上的孢子，玻璃珠打散，经纱布过滤，制成106个/mL的孢子悬液；
(2)、用移液枪吸取10μL步骤(1)制得的孢子悬液于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体、电源功率为110W、工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变系统中，且处理距离为2mm，分别处理5s、10s、15s、30s、45s、60s、60s、75s、90s，将处理后的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线(如图1所示)；从中可以看出诱变处理剂量与菌株FIM-311菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高；
(3)、根据步骤(1)的致死率曲线，选择5s、30s两个不同致死剂量的照射时间，对菌株FIM-311的孢子悬液进行等离子体诱变；
(4)、将步骤(3)中两个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀，得诱变孢子悬液，备用；
(5)、将步骤(4)所得诱变孢子悬液进行梯度稀释，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，选取10-4、10-5、10-6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于分离平板培养基上，于28℃避光培养8-12d；
(6)、将步骤(5)中各个分离平板上长出的单菌落转接斜面培养基上培养10天后，以1％的接种量接种于种子培养基中，于30℃、230r/min条件下培养45-50h后得种子液；以10％的接种量将种子液接种于发酵培养基中，于30℃、230r/min条件下培养3-6d，得发酵液；
(7)取步骤(6)中所得发酵液适量，加入两倍体积的无水乙醇，即发酵液与无水乙醇的体积比为1:2，充分振荡、静置、4000r/min离心10min，上清液过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定子囊霉素的产量，通过此方法即筛选出产子囊霉素量最大的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株FIM-311-80，且菌株FIM-311-80于甘油中保存。
实施例4、菌株FIM-311-80的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-311-80在燕麦琼脂培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，28℃培养7～20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。得到该菌株FIM-311的主要形态及生理生化特性如下：
成熟孢子链有10～42个孢子，孢子形状呈椭圆或圆柱形状，0.5～0.7×0.7～0.8μm；孢子聚集成堆，产生黑色斑点；在平板上，菌落不规则，中心呈草帽状突起，表面呈皱褶，灰黑色或褐色，基内菌丝为黄褐色，产可溶性色素，气生菌丝吸水，随着培养时间的延长，菌落由灰色变成灰黑色或表面菌丝逐渐变黑；可利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、柠檬酸钠，不利用阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉籽糖、醋酸钠，在马铃薯块—明胶培养基上明胶液化，牛奶胨化，淀粉水解，纤维素上生长好，产生类黑色素和酪氨酸酶；此菌株为高耗氧菌，最适生长温度为26-30℃，最适生长pH为7.0-7.2；在摇床转速为230～280r/min，培养3-6d时，子囊霉素产量最高，发酵过程中溶氧对子囊霉素的产生具有显著作用。
(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-311-80的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.2所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-311-80与与吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的序列同源性为100％。
通过上述的鉴定，可确定该菌株FIM-311-80属于吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)菌属。
实施例5、菌株FIM-311-80发酵生产子囊霉素
菌株FIM-311-80的活化：将采用甘油保存的菌株FIM-311-80转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8-12天，且培养温度为28℃；
制备种子液：将菌株FIM-311-80活化所得的单菌落接种于种子培养基(500mL三角瓶内装60mL种子培养基)中，于28℃、250r/min条件下培养40-60h，得种子液；
发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(500mL三角瓶内装60mL发酵培养基)中，于28℃、250r/min条件下发酵培养3-6d，之后将所得发酵液进行检测；检测结果：菌株FIM-311-80在发酵培养基上子囊霉素的产量高达546mg/L。
实施例6、菌株FIM-311-80的遗传稳定性验证
将经实施例5验证过的高产子囊霉素的菌株FIM-311-80进行500ml摇瓶连续培养3～5代，以检测其遗传稳定性，菌株传代发酵实验结果如下：
对高产抗性菌株FIM-311-80连续传代5次：F1、F2、F3、F4、F5，经摇瓶发酵后测定发酵效价，以生长良好的原代菌株(F0)为对照，结果见如下表1。
表1传代对菌株FIM-311-80产子囊霉素的影响
菌株代数 F0 F1 F2 F3 F4 F5
相对效价(％) 100 100.3 100.6 99.5 99.2 94.3
由表1可知，菌株FIM-311-80传四代发酵水平无明显影响，其子囊霉素效价基本稳定，维持在同一较高水平；从而表明菌株FIM-311-80具有较好的遗传稳定特性，目标菌种即菌株FIM-311-80产子囊霉素水平最终维持在546mg/L左右，相对于出发菌株即菌株FIM-311(90mg/L)提高了500％左右，所以诱变菌株吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyceshygroscopicus)能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
另外，需要说明的是，在发明所涉及的各培养基的组分如下：分离平板培养基、斜面培养基、及燕麦琼脂培养基的组分均为：燕麦粉2％、琼脂2％、余量为蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌30min；种子培养基的组分为：葡萄糖0.5％、燕麦粉1％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.15％、NaCl 0.2％、余量为蒸馏水，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min；发酵培养基的组分为：糊精5.5％、黄豆粉2％、玉米浆粉0.5％、酵母粉0.2％、蛋白胨0.3％、K2HPO40.1％、碳酸钙0.05％、余量为蒸馏水，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min；且在无特殊说明的情形下，本发明中的百分数均为质量百分数。
综上，本发明提供一种吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)，其能够发酵高产子囊霉素，大幅度提高了子囊霉素的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株FIM-311-80稳定性良好，连续传代四代其产子囊霉素效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省微生物研究所
<120> 一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株及其应用
<130> 10000
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> 吸水链霉菌FIM-311（Streptomyces hygroscopicus）
<400> 1
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cgcaacgagc gcaacccttg ttctgtgttg ccagcatgcc tttcggggtg atggggactc 1080
acaggagact gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc 1140
cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa tggccggtac aatgagctgc gaagccgtga 1200
ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca 1260
tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc 1320
cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcccaac 1380
ccttgtgggg gagcc 1395

Claims (2)

1.一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株，其特征在于：所述诱变菌株为吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)，于2016年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13470；所述诱变菌株是以吸水链霉菌FIM-311(Streptomyces hygroscopicus)为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术并筛选得到的菌株。
2.一种权利要求1所述高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株的应用，其特征在于：所述吸水链霉菌FIM-311-80(Streptomyces hygroscopicus)在发酵生产子囊霉素中的应用。
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