CN116754534B - 一种快速检测金属离子锡以及碱性物质的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测金属离子锡以及碱性物质的方法和应用，它涉及检测领域，本发明以盐酸万古霉素为唯一前驱体，采用一步微波法快速合成了盐酸万古霉素碳纳米点。盐酸万古霉素碳纳米点保留了盐酸万古霉素的部分结构和抗菌性能，具有低生物毒性、良好的抗菌活性和较好的稳定性。同时，盐酸万古霉素碳纳米点可以通过荧光强度变化快速简便实现锡的检测，检出限为5.2μM。也可以检测碱性环境。抗菌盐酸万古霉素碳纳米点的多种功能在抗菌及锡，对pH响应方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种快速检测金属离子锡以及碱性物质的方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种广泛存在于自然界、人体的化脓性病原菌。金葡菌侵入机体后产生多种毒素和毒力因子，逃避机体免疫系统的防御，引起局部和全身的浸润性感染。万古霉素为窄谱抗生素，仅对革兰氏阳性菌有效，对耐药金葡菌本品尤为敏感。其作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，它主要和细菌细胞壁结合，而使某些氨基酸不能进入细胞壁的糖肽中。
碳纳米点是一种新型的纳米材料，通常呈球形，尺寸在10 nm以下。在过去十年左右的时间里，碳纳米点因其优良的特性，包括良好的荧光特性、水溶性、生物相容性和低毒性而受到越来越多的关注。基于其优良的性能，碳纳米点被广泛应用药物载体、细胞成像等多个领域。此外，一些碳纳米点对温度或pH表现出较高的敏感性，用于温度或pH传感。
金属的过度排放已经明显给人类的生产生活带来影响，因此，检测环境金属离子具有重要意义。因为碳纳米点很容易被电子受体或供体淬灭这一特性，所以它被作为荧光探针广泛用于检测金属离子。例如，2018年，Ansi等在文章Table sugar derived carbondot-a naked eye sensor for toxic Pb2+ ions将蔗糖作为碳源制备了荧光探针用于检测Pb2+，同时检测过程中发现在Pb2+存在的情况下水体产生明显的团聚现象，这也为检测Pb2 +提供了另一种方法。而类似于锡（Sn）这种重金属，只需要微量，便可对人类的健康造成伤害。国内外已经有一些方法用于对Sn的检测，但是检测方法比较繁琐。因此，建立一种新型可靠、灵敏的方法来检测环境中的Sn迫在眉睫，开发一种快速、简便、灵敏的方法来定量、定性地评估环境中存在的Sn非常重要。专利公开号CN114739948A，发明名称《一种基于时域光谱技术的弱碱性物质检测方法及系统》公开了一种基于时域光谱技术的弱碱性物质检测方法及系统，包括：制备柠檬酸锌粉纯样品以及不同浓度梯度的柠檬酸锌粉混合物；测量柠檬酸锌粉纯样品以及各柠檬酸锌粉混合物的太赫兹时域光谱并利用线性拟合算法建立柠檬酸锌含量预测模型；检测待测柠檬酸锌粉混合物在柠檬酸锌粉纯样品太赫兹特征吸收峰位置处的太赫兹特征吸收峰面积并利用柠檬酸锌含量预测模型对待测柠檬酸锌粉混合物进行检测，得到柠檬酸锌含量预测结果。本发明通过太赫兹时域光谱技术，解决了现有技术缺乏一种准确检测弱碱物质中微量柠檬酸盐含量的方法的问题，实现了弱碱物质中柠檬酸盐的高精度检测，且检测效果好。该方法是基于柠檬酸锌粉的吸收峰数值，通过计算，实现对弱碱物质中微量柠檬酸盐含量检测方法。该方法操作复杂，不适用于定量、定性地评估碱性环境，实现对环境中碱性物质的快速、简便的检测。
发明内容
本发明提供一种以盐酸万古霉素碳纳米点检测金属离子锡以及碱性物质的方法和应用，以实现快速、简便、灵敏的方法来定量、定性地评估环境中存在的Sn，以及碱性环境。
本发明的一种快速检测金属离子锡的方法，所述的检测方法是利用盐酸万古霉素碳纳米点完成的；所述的利用盐酸万古霉素碳纳米点对金属离子锡检测方法：将盐酸万古霉素碳纳米点溶液与含有金属离子锡的溶液混合，使锡溶液终浓度为6~400 μmol/L，在360nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，检出限为5.2 μM。
进一步地，所述的盐酸万古霉素碳纳米点检测金属离子锡中，盐酸万古霉素碳纳米点溶液的浓度为2~8 mg/mL。
进一步地，所述的盐酸万古霉素碳纳米点的制备方法：
将浓度为0.1~10 mg/mL盐酸万古霉素溶液在450~900 W的微波条件下加热10~30min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管中，进行两次离心，得到黄色的盐酸万古霉素碳纳米点溶液，并在4℃保存。
进一步地，所述的微波功率为720 W，所述的加热时间为20 min。
进一步地，所述的过滤膜为0.22 μm聚醚砜膜，所述的超滤管为10000 MWCO超滤管。
进一步地，所述的两次离心条件均为5000 rpm转速下5 min。
本发明制备的盐酸万古霉素碳纳米点的应用，所制备的盐酸万古霉素碳纳米点用于制备抑菌剂；或者，所制备的盐酸万古霉素碳纳米点用于制备耐盐性、抗光漂白性的碳纳米点。
本发明的一种快速检测碱性物质的方法，所述的检测方法是利用盐酸万古霉素碳纳米点完成的；所述的利用盐酸万古霉素碳纳米点对碱性物质检测方法：将浓度为2~4 mg/mL的盐酸万古霉素碳纳米点溶液pH调至为7~13，在360 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。
进一步地，所述的盐酸万古霉素碳纳米点检测碱性物质中，盐酸万古霉素碳纳米点溶液的浓度为2~8 mg/mL。
进一步地，所述的盐酸万古霉素碳纳米点的制备方法：
将浓度为0.1~10 mg/mL盐酸万古霉素溶液在450~900 W的微波条件下加热10~30min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管中，进行两次离心，得到黄色的盐酸万古霉素碳纳米点溶液，并在4℃保存。
盐酸万古霉素表面含有丰富的官能团，如羧基、羟基、羰基等，可以通过氢键分子间相互作用，余下的苯环之间具有某些共轭作用，可能通过π→π*相互作用，发生了超分子自组装，本发明通过微波诱导下，盐酸万古霉素发生自组装排列，然后堆积成纳米点。不同的碳纳米点适用于检测不同的金属离子，即碳纳米点在检测金属离子领域并不具有普适性。本发明能够检测金属Sn，可能是金属Sn与盐酸万古霉素碳纳米点络合，也可能是Sn使其碳纳米点发生聚集，导致荧光强度下降。
本发明包含以下有益效果：
本发明以盐酸万古霉素为唯一前驱体，采用一步微波辅助法快速合成了盐酸万古霉素碳纳米点。盐酸万古霉素碳纳米点保留了盐酸万古霉素的部分结构和抗菌性能，具有低生物毒性、良好的抗菌活性和较好的稳定性。同时，盐酸万古霉素碳纳米点可以通过荧光强度变化快速简便实现锡的检测，检出限为5.2 μM。也可以检测碱性环境。抗菌盐酸万古霉素碳纳米点的多种功能在抗菌及锡检测，对pH响应方面具有良好的应用前景。
本发明盐酸万古霉素碳纳米点的直径集中在0.899±0.40 nm，细胞毒性低，并表现出明显碳点的激发依赖特性。由于盐酸万古霉素碳纳米点在形成过程中保留了盐酸万古霉素的部分结构，因此它具有良好的抗菌活性和较低的生物毒性。同时，基于荧光传感特性，盐酸万古霉素碳纳米点可以快速检测金属离子锡，也可对碱性物质高度敏感。
附图说明
图1盐酸万古霉素碳纳米点的表征分析图；(a)制备的盐酸万古霉素碳纳米点的TEM图像和尺寸分布图；(b)盐酸万古霉素碳纳米点在310~390 nm不同激发波长下的荧光光谱；(c)盐酸万古霉素碳纳米点的荧光衰减曲线；(d)合成浓度为1 mg/mL合成的盐酸万古霉素碳纳米点在水溶液中的紫外-可见吸收光谱；(e)盐酸万古霉素碳纳米点的FT-IR光谱；(f)盐酸万古霉素碳纳米点的XPS光谱：高分辨盐酸万古霉素碳纳米点的高分辨XPS光谱C1s谱(g)、O1s谱(h)、N1s谱(i)、Cl2p谱(j)；
图2 盐酸万古霉素碳纳米点的紫外、可见光照片，不同合成浓度的紫外-可见吸收光谱以及荧光光谱图；(a)不同浓度(0.5、1、2、5 mg/mL)合成的盐酸万古霉素碳纳米点在可见光(左)和365 nm紫外灯下(右)的照片；(b) 盐酸万古霉素碳纳米点在不同合成浓度(0.5、2、5 mg/mL)下，在水溶液中的紫外-可见吸收光谱；(c) 盐酸万古霉素碳纳米点在浓度0.5mg/mL下，在310 ~ 390 nm的不同激发波长下的荧光光谱；(d) 盐酸万古霉素碳纳米点在浓度2mg/mL下，在310 ~ 390 nm的不同激发波长下的荧光光谱；(e) 盐酸万古霉素碳纳米点在浓度5mg/mL下，在310 ~ 390 nm的不同激发波长下的荧光光谱；
图3用不同合成浓度(0.5、1、2、5 mg/mL)的合成的盐酸万古霉素碳纳米点和盐酸万古霉素对金黄色葡萄球菌进行抑菌平板实验的照片，比例尺为1 cm；
图4盐酸万古霉素碳纳米点的抑菌以及透射电镜图；(a) 图3抑菌平板对应的抑菌区直径简图；(b)图8抑菌平板对应的抑菌区直径简图；(c)测量金黄色葡萄球菌与不同浓度盐酸万古霉素碳纳米点(5、10、15、20、40、60、80 μg/mL和100 μg/mL)共培养溶液14组溶液在0-48 h内的OD值变化图：LB培养基、金黄色葡萄球菌溶液、金黄色葡萄球菌与盐酸万古霉素共培养(10、20、60 μg/mL和100 μg/mL)溶液、金黄色葡萄球菌与不同浓度(5、10、15、20、40、60、80和100 μg/mL)盐酸万古霉素碳纳米点共培养溶液图；(d)不同时间下(0、2、4、6、8、10、12 h)用400 μg/mL盐酸万古霉素和盐酸万古霉素碳纳米点处理后的金黄色葡萄球菌的透射电镜图像，比例尺为500 nm；
图5金黄色葡萄球菌与盐酸万古霉素碳纳米点共孵育6 h的荧光成像图(左)，激发波长为488nm(右)，比例尺为200 μm；
图6 LO2、HEK293T、HCM和MC3T3-E1细胞在不同浓度的盐酸万古霉素碳纳米点(0、50、100、150和200 μg/mL)培养48 h图；
图7 MC3T3-E1细胞与盐酸万古霉素碳纳米点共孵育6、12和24 h的荧光成像图(左排)，激发波长为488 nm(右排)，比例尺为200 μm；
图8 用合成浓度1mg/mL制备的盐酸万古霉素碳纳米点稀释成不同浓度(0.1、0.5、1、3、5 mg/mL)对金黄色葡萄球菌进行抑菌平板实验的照片，比例尺为1 cm；
图9盐酸万古霉素碳纳米点稳定性实验的荧光强度比值影响图；(a)不同浓度NaCl对盐酸万古霉素碳纳米点荧光强度的影响图；(b)不同浓度KCl对盐酸万古霉素碳纳米点荧光强度的影响图；(c)盐酸万古霉素碳纳米点在360 nm激发下430 nm处的荧光随紫外照射时间变化图；
图10盐酸万古霉素碳纳米点稳定性实验的荧光光谱图；(a)不同浓度NaCl对盐酸万古霉素碳纳米点荧光光谱图；(b)不同浓度KCl对盐酸万古霉素碳纳米点荧光光谱图；(c)盐酸万古霉素碳纳米点紫外照射的荧光光谱图；
图11盐酸万古霉素碳纳米点金属离子响应情况图；(a)盐酸万古霉素碳纳米点对100 μmol/mL不同金属离子荧光响应图；(b) 盐酸万古霉素碳纳米点随Sn浓度变化曲线图；
图12盐酸万古霉素碳纳米点金属离子与pH响应情况图；(a)盐酸万古霉素碳纳米点对100 μmol/mL不同金属离子荧光光谱图；(b) 盐酸万古霉素碳纳米点随Sn浓度荧光变化情况图；(c)盐酸万古霉素碳纳米点的pH响应图；
图13盐酸万古霉素碳纳米点不同pH条件室温放置24 h后可见光和紫外光图，以及pH荧光响应图；(a)将盐酸万古霉素碳纳米点pH调至7、8、9、10、11、12、13，室温放置24 h后在可见光(上)和365 nm紫外灯下(下)的照片图；(b)盐酸万古霉素碳纳米点在360 nm激发下430 nm处的pH荧光响应图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
1）设备：使用TecnaiF20电子显微镜(FEI公司，荷兰)获得盐酸万古霉素碳纳米点的透射电子显微镜(TEM)图像。利用岛津UV-2550紫外-可见分光光度计获得了紫外-可见吸收光谱。采用日立F-2700荧光分光光度计获得荧光光谱。红外光谱由VECTOR33傅里叶变换红外光谱仪(Bruker，德国)获得。使用FLS920稳态/瞬态荧光光谱仪（爱丁堡，苏格兰）来获得荧光寿命和量子产率。X射线光电子能谱是通过ESCALAB 250X光电子能谱仪（热科学，美国）获得的。使用Bruker500型核磁共振仪（Bruker，瑞士）获得了核磁共振碳谱。
2）材料：盐酸万古霉素（98%）购自上海源叶生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自武汉博士德技术有限公司（中国）。抗荧光衰减安装片购自北京索拉比奥科技有限公司。DMEM培养基、RPMI1640培养基、青链霉素混合液（双抗）、磷酸盐缓冲盐水和特级胎牛血清购自以色列生物工业科技公司。LB培养基购自阿拉丁试剂有限公司(中国，上海）。镁国家标准溶液、铜国家标准溶液、铝国家标准溶液、锌国家标准溶液购自国家钢铁材料测试中心。钠单元素标准溶液购自国家标准物质研究中心。钾单元素标准溶液、水中锡标准溶液、购自中国计量科学研究院。钼标液、钡标液购自天津市光复精细化工研究所。镉标准溶液、铅溶液、锰溶液、镍溶液、铬单元素标准溶液购自环境保护部标准样品研究所。所有实验用水均为超纯水。
3）盐酸万古霉素碳纳米点的制备：采用一步微波辅助法合成了盐酸万古霉素碳纳米点。首先，将10 mL盐酸万古霉素溶液(0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL)转移到一个干净的100 mL烧杯中，在720 W的家用微波炉中加热20 min。反应结束后，用0.22 μm聚醚砜膜粗过滤溶液，去除较大的产物。然后将过滤后的溶液加入到超滤管(10000 MWCO)中，离心两次(5000 rpm，5 min)。最后，得到黄色的盐酸万古霉素碳纳米点溶液，并在4℃的冰箱中保存。
细菌培养将金黄色葡萄球菌(S. aureus，ATCC25923)从LB固体培养基转移到LB液体培养基中，在37℃、200 rpm下培养8 h，达到对数生长阶段。
为了在盐酸万古霉素碳纳米点的形成过程中尽可能保持盐酸万古霉素分子的抗菌结构和活性，采用0.5、1、2、5 mg/mL四种不同的反应浓度制备了碳纳米点，并对其荧光性能和抗菌活性进行了初步研究。得到的盐酸万古霉素碳纳米点均表现出较好荧光性能和抗菌效果。本发明以1 mg/mL 的盐酸万古霉素碳纳米点进行研究。1 mg/mL合成的盐酸万古霉素碳纳米点的直径集中在0.899±0.40 nm处，尺寸相对均匀(图1a)。盐酸万古霉素碳纳米点表现出明显的荧光激发依赖性特性。在最佳激发波长为~360 nm时，盐酸万古霉素碳纳米点的最佳发射波长为~430 nm。图1 b盐酸万古霉素碳纳米点在310~390 nm不同激发波长下的荧光光谱。
根据用二阶衰减指数函数进行拟合得到的盐酸万古霉素碳纳米点荧光衰减曲线(图1c)。获得了2个荧光寿命（τ），表明盐酸万古霉素碳纳米点有2个荧光中心（表1）。平均寿命为3.20 ns，头量子产率为0.69%。盐酸万古霉素碳纳米点水溶液为黄色，在365 nm的紫外光照射下，呈明亮的蓝色荧光。
图1d是盐酸万古霉素的紫外-可见吸收光。图1 e为 FT-IR光谱，图1f为X射线光电子能谱（XPS），图1g为高分辨盐酸万古霉素碳纳米点的高分辨XPS光谱C1s谱、图1h为高分辨盐酸万古霉素碳纳米点的高分辨XPS光谱O 1s谱、图1i为高分辨盐酸万古霉素碳纳米点的高分辨XPS光谱N1s谱、图1j为高分辨盐酸万古霉素碳纳米点的高分辨XPS光谱Cl2p谱。
表1
本实施例的盐酸万古霉素碳纳米点溶液均为黄色。随着反应时间的增加，溶液的颜色逐渐变深。在365nm紫外光照射下，均发出蓝色荧光(图2a)。盐酸万古霉素随着反应时间的增加，紫外吸光度增大(图2c、图2d、图2e)。当合成的反应浓度为0.5 mg/mL时，盐酸万古霉素碳纳米点的最佳激发波长为~ 360 nm，最佳发射波长为~ 430 nm；当合成的反应浓度为2 mg/mL时，盐酸万古霉素碳纳米点的最佳激发波长为~ 360 nm，最佳发射波长为~430 nm；当合成的反应浓度为5 mg/mL时，盐酸万古霉素碳纳米点的最佳激发波长为~ 360nm，最佳发射波长为~ 435 nm(图2b)。
4）透射电镜测定盐酸万古霉素碳纳米点在细菌中的分布：将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌分别与相同浓度的盐酸万古霉素碳纳米点一起孵育0、2、4、6、8、10、12 h。离心、固定、脱水、包膜、切片染色后，用TEM对金黄色葡萄球菌进行成像。盐酸万古霉素组实验同上。
细胞培养所有细胞均来自美国模式培养物研究所(ATCC,Manassas,VA,US)。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)、人心肌细胞(HCM)和人胚胎肾293T细胞(HEK293T)在DMEM培养基中培养。人正常肝细胞(LO2)在RPMI1640培养基中培养。所有细胞均在含有37°C、5%CO2的培养箱中培养。
5）抑制圈试验：首先，将直径为6毫米的滤纸放入盐酸万古霉素碳纳米点中浸泡过夜。而后在LB固体培养基上涂满金黄色葡萄球菌。最后，将每张浸泡过的滤纸置于琼脂平板的中间处。培养条件为：37°C恒温恒湿度培养箱中孵育过夜。24 h后拍照并记录抑菌圈的直径。
抑菌曲线试验将LB培养基、金黄色葡萄球菌溶液、金黄色葡萄球菌与盐酸万古霉素(10 μg/mL、20 μg/mL、60 μg/mL和100 μg/mL)共培养，并与不同浓度的盐酸万古霉素碳纳米点(5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL)共培养，在37°C水浴恒温摇床中共孵育。0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后，吸取200 μL溶液，转移到96孔无菌板中，测量体系OD值的变化。
结果：
为了检验盐酸万古霉素和不同浓度(0.5、1、2和5 mg/mL)合成的碳纳米点的抑菌效果，在相同的条件下进行抑菌平板实验(图3与图4a)。比较抗菌圈的直径，可以看出盐酸万古霉素碳纳米点抑菌效果比盐酸万古霉素好。
6）通过细胞增殖及毒性检测试剂盒检测法检测盐酸万古霉素碳纳米点的体外细胞毒性：采用CCK-8法检测盐酸万古霉素碳纳米点对细胞的毒性。以MC3T3-E1细胞为例，将MC3T3-E1细胞培养到对数生长期，适当的细胞密度为3000~5000个细胞/孔。然后，将MC3T3-E1细胞转移到96孔细胞培养板中培养。然后，将每孔180 μL的细胞悬液置于含有5%CO2的培养箱中在37°C。当细胞完全附着在细胞瓶壁上时，加入20 μL不同浓度的盐酸万古霉素碳纳米点。接下来，每孔细胞的盐酸万古霉素碳纳米点浓度分别为0、50、100、150、200 μg/mL（每个浓度有6个多孔）。盐酸万古霉素碳纳米点和MC3T3-E1细胞孵育48 h后，每孔加入20 μLCCK-8。将96孔细胞培养板置于培养箱中30 min，用酶标仪(InfiniteM200PRO,瑞士，帝肯公司)在450 nm波长下测量光密度(OD)。根据OD值计算MC3T3-E1细胞活力。
采用CCK-8法检测另外三个细胞(HCM、LO2、HEK293T)与盐酸万古霉素碳纳米点孵育后的活力，实验步骤相同。
结果：
盐酸万古霉素碳纳米点的体外生物毒性和抗菌试验。为了研究盐酸万古霉素碳纳米点在抑菌过程中的荧光性能，将盐酸万古霉素碳纳米点与金黄色葡萄球菌在室温下共孵育6h后，获得了荧光图像(图5)。与盐酸万古霉素碳纳米点共孵育的金黄色葡萄球菌，在金黄色葡萄球菌中显示出明亮的绿色荧光，显示出盐酸万古霉素碳纳米点具有一定的荧光探针的功能。低细胞毒性是盐酸万古霉素碳纳米点在生物医学方面应用的重要因素。本发明采用细胞增殖和活性检测试剂盒(CCK-8)方法检测制备的盐酸万古霉素碳纳米点对4种正常细胞(LO2、HEK293T、HCM和MC3T3-E1)的细胞毒性。与200 μg/mL盐酸万古霉素碳纳米点孵育48 h后，LO2、HEK293T、HCM和MC3T3-E1细胞未见抑制(图6)。结果表明，所制备的盐酸万古霉素碳纳米点具有较低的生物毒性。200 μg/mL盐酸万古霉素碳纳米点与MC3T3-E1细胞共孵育6、12和24 h后，获得了荧光图像(图7)。在488 nm波长的激发下，在MC3T3-E1细胞中显示出明亮的绿色荧光，随着时间的增加，MC3T3-E1细胞荧光越强，显示出盐酸万古霉素碳纳米点具有一定的荧光探针的功能。
7）细菌成像：选择金黄色葡萄球菌来评价盐酸万古霉素碳纳米点的细菌成像能力。金黄色葡萄球菌(约1×106至1×107CFU/mL)，与盐酸万古霉素碳纳米点(800 µg/mL)混合，在37°C的条件下共孵育6 h。4000 rpm离心5 min收集金黄色葡萄球菌，用PBS缓冲液洗涤3次，转移到载玻片中，加入10 μL抗荧光淬灭剂，而后用盖玻片盖住。最后用共聚焦激光扫描显微镜对其进行成像。盐酸万古霉素与金黄色葡萄球菌孵育后的成像，实验步骤相同。
细胞成像选择MC3T3-E1细胞来评价盐酸万古霉素碳纳米点的细胞成像能力。将MC3T3-E1细胞培养到对数生长期，适当的细胞密度为10-15万个细胞/孔。然后，先取细胞爬片放入6孔细胞培养板，将MC3T3-E1细胞转移到6孔细胞培养板中培养。然后，将每孔2 mL的细胞悬液置于含有5% CO2的培养箱中在37°C。当细胞完全附着在细胞瓶壁上时，培养基全部析出，加入2 mL200 µg/mL的盐酸万古霉素碳纳米点。孵育6、12、24 h，孵育结束后，吸出培养基，用PBS清洗3次，每次1-3 min。1 mL多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，用PBS再次清洗3次，每次1-3 min。用镊子夹起细胞爬片扣在滴加抗荧光淬灭剂的载玻片上，最后用共聚焦激光扫描显微镜对其进行成像。
结果：
盐酸万古霉素碳纳米点的抗菌性能是一个重要的研究目标。采用体外抑菌平板试验，探讨不同浓度(0.1、0.5、1、3、5 mg/mL)盐酸万古霉素碳纳米点的抗菌性能（图8）。随着盐酸万古霉素碳纳米点溶液浓度的增加，琼脂平板上的抑制圈的直径逐渐增大(图 4b)。在相同的条件下监测LB培养基、金黄色葡萄球菌溶液、金黄色葡萄球菌与盐酸万古霉素共培养(10、20、60 μg/mL和100 μg/mL)溶液、以及金黄色葡萄球菌与不同浓度盐酸万古霉素碳纳米点(5、10、15、20、40、60、80 μg/mL和100 μg/mL)共培养溶液14组溶液在0至48 h内的OD值变化(图4c)。LB培养基的OD值随时间变化不大。金黄色葡萄球菌悬液的OD值迅速上升到平台期。在48 h孵育期间，随着盐酸万古霉素碳纳米点浓度的增加(从5-100 μg/mL)，溶液的OD值显著降低。盐酸万古霉素碳纳米点在20 μg/mL条件下OD值随时间变化不大，而盐酸万古霉素在20 μg/mL时OD值还随时间上升。结果表明，盐酸万古霉素碳纳米点可以持续有效地抑制细菌的生长。
为研究盐酸万古霉素碳纳米点抗菌机制的变化，采用透射电镜观察相同条件下盐酸万古霉素和盐酸万古霉素碳纳米点孵育后金黄色葡萄球菌的形态变化。金黄色葡萄球菌与400 μg·mL-1孵育分别处理盐酸万古霉素和盐酸万古霉素碳纳米点0~12 h，处理0、2、4、6、8、10、12 h的细菌样品，透射电镜观察并拍照(图4d)。
8）稳定性实验：将6 mg/mL盐酸万古霉素碳纳米点与氯化钠溶液共混，使氯化钠终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0 mol/L，在360 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。氯化钾溶液与盐酸万古霉素碳纳米点共混，实验步骤相同。将3 mg/mL盐酸万古霉素碳纳米点紫外照射10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180 min，在360 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。
结果：
为研究盐酸万古霉素碳纳米点是否稳定，对不同浓度NaCl、不同浓度KCl和紫外照射测荧光强度(图9与图10)。当NaCl浓度增加到2.0 mol/L时，盐酸万古霉素碳纳米点荧光强度基本保持不变(图9a与图 10a)，当KCl浓度增加到2.0 mol/L时，盐酸万古霉素碳纳米点荧光强度基本保持不变(图9b与图 10b)，表现出盐酸万古霉素碳纳米点具有优异的耐盐性。紫外照射180 min后，盐酸万古霉素碳纳米点荧光强度变化较小(图9c与图 10c)，说明其具有良好的抗光漂白性。
9）金属离子检测：将6 mg/mL盐酸万古霉素碳纳米点分别与Cd、Cu、Al、Zn、Na、Fe2+、Mg、Cr、K、Ba、Ni、Mn、Fe3+、Pb、Sn共混，使其终浓度为100 μmol/mL，在360 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。将6 mg/mL盐酸万古霉素碳纳米点与锡溶液共混，使锡溶液终浓度分别为6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400 μmol/L，在360 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。
碱性pH检测将3 mg/mL盐酸万古霉素碳纳米点分别调制pH为7、8、9、10、11、12、13。在360 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。室温放置24 h，拍在365 nm紫外灯和可见光的照片。
结果：
为探索盐酸万古霉素碳纳米点对金属离子响应，在相同条件下测量了100 μmol/mL不同金属离子对盐酸万古霉素碳纳米点荧光的影响(图11与图12)。图11a为盐酸万古霉素碳纳米点对100 μmol/mL不同金属离子荧光响应图，100 μmol/mLSn使盐酸万古霉素碳纳米点荧光淬灭。说明盐酸万古霉素碳纳米点对Sn具有高灵敏度和高选择性。对Sn进行更细致的研究(图11b与图12b)，检测盐酸万古霉素碳纳米点对Sn的检出限为5.2 μmol/mL，高浓度Sn会使盐酸万古霉素碳纳米点荧光淬灭。
盐酸万古霉素碳纳米点对pH有较高响应。将盐酸万古霉素碳纳米点pH调至7、8、9、10、11、12、13。立即测其荧光强度（图13），可以看出随溶液越来越碱，盐酸万古霉素碳纳米点溶液的荧光越低。可能是由于羧基已处于脱质子化状态，而酚羟基逐渐经历去质子化过程，导致荧光强度随时间而降低。而将碱性pH盐酸万古霉素碳纳米点溶液室温放置24 h后，碱性越大，溶液颜色越红。故盐酸万古霉素碳纳米点可以检测碱性溶液。
Claims (7)
1.一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所述的检测方法是利用盐酸万古霉素碳纳米点完成的；所述的利用盐酸万古霉素碳纳米点对金属离子锡检测方法：将盐酸万古霉素碳纳米点溶液与含有金属离子锡的溶液混合，使含有金属离子锡的溶液终浓度为6～400μmol/L，在360nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，检出限为5.2μM。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所述的盐酸万古霉素碳纳米点检测金属离子锡中，盐酸万古霉素碳纳米点溶液的浓度为2～8mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所述的盐酸万古霉素碳纳米点的制备方法：
将浓度为0.1～10mg/mL盐酸万古霉素溶液在450～900W的微波条件下加热10～30min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管中，进行两次离心，得到黄色的盐酸万古霉素碳纳米点溶液，并在4℃保存。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所述的微波功率为720W，所述的加热时间为20min。
5.根据权利要求3所述的一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所述的过滤膜为0.22μm聚醚砜膜，所述的超滤管为10000MWCO超滤管。
6.根据权利要求3所述的一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所述的两次离心条件均为5000rpm转速下5min。
7.根据权利要求3所述的一种快速检测金属离子锡的方法，其特征在于所制备的盐酸万古霉素碳纳米点用于制备提高抑菌效果且持续抑菌、低细胞毒性的试剂；或者，所制备的盐酸万古霉素碳纳米点用于制备耐盐性、抗光漂白性的碳纳米点。
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