KR101925695B1 - 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은（1）반코마이신 조생성물은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 반코마이신 염산염 용액으로 얻어지고, 나노 여과에 의해 탈염 농축되어，농축액을 얻는 단계；（2）염산 용액으로 농축액의 pH를 조절한 뒤, pH 조절된 농축액을 역상 크로마토그래피 컬럼으로 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계;（3）반코마이신 B의 크로마토그래피액을 수집함으로써 혼합 크로마토그래피액을 얻도록 하는 단계;（4）염산으로 혼합 크로마토그래피액을 조절한 뒤, 나노 여과에 의해 용매와 염을 농축하여 제거함으로써 농축액을 얻도록 하는 단계; 및 (5）단계(4)의 농축액을 탈수 건조하거나 또는 용매 결정 또는 염석법 결정에 의해 크로마토그래피 순도가 99%에 달하는 외관이 새하얀 반코마이신 염산염 분말을 얻는 단계를 포함하는, 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 제품의 품질을 향상시켰을 뿐만 아니라 확장된 상업화 생산에 적합하다.

Description

고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법{Separation and Purification Method for Vancomycin Hydrochloride of High Purity}

본발명은 고순도 반코마이신 염산염(Vancomycin hydrochloride)의 분리 정제방법에 관한 것이다. 상기 방법은 크로마토그래피 순도가 90% 정도인 반코마이신 조생성물을 원료로 우선 물-염 유동상을 함유한 스파 덱스 겔 컬럼에 의해 크로마토그래피를 수행하여 크로마토그래피 순도가 95% 초과하는 반코마이신 염산염을 수집하고 나노 여과 탈염을 수행하여 100mg/ml-200mg/ml로 농축한 다음, 역상 C18 실리카겔 크로마토그래피 컬럼 또는 역상 중합체 크로마토그래피 컬럼을 거치고 암모늄염을 함유한 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액을 유동상으로 용리하여, 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 반코마이신 염산염을 수집하며 다시 나노 여과에 의해 용매를 제거한 다음, 150mg/ml-250mg/ml로 농축하고 동결 건조하여, 크로마토그래피 순도가 99%에 달하며 외관이 새하얀 반코마이신 염산염을 얻었다.

반코마이신 염산염은 방성균속 Amycolatopsis orienatalis이 발효 조건을 제어하는 조건에서 발생한 양성 글리코펩타이드계 항생제로서 화학식은 C₆₆H₇₅C_l2N₉O₂₄·HCl이고 분자량은 1.486이다. 반코마이신 염산염은 펩타이드의 C말단의D-Ala-D-Ala에 결합하여, 세균 세포벽의 합성을 억제하는 것으로 알려졌다. 그외 반코마이신 염산염은 세포막의 침투성과 RNA의 합성을 변화시킨다. 반코마이신 염산염은 특히 β-락탐 항생제 내성 포도상구균로 인한 심각하거나 또는 중증 감염의 초보적인 치료에 사용되고 페니실린 알레르기 또는 페니실린과 세팔로스포린을 사용하여, 효과가 없는 환자의 치료에도 사용된다. 조기 문헌에서는 반코마이신 염산염은 심각한 신장독성, 이독성(ototoxicity)이 있으므로 임상에서 광범위하게 사용되지 않으나 최근 항생제의 다량 사용으로 인해 임상에서 메티실린 내성 황색 포도구균（MRSA）의 감염 병례가 날마다 증가하고 있어 반코마이신 염산염의 사용량이 해마다 증가한다고 보고되었다. 따라서, 반코마이신 염산염의 독성을 저감시키고 약학적으로 사용되는 반코마이신 염산염의 안정성을 증가시키는 것이 매우 중요하며, 반코마이신 염산염의 순도를 향상시키는 것이 이를 위한 하나의 유효한 수단이다. 최근 과학기술의 부단한 발전으로 기술자들은 반코마이신 염산염의 순도를 향상시켰고 반코마이신 염산염에 의한 심각한 신장 독성과 이독성이 점차 감소하고 있다. 상기 원인에 기초하여, 보다 고순도이고 간편하게 실행할 수 있으며 공업화 생산에 적합한 반코마이신 염산염의 정제 프로세스를 개발하는 것은 중요한 의미를 가진다.

반코마이신 분자는 사카라이드기(saccharide group)인 α-o-반코마이신-β-o-클리코실(α-o-vancosamine-β-o-glucosyl)과 헵타펩타이드 백본(heptapeptide backbone)의 두 개의 기본 구조로 구성된다. 반코마이신의 구조는 그것의 불안정성을 결정하고, 반코마이신 분자는 산, 염기 또는 고온 조건하에서 분해산물을 생성하며 분해된다. 그동안 구조중 복수개의 자유 페놀성 수산기는 쉽게 퀴논형으로 산화된다. 반코마이신은 산성과 고온 조건에서 가수분해되어 하나 또는 두개의 글리코실기가 제거됨으로써 모노사카리드 반코마이신 또는 슈가 프리 반코마이신 （desvancosaminyl vancomycin and aglucovancomycin）을 생성하고, 약산 조건에서 두 이성질체를 갖는 아크릴아미노를 제거함으로써 아미노 반코마이신(amino vancomycin)으로 분해된다고 문헌에 보고된 바 있다. 반코마이신 화학 구조의 이러한 특점에 기초하여, 고순도반코마이신 염산염을 제조하는데 일정한 어려움을 가져왔다.

반코마이신 염산염 제품 개발은 이미 수십년의 역사가 있고 조기의 제조 프로세스는 보편적으로 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤 등 용매를 이용한 결정화 및 암모늄 클로라이드 또는 소듐 클로라이드를 넣어 염석법으로 침전하는 방식으로 완제품을 제조하였다. 하지만 반코마이신 발효액에 비교적 많은 불순물이 있고 특히, 반코마이신 구조 유사체가 비교적 많아 순도가 보편적으로 높지 않음으로써, 크로마토그래피 순도가 93% 초과하는 유럽 약전 기준에 이르러면 일정한 어려움이 있다.

최근 각종 매개체의 크로마토그래피 분리 기술의 발전에 따라 상기 기술은 반코마이신 염산염의 분리 정제 기술에서 광범위한 응용을 얻었다. CN200710187300.5은 이온 교환 필러 글루칸 겔 세파덱스(Sephadex) CM-25, 아가로스 SP 세파로스(Sepharose) 또는 아가로스 CM 세파로스로 크로마토그래피를 수행하고 유동상은 암모늄비카보네이트 4-6%로서 크로마토그래피 순도가 95% 초과，98% 미만인 반코마이신 염산염을 얻은 후 다시 소듐 클로라이드 용액으로 염석 침전하여, 분리하고 에탄올로 세척하며 오븐 건조하여, 반코마이신 염산염 완제품을 얻었다. 상기 프로세스는 순도가 비교적 높은 반코마이신 염산염을 얻을 수 있으나 회수율이 높지 않으며 그외 이온 교환 크로마토그래피는 색소를 제거하는데 이상적이지 않으므로, 상기 프로세스 제품은 외관 색상과 용액의 흡광도에서 아주 이상적이지 않다.

특허 WO2006061166의 실시예는 입경 5μm의 역상 실리카겔（Octadecyl silica gel）을 크로마토그래피 매개체로, 유동상으로 아세트산암모늄 5mM와 pH를 4.0으로 조절한 3% 메탄올을 함유한 용액, 유동상에 시약 분석제로 2% 펜타놀을 넣어 크로마토그래피 순도가 97.5% 초과하는 반코마이신 염산염을 수집한 다음, 진공 농축에 의해 액을 140mg/ml로 농축하며 메탄올을 넣고 암모늄수로 pH 8.5-9.0으로 조절하고 액상 용액의 온도를 0도로 냉각시키며 침전물을 분리하고 메탄올로 세척하며 분리물을 물로 용해하여, pH를 3.2로 조절한 다음, 이소프로판올로 결정하며 진공 오븐 건조하여, 최종적으로 순도가 97-99.3%에 달하는 반코마이신 염산염 완제품을 얻었다. 상기 특허에서 언급되는 프로세스는 몇가지 결함이 존재하고 특히 상업화 확장 생산에 일정한 어려움이 있다. 우선 상기 방법은 유동상과 용리제에서 상이한 용매를 사용하였고 용매 회수에서 일정한 어려움이 있고; 다음, 상기 프로세스는 역상정제에 의해 크로마토그래피 순도가 한단계로 99% 이상에 이를 수 없으므로 두 단계로 결정 조작을 해야 하며 최후 진공 건조에 의해 완제품을 획득하고 용매 결정은 보편적으로 잔류 용매를 효율적으로 제거 못하는 문제가 있으며 ICH가 잔류 용매에 대한 요구에 도달 못하며; 최종적으로 상기 방법은 단계가 비교적 많아 제품의 수율에서 이상적이지 못하다.

따라서, 현재의 문헌 자료에서 보면 여러가지 결함이 존재하여, 시중에는 상업화 생산에 적용하는 고순도（크로마토그래피 순도가 99% 이상에 달함을 의미）의 반코마이신 염산염의 생산방법이 없고 반코마이신 염산염의 투약용 안정성을 감안하여 고순도 반코마이신 염산염의 제조하는 방법이 필요하다.

본 발명은 고순도（크로마토그래피 순도가 99% 이상에 달함을 의미）이고, 불순물 함량이 낮으며, 고효율로 상업화 생산에 적용하기 적합한 반코마이신 염산염의 분리 정제 방법을 제공한다. 상기 분리 정제방법은（1）이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)를 통해 반코마이신 조생성물로부터 반코마이신 염산염 용액을 얻고, 나노 여과를 통해 탈염 농축하여 제 1 반코마이신 염산염 농축액을 얻는 단계；(2）염산 용액으로 제 1 반코마이신 염산염 농축액을 pH=3.5-4.5으로 조절하고, 조절된 제 1 반코마이신 염산염 농축액을 역상 크로마토그래피 컬럼(reverse chromatography column)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계, 여기서 고정상은 C18 실리카겔 또는 폴리스티렌 중합체이고, 유동상은 암모늄염을 함유하는 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액이며; （3）반코마이신 B 함량이 98.5% 초과인 크로마토그래피 용액을 수집하는 단계;（4）염산으로 상기 크로마토그래피 용액을 pH=2.5-3.5으로 조절하고, 나노 여과에 의해 용매와 염을 농축하여 제거함으로써 제 2 반코마이신 염산염 농축액을 얻도록 하는 단계; 및（5）상기 단계（4）의 제 2 반코마이신 염산염 농축액을 정제하고 탈수하여 크로마토그래피 순도가 99%에 달하는 순백의 반코마이신 염산염 분말을 얻는 단계를 포함한다.

바람직하게, 단계(1)에서 상기 반코마이신 염산염 용액은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 획득된 반코마이신 크로마토그래피 순도가 95% 초과하는 반코마이신 염산염 용액이다. 상기 제조된 반코마이신 크로마토그래피 순도가 95%보다 낮지 않은 반코마이신 염산염 용액은 하기의 종래 기술에에 의해 제조된다. (1）우선, 중국 특허 CN01132048.6의 방법에 따라 Amycolatopsis Oriertalis SIPI4349을 발효균종으로 사용하고 접종체의 배양에 의해 제 1 시드 탱크에 접종하여 제 2 시드 탱크를 거쳐 확장 배양 후, 발효 탱크 배양에 진입하며 온도 24-34℃ 배양 압력 0.01-0.08MPa로 제어하고 배양 과정에 용해와 pH를 제어하며 발효 주기는 4-6일로 반코마이신 발효액을 얻는다. （2）다음, 중국 특허 CN200710198599.4에 따라서, 반코마이신 발효액을 대공에 의해 레신을 흡착하고 에탄올을 함유하는 산성 수용액으로 반코마이신을 용리한 다음, 용리 용액에 활성탄을 넣어 탈색시키고 탈색액에 암모늄비카보네이트를 넣고 암모니아수로 pH를 7.5-8.5로 조절하고 교반 정지후 분리하여, 크로마토그래피 순도가 80%보다 낮지 않은 반코마이신 조생성물（상기 반코마이신 조생성물은 단계（1）에서의 반코마이신 조생성물을 지칭한다）얻는다. （3）정제수에 반코마이신 조생성물을 용해한 후, 0.01~0.5㎛구경의 세라믹 막으로 여과하여 정화된 반코마이신 여액을 얻는다. 정화된 반코마이신 여액은 이온 교환 크로마토그래피컬럼 크로마토그래피 정화에 의해 반코마이신 B 함량이 95% 초과하는 크로마토그래피액(즉, 반코마이신 크로마토그래피 순도가 95%보다 낮지 않은 반코마이신 염산염 용액)을 얻는다. 여기서 언급되는 이온 교환 크로마토그래피컬럼의 필러는 양이온 교환 세파덱스 글루칸 겔（Sephadex）또는 아가로스 겔을 의미한다. 컬럼의 반코마이신 여액은 산성 조건에서 크로마토그래피 컬럼에 주입되고, 염기성 금속염 또는 암모늄염, 통상적으로 NH₄ ⁺염과 Na⁺염, 예를 들면 NaCl, NH₄HCO₃,（NH₄）₂CO₃등의 조건하에 크로마토그래피 주입되고; 크로마토그래피시 수집된 반코마이신 B 함량이 93% 이상인 분획은 혼합하여, 유효 크로마토그래피액에서 반코마이신 함량이 95%이상이 되도록 한다.

상기 반코마이신 크로마토그래피 순도가 95%보다 작지 않은 유효 크로마토그래피액을 나노 여과하여 10-20% 반코마이신 염산염 농축액(즉, 농도가100mg/ml-200mg/ml）을 얻고, 바람직하게 상기 농축액은 2-8℃에서 보관한다. 나노 여과시 분자량이 100-800Da인 나노 여과막을 이용하여 수행한다. 여기서, 농축액의 온도는 ≤20℃이다.

상기 농축액을 4N 염산 용액으로 pH=3.5-4.5로 조절하고, 역상 크로마토그래피 컬럼에 통과시킨다. 바람직하게는, 상기 역상 크로마토그래피 컬럼은 C18 실리카겔 또는 역상 중합체를 필러로 하고, 실리카겔 입경 5㎛-60㎛, 폴리스티렌과 같은 중합체 입경 20㎛-40㎛인 것이 좋다. 메탄올 또는 에탄올을 유동상으로 하고, 암모늄염을 pH 조절 완충제로 넣는다. 바람직하게, 염산 또는 아세트산으로 pH=3.5-5.5으로 조절하고, 암모늄 클로라이드 또는 암모늄 아세테이트로 등용매 그라데이션 용리를 수행하는 것이 좋다. 여기서, 암모늄염을 함유하는 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액에서 상기 암모늄염의 농도는 0.1-1wt%이다. 반코마이신 B 함량이 98.5%이상인 분획을 수집하여 혼합 용출액에서 반코마이신 B 성분이 99%이상 되도록 한다.

상기 혼합 용출액을 4N 염산으로 pH=2.5-3.5로 조절한 다음, 나노 여과하여 용매와 염을 제거하여 농축한다. 분자량이 100-800Da인 나노 여과막을 이용하여 나노 여과를 수행하는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 농축시의 온도는 ≤20℃이다. 상기 나노 여과하여 얻은 용액을 다시 농축하여 반코마이신 염산염을 함유하는 15-25% 농축액을 얻고 동결 건조기 또는 분무 건조기를 이용하여 정제 탈수(여기서 정제 탈수 방법은 동결 건조, 또는 분무 건조법, 염석 결정법 또는 용매 결정법이며 상기 정제 탈수 방법은 통상적인 기존 기술에 속한다)하고 건조 시켜 얻은 반코마이신 염산염 분말의 크로마토그래피 순도는 99% 초과이다. 상기 반코마이신 염산염 분말은 10%농도 450nm파장에서 흡광도가 0.02 미만이고, 백색도가 88% 초과이다.

본 발명의 제조 방법은 기존의 특허와 비교하여 이온 교환 크로마토그래피와 역상 실리카겔 크로마토그래피 크로마토그래피에 의해 최종적인 반코마이신 염산염 순도가 99% 초과하고 제품의 색상 외관이 현저하게 향상되었으며; 본방법은 이온 교환 크로마토그래피와 역상 실리카겔 크로마토그래피의 두가지 크로마토그래피에 의해 반코마이신 염산염 순도가 99% 초과하는 목표에 도달할 수 있으며 방법이 간단하고; 본 방법은 암모늄염, 에탄올, 또는 메탄올을 역상크로마토그래피의 유동상으로 이용하고, 기존의 특허에 비해 후속적인 처리와 용매의 회수가 쉽고 나노 여과막에 의해 간단하게 농축 처리할 수 있으며 조작이 편리하므로 상기 프로세스는 제품의 품질을 향상시킬 뿐만 아니라 확장된 상업화 생산에 적합하다.

도 1은 실시예 1의 반코마이신 조생성물의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B의 함량은 90.2 %이며;
도 2는 실시예 1의 반코마이신 염산염 농축액의 크로마토그램이고 반코마이신 B의 함량은 95.3%이며;
도 3은 실시예 2의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B의 함량은 99.1%이며;
도 4는 실시예 4-6의 반코마이신 염산염 농축액의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 95.8%이며;
도 5는 실시예 4의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 99.0%이며;
도 6은 실시예 5의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 99.2%이며;
도 7은 실시예 6의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 99.0%이며;
도 8은 실시예 7-9의 반코마이신 염산염 농축액의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 95.9%이며;
도 9는 실시예 7의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 99.0%이며;
도 10은 실시예 8의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 99.2%이며;
도 11은 실시예 9의 반코마이신 염산염 완제품의 크로마토그램을 나타내고 반코마이신 B 함량은 99.3%이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만 본 발명은 상기 실시예의 범위에 한정되는 것이 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건의 실험방법을 기재하지 않은 부분은 통상적인 방법과 조건 또는 제품 설명서에 따른 방법을 선택한다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 이하 실시예와 실시예의 프로세스 파라미터 범위에 한정되는것은 아니다.

실시예 1:반코마이신 B가 95%보다 낮지 않은 반코마이신 염산염 용액 제조

도 1을 참조하면 비커에 반코마이신 조생성물 250g을 2.0L 정제수에 용해하고 충분히 교반하며 완전히 용해한 후 구경이 0.2㎛인 여과막으로 여과하고 물을 넣어 희석하여 최후 반코마이신 염산염 조생성물 3.0L를 얻는다. 농도는 43.6mg/ml이고, 크로마토그래피 순도는 90.2% 이다.

도 2를 참조하면 상기 반코마이신 염산염 조생성물 용해액 3000ml를 취하고 글루칸 Sephadex CM-25가 담겨져 있는 8cm×60cm의 유리 크로마토그래피 컬럼에 의해 크로마토그래피를 수행한다. 컬럼 체적은 크로마토그래피 컬럼 부피의 4%정도이고 흡착 방법은 컬럼 솔루션과 1/5의 크로마토그래피 필러를 혼합한 다음, 혼합액을 직접 적용하고, 다시 1.5배 컬럼 부피/시간의 유속으로 세척하고 6배의 컬럼 체적으로 세척한 다음, NH₄HCO₃ 0.3%(w/v)수용액으로 프리 세척하며, 프리 세척 유속은1배 컬럼 부피/시간이며 세척 부피는 15-20배 컬럼 부피이다. 프리 세척 종료시 용리액에서 반코마이신 B 함량은 90% 이상이고 5%w/v）NH₄HCO₃수용액으로 반코마이신을 분할 수집하고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, high performance liquid chromatography)로 검출하여, 반코마이신 B 함량이 95% 초과하는 분획을 혼합하며 4N의 염산으로 pH=3.1로 조절하여, 농도는 18.6mg/ml이고 크로마토그래피의 순도는 96.5%인 유효 용리액 5600ml를 얻었다.

다음, 상기 유효 용리액을 구경이 400분자량인 나노 여과막으로 탈염 및 농축하고 여기서, 정제수를 5차 넣어 최후 투석액의 전기전도도가 1255㎲/cm이고 다음 상기 feed liquid을 농축하여 농도가 156mg/ml이고, pH=3.8, 크로마토그래피 순도가 95.3%이며(도2 참조), 부피가 680ml인 반코마이신 염산염 농축액을 얻고 상기 농축액은 2-8℃에서 보관하여 비축한다.

실시예 2:고순도 반코마이신 염산염 완제품 제조

실시예 1에서 제조한 농축액 680 ml를 취하고 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(Preparation column)(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.2%(W/V) NH₄Cl와 8%(V/V) 메탄올을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속 5BV/h로 100 min 프리 세척하고, 다음으로 유속은 5BV/h로 하고 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하며 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하고 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.8mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 240mg/ml, 부피338ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 68.5g을 얻었다. 수율은 64.6%이고 크로마토그래피 순도는 99.1%이며（도 3 참조）10% 용액 흡광도A_450nm=0.012이다.

실시예 3:상이한 구경의 나노 여과막 농축 효과 비교

상이한 구경의 나노 여과 멤브레인 튜브를 선택하되, 구경은 각각100Da, 200Da, 400Da, 800Da이고 여과 면적은 전부 0.32m²이며 차례로 실험실의 소형 나노 여과막 설비에 안착하며（모델 LNG-NF-101）10% 반코마이신 염산염의 농축액 8000ml를 취하고 4부로 나누어 먼저 그중이 한 부를 나노 여과 농축하고 순환 펌프 압력은 10bar로 공제하며 농축을 시작할 때 투석 샘플을 채집하여, 효력 검사를 하고 투출 유속을 기록하며 매번 사용 후 기기를 세척하고 다음 나노 여과 멤브레인 튜브를 교체하며 다른 한 부의 농축액을 사용하여 시험한다. 시험 결과는 하기와 같다.

구경 검출 항목	100Da	200Da	400Da	800Da
초기유속L/H）	2.2	4	4.2	4.2
초기효력(u/ml)	5	6	5	8
종료 유속(L/H）	1.6	3.8	3.8	4.0
종료 효력(u/ml)	6	7	7	8

상기 표와 같이, 구경이 상이한 나노 여과막은 투석액 효력에 대한 영향이 크지 않으므로 농축 반코마이신 염산염에 전부 적용하기 적합하다. 그러나, 상이한 구경의 멤브레인 튜브는 유속에 대한 영향이 있으므로 구경이 200Da 초과하는 멤브레인 튜브가 유속에 보다 적합하다.

실시예 4:상이한 입경 C18 실리카겔 비교

농도 150mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.8%（도4 참조）의 농축액 680ml를 취하고, 염산 또는 수산화나트륨 용액으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 5㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 0.1% NH₄Cl(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100 min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 8병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 3.8mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 10L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도150mg/ml, 부피248ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 30.8g을 얻었다. 수율은 62.2%이고 크로마토그래피 순도는 99.0%이며（도5 참조）10% 용액 흡광도A=0.014이다.

실시예 5:상이한 입경 C18 실리카겔 비교

농도150mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.8%（도4 참조）의 농축액 330 ml를 취하고 염산 또는 수산화나트륨 용액으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.1% NH₄Cl(W/V)와 8% 메탄올（V/V）을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속 5BV/h로 100 min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하며 온라인에서 파장 λ=280을 검출하며 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하고 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 8병을 수집하며 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하고 크로마토그래피 순도가98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 3.8mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 10L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피268ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 32.5g을 얻었다. 수율은 65.6%이고 크로마토그래피 순도는 99.2%이며（도6 참조）10% 용액 흡광도A=0.015이다.

실시예 6:상이한 입경 C18 실리카겔 비교

농도 150mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.8%의 농축액 150 ml를 취하고 염산 또는 수산화나트륨 용액으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 60㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×0cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 0.1% NH₄Cl(W/V)와 8%(V/V) 메탄올을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100 min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여 총 약 8병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 3.8mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 10L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피 268ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 29.8g을 얻었다. 수율은 60.2이고 크로마토그래피 순도는 99.0%이며（도7 참조）10% 용액 흡광도A450nm=0.012이다.

실시예4, 실시예 5와 실시예 6의 비교를 통해 알수 있듯이 상이한 입경의 C18 실리카겔필러 역상크로마토그래피 효과는 크로마토그래피 순도, 제품 수율 및 흡광도에 영향이 크지 않지만 작동 압력에 있어서 입경이 작을수록 압력이 크므로 대규모 생산에는 30㎛-60㎛의 C18 실리카겔을 선택하는 것이 바람직하다.

실시예 7:유동상에서 CH ₃ COONH ₄ 와 NH ₄ Cl의 비교

농도 152mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.9%（도8 참조）의 농축액 330ml를 취하고 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 아세트산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.1% NH₄Cl(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100 min 프리 세척하고, 다음 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 8병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 3.8mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 10L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피 252ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 31.1g을 얻었다. 크로마토그래피 순도는 99.0%이며（도9 참조）10% 용액 흡광도 A=0.017이다.

실시예 5와의 비교를 통해 알수 있듯이, NH₄Cl를 함유하는 유동상의 성분과 수율과 CH₃COONH₄를 함유한 유동상의 구별은 크지 않다.

실시예 8:유동상에서 상이한 비율의 NH ₄ Cl비교

농도 152mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.9%의 농축액 330 ml를 취하고 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.5% NH₄Cl(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100 min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 9병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가3.2mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피252ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 32.1g을 얻었다. 수율은 64.0%이며 크로마토그래피 순도는 99.2%이고（도10 참조）10% 용액 흡광도 A=0.016이다.

실시예 9:유동상에서 상이한 비율의 NH ₄ Cl비교

농도 152mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.9%의 농축액 330 ml를 취하고 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.5% NH₄Cl(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음, 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 9병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가3.1mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피 252ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 32.0g을 얻었다. 수율은 63.8%이며 크로마토그래피 순도는 99.3%이고（도11 참조）10% 용액 흡광도 A=0.014이다.

실시예 5, 실시예 6과 실시예 9의 비교를 통해 알수 있듯이 상이한 함량의 NH₄Cl(W/V)과 8% 메탄올 수용액（V/V）을 유동상으로 제품 수율 크로마토그래피 성분 및 흡광도에 영향이 크지 않지만 수집하는 체적에 영향이 있을 수 있다.

실시예 10:위컬럼액과 유동상의 상이한 pH 비교

농도 146mg/ml, 크로마토그래피 순도 96.4%의 농축액 670 ml를 취하고 염산으로 pH=3.5로 조절하고 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=3.5로 조절하며 NH₄Cl(W/V)0.5%와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.3mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고, 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피380ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 63.1g을 얻었다. 수율은 64.5%이며 크로마토그래피 순도는 99. 2%이고 10% 용액 흡광도 A=0.015이다.

실시예 11: 위컬럼액과 유동상의 상이한 pH 비교

농도 146mg/ml, 크로마토그래피 순도 96.4%의 농축액 670ml를 취하고 염산으로 pH=4.5로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.5로 조절하고 0.5% NH₄Cl(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 5.1mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 15L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피380ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 58.2g을 얻었다. 수율은 64.5%이며 크로마토그래피 순도는 99.0%이고 10% 용액 흡광도 A=0.018이다.

실시예 7, 실시예 10과 실시예 11의 비교를 통해 알수 있듯이 컬럼 솔루션과 유동상 pH=3.5와 pH=4.0의 제품의 수율과 성분 영향은 크지 않고 컬럼 솔루션 pH=4.5는 수집되는 체적이 증가할 수 있고 수율과 성분은 약간의 영향이 있다.

실시예 12:유동상에서 상이한 농도의 CH ₃ COONH ₄ 비교

농도 154mg/ml, 크로마토그래피 순도 95.9%의 농축액 330ml를 취하고 염산 또는 수산화나트륨으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 아세트산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.5% CH₃COONH₄(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 8병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 4.1mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 10L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피 260ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 32.5g을 얻었다. 수율은 64.0%이며 크로마토그래피 순도는 99.1%이고 10% 용액 흡광도 A=0.013이다.

실시예 13:유동상에서 상이한 농도의 CH ₃ COONH ₄ 비교

농도 154mg/ml의 농축액 330ml 를 취하고, 염산 또는 수산화나트륨으로pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 아세트산으로 pH=4.0으로 조절하고 1% CH₃COONH₄(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속은 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여 총 약 9병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여 농도가 3.2mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 150mg/ml, 부피 265ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 33.0g을 얻었다. 수율은 65.0%이며 크로마토그래피 순도는 99.0%이고 10% 용액 흡광도 A=0.015이다.

실시예 7, 실시예 12와 실시예 13의 비교를 통해 알 수 있듯이 상이한 농도의CH₃COONH₄(W/V)과 8% 메탄올 수용액（V/V）을 유동상으로 완제품의 함량, 수율 및 흡광도에 영향이 크지 않고 고농도의 CH₃COONH₄은 수집 부피에 영향이 있다.

실시예 14: CH ₃ COONH ₄ 체계인 유동상에서 상이한 pH의 비교

농도 145mg/ml 크로마토그래피 순도 96.6%의 농축액 670ml 를 취하고, 염산 또는 수산화나트륨으로 pH=3.5으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 아세트산으로 pH=3.5로 조절하고 0.5%의 CH₃COONH₄(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.2mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피 370ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고, 동결 건조기에 넣어 동결건조하여 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 60.6g을 얻었다. 수율은 62.4%이며 크로마토그래피 순도는 99.2%이고 10% 용액 흡광도 A=0.016이다.

실시예 15: CH ₃ COONH ₄ 체계인 유동상에서 상이한 pH의 비교

농도 156mg/ml 크로마토그래피 순도 95.7%의 농축액 650ml를 취하고, 염산 또는 수산화나트륨으로 pH=4.0으로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 아세트산으로 pH=4.0으로 조절하고 0.5%의 CH₃COONH₄(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.2mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피 385ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 63.9g을 얻었다. 수율은 63.0%이며 크로마토그래피 순도는 99.0%이고 10% 용액 흡광도 A=0.014이다.

실시예 16: CH ₃ COONH ₄ 체계인 유동상에서 상이한 pH의 비교

농도 145mg/ml 크로마토그래피 순도 96.6%의 농축액 670ml 를 취하고, 수산화나트륨으로 pH=4.5로 조절하며 입경이 30㎛인 C18 실리카겔 필러가 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 아세트산으로 pH=4.5로 조절하고 0.5%의 CH₃COONH₄(W/V)와 8% 메탄올(V/V)을 함유하는 수용액을 유동상으로 유속 5BV/h로 100min 프리 세척하고, 다음으로 유속 5BV/h로 유동상중의 메탄올 비율을 12%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.5L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.2mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12.5L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피 370ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 61.0g을 얻었다. 수율은 62.8%이며 크로마토그래피 순도는 99.1%이고 10% 용액 흡광도 A=0.018이다.

실시예 14, 실시예 15와 실시예 16의 비교를 통해 알 수 있듯이 컬럼 솔루션과 유동상의 pH를 3.5-4.5로 제어하여 제품을 제조하는 수율과 질량에 영향이 크지 않다.

실시예 17:공중합체 필러 폴리스티렌(PS) 레신 역상제조 실시예

농도 148mg/ml 크로마토그래피 순도 95.9%의 농축액 680ml 를 취하고, 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 20㎛입경의 폴리스티렌이 흡착된 레신이 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하고 5%의 에탄올(V/V) 수용액을 유동상으로 유속 2BV/h로 60min 프리 세척하고, 다음으로 유속 2BV/h로 유동상중의 에탄올 비율을 10%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2.0L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.4mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피 370ml로 농축한 다음 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여, 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 60.6g을 얻었다. 수율은 60.2%이며 크로마토그래피 순도는 99.3%이고 10% 용액 흡광도 A=0.016이다.

실시예 18: 공중합체 필러 폴리스티렌 레신 역상제조 실시예

농도 148mg/ml 크로마토그래피 순도 95.9%의 농축액680ml 를 취하고, 염산으로 pH=3.5로 조절하며 20㎛입경의 폴리 스티렌이 흡착된 레신이 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=3.5로 조절하고 5%의 에탄올(V/V) 수용액을 유동상으로 유속 2BV/h로 60min 프리 세척하고, 다음으로 유속 2BV/h로 유동상중의 에탄올 비율을 10%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2L씩 수집하여, 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여, 농도가 6.2mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피370ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여， 반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 61.2g을 얻었다. 수율은 60.8%이며 크로마토그래피 순도는 99.0%이고 10% 용액 흡광도 A=0.015이다.

실시예 19: 공중합체 필러 폴리스티렌 레신 역상 제조 실시예

농도 158mg/ml 크로마토그래피 순도96.2%의 농축액 650ml를 취하고, 염산으로 pH=3.5로 조절하며 40㎛입경의 폴리스티렌이 흡착된 레신이 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=3.5로 조절하고 5%의 에탄올(V/V) 수용액을 유동상으로 유속 2BV/h로 60min 프리 세척하고, 다음으로 유속 2BV/h로 유동상중의 에탄올 비율을 10%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2L씩 수집하여， 총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여 농도가 7.1mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피400ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여，반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 64.7g을 얻었다. 수율은 63.0%이며 크로마토그래피 순도는 99.0%이고 10% 용액 흡광도 A=0.012이다.

실시예 20: 공중합체 필러 폴리스티렌 레신 역상제조 실시예

농도 158mg/ml 크로마토그래피 순도96.2%의 농축액 650ml 를 취하고, 염산으로 pH=4.0으로 조절하며 40㎛입경의 폴리 스티렌이 흡착된 레신이 담겨있는 프레퍼레이션 컬럼(15cm×30cm)에 의해 염산으로 pH=4.0으로 조절하고 5%의 에탄올(V/V) 수용액을 유동상으로 유속 2BV/h로 60min 프리 세척하고, 다음으로 유속 2BV/h로 유동상중의 에탄올 비율을 10%로 향상시켜 용리하고 온라인에서 파장 λ=280을 검출하고 흡수치가 상승하기 시작할 때 용리액의 수집을 시작하며 한병에 2L씩 수집하여，총 약 10병을 수집하고 매병의 반코마이신 B 함량 정황을 검출하며 크로마토그래피 순도가 98.5% 초과하는 것은 혼합하여，농도가 608mg/ml인 혼합 크로마토그래피액 총 12L를 얻고 4N 염산으로 pH=2.8로 조절한다.

상기 크로마토그래피액을 구경이 400분자량인 나노 여과막에 의해 탈용매하고 용출액이 용매의 발생이 없으면 농축을 시작하고 혼합액을 농도 200mg/ml, 부피 380ml로 농축한 다음, 0.45㎛ 여과막을 통해 여과하고 동결 건조기에 넣어 동결건조하여，반코마이신 염산염 동결건조 분말 완제품 63.5g을 얻었다. 수율은 61.8%이며 크로마토그래피 순도는 99.1%이고 10% 용액 흡광도 A=0.018이다.

실시예 17 내지 20은 두 가지 규격의 공중합체 역상 필러 폴리스티렌으로 크로마토그래피 제조를 수행하고 각각 상이한 pH에서 제조를 수행한 결과 제조한 완제품 성분, 흡수율 흡광도 차이는 크지 않고 효과가 비교적 우수하다.

상기 발명의 내용 및 구체적인 실시 방식은 본 발명에서 제공하는 기술 방안의 실제 응용을 나타내며 본 발명의 청구 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자는 본 발명의 정신과 원리 내에서 여러 가지 수정, 등가적 변경 또는 개진을 할 수 있다. 본 발명의 보호 범위는 첨부된 청구 범위를 기준으로 한다.

Claims (10)

1. 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법에 있어서,
   （1）이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)를 통해 반코마이신 조생성물로부터 반코마이신 염산염 용액을 얻고, 나노 여과를 통해 탈염 농축하여 제 1 반코마이신 염산염 농축액을 얻는 단계, 여기서 이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 필러는 양이온 교환 세파덱스 또는 세파로즈이고, 유동상은 물-염이며；
   (2）염산 용액으로 제 1 반코마이신 염산염 농축액을 pH 3.5-4.5로 조절하고, 조절된 제 1 반코마이신 염산염 농축액을 역상 크로마토그래피 컬럼(reverse chromatography column)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계, 여기서 고정상은 폴리스티렌 중합체이고, 유동상은 프리 세척을 위한 5%(V/V)에탄올을 함유하는 수용액이며, 유동상중의 에탄올 비율을 10%로 향상시켜 용리하고;
   （3）반코마이신 B 함량이 98.5% 초과인 크로마토그래피 용액을 수집하는 단계;
   （4）염산으로 상기 크로마토그래피 용액을 pH 2.5-3.5으로 조절하고, 나노 여과에 의해 용매와 염을 농축하여 제거함으로써 제 2 반코마이신 염산염 농축액을 얻도록 하는 단계; 및
   （5）단계(4)의 제 2 반코마이신 염산염 농축액을 정제하고 탈수하여 크로마토그래피 순도가 99%에 달하는 순백의 반코마이신 염산염 분말을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 단계(1)에서, 이온 교환 크로마토그래피를 통해 획득한 반코마이신 염산염 용액은 반코마이신 크로마토그래피 순도가 95% 초과인 반코마이신 염산염 용액인 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 단계(1)에서, 반코마이신 염산염 농축액의 농도는 100mg/ml-200mg/ml인 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 단계(2)에서, 폴리스티렌 중합체의 입경이 20-40㎛인 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 단계(2)에서, 사용되는 용매가 에탄올인 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1항에 있어서,
   상기 단계(2)에서, 유동상은 염산 또는 아세트산을 이용하여 pH 3.5-5.5로 조절되는 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
9. 제 1항에 있어서,
   상기 단계(4)에서, 분획 분자량이 100-800Da인 나노 여과막을 이용하여 나노 여과를 수행하는 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
   
10. 제 1항에 있어서,
    상기 단계(5)에서 제조된 반코마이신 염산염 분말은 10wt% 농도, 450nm 파장에서 흡광도가 0.02 미만이고, 백색도가 88% 초과이며, 크로마토그래피 순도는 99% 이상에 달하는 것을 특징으로 하는 고순도 반코마이신 염산염의 분리 정제방법.
    

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