CN108998013B - 一种绿色荧光量子点及其制备方法和铜离子检测应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种绿色荧光量子点及其制备方法和应用，属于纳米材料技术领域。制备方法：以没食子酸为碳源，以尿素为氮源，以PEG₄₀₀为钝化剂，采用微波辅助法制得能够发绿光的绿色荧光碳量子点。本发明选择没食子酸作为碳源，是因其苯环结构上有三个羟基和一个羧基，因此以其为碳源制备的荧光量子点，荧光团具有更高的共轭结构，具有更高的发射波段。该制备方法路线设计合理，操作简单，重复性好，对设备要求低；制得的绿色荧光量子点水溶性好，稳定性高，荧光性能优异，能够专一性的用于检测铜离子。

Description

一种绿色荧光量子点及其制备方法和铜离子检测应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种绿色荧光量子点及其制备方法和应用。

背景技术

铜是人类最早发现的金属，也是人类使用最广泛的金属，其广泛的应用于农业和工业产品中，如：试剂、农药、增塑剂、乳化剂和涂料等。同时，铜在调节生物体生理活动方面也具有重要的作用。一方面，适量的铜在生物体内对正常的生理活动起着无可替代的作用。在机体内，许多参与生理活动的酶都有铜的参与，比如抗坏血酸氧化酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等，其在生物转化中与电子传递氧化还原反应密不可分。同时，许多酶的代谢也与铜紧密相关。在生物体内，铜离子对铁元素的吸收、运输起着至关重要的作用。铜元素的缺乏会抑制生物体内血红蛋白的合成，造成血红蛋白含量降低，导致功能性贫血；同时，铜离子对内分泌系统和神经系统也有一定的影响。铜元素的缺乏对神经组织中铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶等的活性有着重要的影响，临床上所表现的症状主要有威尔森病(Wilson disease)、阿尔兹海默病(Alzheimer disease)、帕金森综合征(Parkinsonism)、中枢神经系统病(Central Nervous System Disease)等；同时，铜骨骼和软骨及其结缔组织的生理活动也有着至关重要的影响，铜元素缺乏会对儿童的骨骼生长产生影响。另一方面，机体内铜元素含量过高也会产生一定的危害。

根据世界卫生组织研究显示，婴儿、儿童以及青少年每天铜的安全摄入量分别为80,40和30μg·kg-1。同时，根据中国营养学会(Chinese Nutrition Society)报告，成年人每天对铜的安全摄入量应为210～300mg；同样的，名美国国家食品营养委员会(NationalNutritional Foods Association)推荐承认每天对铜的安全摄入量应为115～310mg。我国对饮用水和食品中重金属含量也进行了明确的规定：生活饮用水中铬的最大限量为0.05mg·L^-1，铝的最大限量为0.2mg·L^-1，铜的最大限量为1mg·L^-1。粮食中铜的极限含量为10mg·kg^-1，铅的极限含量为0.2mg·kg^-1，铬的极限含量为0.2mg·kg^-1。禽畜肉类中铅的含量不得超过0.2mg·kg^-1，铬的含量不得超过0.1mg·kg^-1，铜的含量不得超过10mg·kg^-1。同时，根据联合国卫生环保组织规定，饮用水中铜离子含量不得超过10μmol·L^-1。根据相关研究显示，机体内铜含量超过极限便会产生溶血。长期过量摄入铜会引发记忆力衰退、恶心、肝功能异常和肝脏肿大等。

铜离子传统检测方法有沉淀法、显色法、荧光探针法、金属量子点法等，但这些方法都存在灵敏度低和准确度不够等问题，很难检测到生物体中微量铜离子；同时荧光探针法和金属量子点法带来的生物毒性大大限制了其在线检测和应用。因此，开发高灵敏度和生物毒性低的铜离子检测方法实现微量铜离子的检测，可望实现因铜离子蓄积引起疾病的早期诊断。

近年来，随着纳米材料的发展，碳量子点作为一种新型的荧光纳米材料越来越受到研究者们的关注。目前，主要通过有机溶剂做钝化剂填补碳量子点表面的缺陷来提高荧光碳量子点的量子产率。然而，选择有机溶剂做钝化剂后续处理较为复杂。因此，广大研究者寻求更廉价更简单的方法来提高碳量子点荧光量子产率。由于N原子和C原子的半径相近，因此，在制备碳量子点的过程对其进行掺氮处理将会得到性能优异的氮掺杂碳量子点(N-CDs)。由于碳量子点表面的氨基可以捕获铜离子形成铜氨络合物并覆盖在碳量子点表面而引起CDs荧光发生淬灭。然而，在制备碳量子点过程大多数氨基会被氧化、拆分或重组，导致所制备的碳量子点氨基数量降低以至于对铜离子检测的灵敏度降低。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种绿色荧光量子点及其制备方法和应用，该制备方法操作简单，重复性好，原料易得，对设备要求低；制得的绿色荧光量子点水溶性好，稳定性高，荧光性能优异，能够专一性的用于检测铜离子。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种绿色荧光量子点的制备方法，以没食子酸为碳源，以尿素为氮源，以PEG₄₀₀为钝化剂，采用微波辅助法制得能够发绿光的绿色荧光碳量子点。

优选地，具体包括以下步骤：

1)按没食子酸：尿素＝1:1的摩尔比，将没食子酸与尿素超声分散于添加有PEG₄₀₀的蒸馏水中，然后于300～800W下微波反应10～30min，冷却至室温；其中，尿素、蒸馏水和PEG₄₀₀的用量比为1g：1mL：(1～3)g；

2)将步骤1)制得的反应产物超声分散于其体积3～5倍的蒸馏水中，然后离心取上清液，上清液经微孔滤膜过滤、透析及冷冻干燥处理，制得能够发绿光的绿色荧光量子点。

进一步优选地，步骤2)中，离心条件为10000rpm。

进一步优选地，步骤2)中，微孔滤膜过滤是将上清液采用0.22μm注射器滤膜过滤。

进一步优选地，步骤2)中，透析是将过滤后的滤液用1000Da的透析袋透析处理24h。

本发明还公开了采用上述的方法制得的绿色荧光量子点，该绿色荧光量子点的平均粒径为23.2nm，表面电荷为+15.32mV。

本发明还公开了采用上述的绿色荧光量子点作为铜离子检测荧光探针的应用。

优选地，所述绿色荧光量子点对铜离子的检测浓度区间为0.05μmol·L^-1～600μmol·L^-1。

优选地，绿色荧光量子点能够专一性检测细胞内的铜离子。

优选地，绿色荧光量子点能够对细胞内Cu²⁺进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明以没食子酸为碳源，尿素为氮源，PEG₄₀₀为钝化剂，采用微波辅助法得到粒径为23.2nm的绿色荧光量子点Green-CDs。本发明选择没食子酸作为碳源，是因其苯环结构上有三个羟基和一个羧基，因此，以其为碳源制备的荧光量子点，荧光团具有更高的共轭结构，具有更高的发射波段。该制备方法路线设计合理，操作简单，重复性好，对设备要求低。

本发明制备的Green-CDs颗粒单分散性良好，尺寸均一，没有发生团聚现象；在Green-CDs表面分布大量的氨基、羟基和羧基，说明其具有很好的水溶性。表面Zeta电位为+15.9mV，说明所制备的Green-CDs表面氨基的数量大于羧基的数量。在对Cu²⁺检测的实验中，实验结果表明，Green-CDs对Cu²⁺的检测范围为0～600μmol·L^-1，检测极限为0.0005μmol·L^-1。在对Green-CDs专一性检测实验中。在金属杂离子及氨基酸单独存在的情况下，只有Cu^{2 +}可引起Green-CDs荧光发生淬灭，说明Green-CDs对Cu²⁺的检测具有较高的专一性。在EDTA复原性检测中，向已发生淬灭的Green-CDs中加入EDTA，Green-CDs的荧光发生复原，说明Green-CDs表面的氨基捕获溶液中的Cu²⁺是引起荧光发生淬灭的主要因素。以L-929细胞，HepG-2细胞和MCF-7细胞为模型，探究Green-CDs的细胞毒性。细胞毒性实验结果显示，在所设置的浓度范围内，Green-CDs对细胞的生长均无抑制作用，表现出良好的生物相容性。在对胞内Green-CDs的分布及对Cu²⁺的检测中，Green-CDs能够通过内吞作用进入细胞质中，且在细胞质中荧光发光行为不受到影响。当外加Cu²⁺后，细胞内荧光强度显著降低，说明所制备的Green-CDs可用于胞内Cu²⁺检测。

附图说明

图1为本发明制备的绿色荧光量子点结构表征相关结果；其中，(A)、(B)均为Green-CDs透射电镜图；(C)为粒径分布图；(D)为Zeta电位图；

图2为本发明制备的绿色荧光量子点Green-CDs的红外光谱图；

图3A为本发明制备的绿色荧光量子点Green-CDs的荧光强度随浓度变化关系图；

图3B为本发明制备的绿色荧光量子点Green-CDs在不同波长激发下发射图谱；

图4为35μg·ml^-1Green-CDs在不同浓度Cu²⁺中荧光谱图；

图5为35μg·ml^-1Green-CDs在浓度为10μmol·L^-1不同金属离子(A)和氨基酸(B)溶液中的荧光强度；

图6为35μg·mL^-1的Green-CDs在不同pH溶液中检测Cu²⁺荧光强度图(A)；Green-CDs荧光复原图(B)；

图7为Green-CDs在不同浓度NaCl溶液(A)及缓冲液(B)中的荧光强度；

图8为不同浓度的Green-CDs对HepG-2,MCF-7和L-929细胞毒性的影响；

图9为HepG-2细胞经100μg·mL^-1的Green-CDs孵育4h后对不同浓度铜离子响应的激光共聚焦图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1绿色荧光碳量子点的制备

按没食子酸与尿素为1：1的摩尔比，准确称量尿素1g，没食子酸2.839g并将其转移至容量为5mL的锥形瓶中。向锥形瓶内各加入1mL的蒸馏水和1～3g的聚乙二醇(PEG₄₀₀)并将其超声分散均匀。将其分散后置于微波炉中700W下反应10min。反应完成后待其冷却至室温向锥形瓶中加入适量蒸馏水并超声使其分散。将上述分散好后的样品于高速离心机中10000rpm离心并取上清液。用水相0.22μm注射器过滤塞将所得上清液过滤得到棕色的液体。将过滤后的液体转移至分子截留量为1000Da的透析袋中透析24h后并冷冻干燥，得到发绿光的绿色荧光碳量子点(Green-CDs)，并将干燥的Green-CDs置于干燥器中保存。

实施例2绿色荧光碳量子点的表征

1、平均粒径和Zeta电位表征

采用ZEN3600型马尔文动态光散射粒度仪测定Green-CDs平均粒径和Zeta电位，测试温度为25℃。

2、TEM微观形貌与结构表征

取少量Green-CDs于5mL离心管内，向离心管内加入2mL无水乙醇并超声5min，将样品均匀滴在400目铜网上，采用Tecnai G2F20场发射透射电镜在80KV加速电压下观测样品形貌。

结构参见图1所示，图1中(A)(B)为Green-CDs高分辨透射电子显微镜图，从图中可以看出所制备的Green-CDs呈球形，并且分散性好。通过高分辨透射电镜图及粒径分布图(C)可以看出所制备的Green-CDs平均粒径为23.2nm。(D)为Green-CDs的表面Zeta电位图，可以看出其电位为+15.32mV。由于Green-CDs通过柠檬酸和尿素制备，Green-CDs上富含羧基、氨基和羟基。此时其表面电荷电位为+15.32mV说明所制备的Green-CDs表面氨基的数量大于羧基。

3、FT-IR表征

取Green-CDs冻干样品，溴化钾压片。采用Tensor 27型红外光谱仪测定红外吸收图谱，扫描范围为500～4000cm^-1。测试结果如图2所示，可以看出，3410cm^-1处和2876cm^-1处分别为-OH的伸缩振动峰和弯曲振动峰，其来源于PEG₄₀₀。1714cm^-1处和1446cm^-1处分别为羧基上C-O伸缩振动峰和-OH的弯曲振动峰，其来源于没食子酸苯环上的羧基。939cm^-1处为苯环上C-H弯曲振动峰。1608cm^-1处和1087cm^-1处分别为Green-CDs表面氨基的N-H弯曲振动峰和C-N的弯曲振动峰，其氨基来源于尿素分子氨基碳化转变而来。

实施例3绿色荧光量子点检测铜离子

1、Green-CDs检测Cu²⁺线性关系研究

准确称取上述制备的Green-CDs并将其溶于PBS(pH＝7.4)缓冲液中得到浓度为100μg·mL^-1的Green-CDs母液；采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲溶液为溶剂依次配制浓度为1mmol·L^-1，1μmol·L^-1的Cu²⁺母液。

以上述所配液体为母液，PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂分别配制浓度为0,0.01,0.05,0.25,0.5,0.75,10,50,100,250,400,600μmol·L^-1的Cu²⁺待检测液。向上述待测中加入所配制的Green-CDs母液，使待测液中Green-CDs的浓度为10μg·mL^-1。将所配好的溶液用荧光分光光度于365nm下测定其荧光光谱。

使用荧光分光光度计对Green-CDs样品进行测试的荧光光谱测试，结果如图3A所示，从图中可以看出所制备的Green-CDs发射峰的位置为500nm，对应的发射光为绿色。并且随着Green-CDs浓度的不断增加其对应的荧光强度不断增强。当Green-CDs的浓度为0～20μg·mL^-1时，其荧光强度增加速率没有明显的变化。当浓度大于20μg·mL^-1时，荧光强度增加速率变缓。由于Green-CDs的检测浓度对检测结果有很大的影响。当Green-CDs的浓度较低时，在仪器信噪比的影响下会对检测结果带来一定的误差。然而，当Green-CDs浓度过高时，其荧光强度不会受到溶液中微量的Cu²⁺影响。因此，当溶液中Green-CDs浓度过高时，其对Cu²⁺检测具有较高的检测极限，未能实现对Cu²⁺的痕量检测。根据反复实验确定，Green-CDs检测浓度为35μg·mL^-1。

如图3B所示，不同激发波长下的荧光光谱，激发波长范围为320～420nm。Green-CDs的发射波长不会随着激发波长的增加而改变。而发射波的强度会随着激发波长的增加呈现出先增强后减弱的趋势。由于量子尺寸引起的尺寸效应与由表面官能团引起的表面态相一致，从而导致Green-CDs的荧光强度不依赖与激发波长而发生变化，这能避免自体荧光现象的发生。

2、Green-CDs铜离子检测表征

由于所制备的Green-CDs表面含有大量的氨基，能够捕获溶液中自由的Cu²⁺并在Green-CDs表面形成一层络合物，在内率效应下导致自身荧光发生淬灭。图4为不同浓度的铜离子与Green-CDs荧光强度关系图，从图中可以看出在激发和发射的通道宽度均为5nm时，Green-CDs荧光强度为585.93。当向溶液中加入Cu²⁺后，Green-CDs荧光强度随之下降。当铜离子浓度为600μmol·L^-1时Green-CDs荧光强度降低至125.46。将不同浓度Cu²⁺下与Green-CDs荧光强度通过拟合得出荧光强度(F₀/F-1)与浓度(LogC_Cu ²⁺)的方程：

通过拟合方程可以看出所设置的Cu²⁺浓度与对应的荧光强度具有指数关系，其检测区间为0～600μmol·L^-1，检测极限为0.0005μmol·L^-1。

3、Green-CDs专一性检测

1)金属离子干扰实验

采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂配制浓度为1mmol·L^-1的杂离子母液(M⁺:Co²⁺,Mn²⁺,Ag⁺,Cs²⁺,Zn²⁺,Hg²⁺,Na⁺,Fe²⁺,K⁺,Mg²⁺,Ba²⁺,Ni²⁺,Ca²⁺,Fe³⁺)。将所配得的杂离子母液进行稀释配得浓度为10μmol·L^-1的M⁺待测液。向上述待测液中加入3.2.2所配置的Green-CDs母液，使待测液中Green-CDs的浓度为10μg·mL^-1。将所配好的溶液用荧光分光光度于365nm下测定其荧光光谱。

2)氨基酸干扰实验

采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂配制浓度为1mmol·L^-1的氨基酸母液(L-Pro,L-ALa,L-Lys,L-Met,L-Ser,L-GLy,L-GLu,L-Leu,L-Hyp,L-His,L-Cys)。将所配得的氨基酸母液进行稀释配得浓度为10μmol·L^-1的氨基酸待检测液。向上述待测液中加入3.2.2所配置的Green-CDs母液，使待测液中Green-CDs的浓度为10μg·mL^-1。将所配好的溶液用荧光分光光度于365nm下测定其荧光光谱。

3)稳定性实验

采用逐级稀释法以蒸馏水为溶剂分别配置Green-CDs浓度为10μg·mL^-1且NaCl的浓度分别为0.1,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2mol·L^-1，并将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测Green-CDs的荧光强度。

采用逐级稀释法以蒸馏水为溶剂分别配置浓度为1μmol·L^-1的PBS(pH＝7.4)、Tris-HCl、Tris-HAc、Tris-NaAc、CA-SC、Tris-EDTA和HePes-Tris缓冲液，并以此缓冲液为母液，分别配置Green-CDs浓度为10μg·mL^-1且各缓冲液浓度分别为100nmol·L^-1的含Green-CDs的缓冲液，并将所配好的溶液于荧光分光光度计中于365nm下检测Green-CDs的荧光强度。

为了进一步测定通过不同碳源和氮源所制备的氨基化碳量子点仅能够被Cu²⁺特异性淬灭。通过Green-CDs在不同金属离子及氨基酸溶液中荧光强度进行探究。如图5中(A)为不同金属离子溶液中Green-CDs的荧光强度分布图，由图可以看出，在不含任何金属离子时Green-CDs荧光强度585.93。当向其中加入金属离子时所对应的荧光强度分别发生淬灭，但是唯独在含有Cu²⁺溶液中Green-CDs荧光淬灭程度最大，其荧光强度为原始荧光强度的1/4。因此，采用不同原料所制备的氨基化碳量子点Green-CDs依旧只对Cu²⁺敏感。如图5中(B)所示为在不同氨基酸溶液中的荧光强度。从图中可以看出，在氨基酸溶液中Green-CDs的荧光强度均没有改变。说明所制备的Green-CDs不会被金属杂离子与氨基酸淬灭，都具有较强的检测专一性。

图6为所制备的Green-CDs在不同溶液中对其荧光强度的影响。如图6中(A)为不同浓度NaCl溶液中Green-CDs的荧光强度，由图可知，NaCl浓度为0时其荧光强度为587.489。随着NaCl浓度的增加，Green-CDs的荧光强度略有下降，当NaCl的浓度增加至2mol·L^-1时，对应的荧光强度降低至505.156。在NaCl的浓度范围0～2mol·L^-1区间内，相同浓度Green-CDs的荧光强度极差为98.39。说明NaCl对Green-CDs的荧光强度没有影响，在NaCl溶液中具有较稳定的光学性质。图6中(B)为Green-CDs在不同缓冲溶液中的荧光强度。由图可知，Green-CDs在PBS、Tris-HCl、Tris-HAc、Tris-NaAC、CA-SC、Tris-EDTA和HePes-Tris七种缓冲液中Green-CDs荧光强度没有较大的波动。说明所制备的Green-CDs的荧光强度不受缓冲液种类的影响。可在不同种缓冲液中实现对铜离子的检测。

4、Green-CDs重现性检测

采用逐级稀释法以PBS(pH＝7.4)缓冲液为溶剂配制浓度为1mmol·L^-1的乙二胺四乙酸(EDTA)母液。依次加入200μL浓度为1mmol·L^-1的Cu²⁺母液、200μL EDTA母液、50μL3.2.2中所配得Green-CDs母液及50μL超纯水。将所配好的溶液用荧光分光光度于365nm下测定其荧光发射光谱。

为了验证Green-CDs荧光淬灭是由其捕获铜离子造成的，采用EDTA进行了验证。如图6中(B)所示，在Green-CDs不加铜离子时其荧光强度为587.489。当加入600μmol·L^-1铜离子时Green-CDs的荧光降低至125.46。当向溶液中再加入一定浓度的EDTA溶液后Green-CDs的荧光增强至409.462。由于EDTA是一种金属络合剂，可以吸收溶液中的Cu²⁺。在不含EDTA时，铜离子以铜氨络合物的形式被吸附在Green-CDs表面，当加入EDTA后，由于EDTA强效的吸附力可以将吸附在Green-CDs表面被氨基捕获的Cu²⁺去除，从而破坏了Green-CDs表面铜氨络合物使Green-CDs的荧光发生复原。说明所制备的Green-CDs通过表面的氨基吸附溶液中的Cu²⁺使自身荧光发生淬灭，同时EDTA使Green-CDs荧光复原说明了所制备的Green-CDs可以重复检测溶液中的Cu²⁺。

5、细胞实验

1)细胞毒性实验

选用L-929成纤维细胞为正常细胞模型，人肝癌细胞HepG-2和乳腺癌细胞MCF-7为肿瘤细胞模型进行细胞毒性研究。将5000个细胞种入96孔板中，每孔加入100μL培养基于37℃下培养箱培养24h。分别配制浓度为0,2,4,8,10,20,40,60,80,100μg·mL-1的Green-CDs培养基溶液，且每个浓度设计5个复孔。所有孔板均设置空白孔，即孔内只含培养基。用含有药物的溶液更换96孔板中原有培养基，培养24h。随后用浓度为5mg·mL-1的MTT溶液更换96孔板中的溶液培养4h，移除原培养基，吸取100μL DMSO注入各孔溶解甲瓒，采用酶标仪于490nm处测定吸光度。

细胞存活率＝(A_treated/A_control)×100％；

其中，A_control是不含药物载体孔的吸光度，A_treated是含有药物载体孔的吸光度。

结果参见图8，为Green-CDs对HepG-2，MCF-7和L-929细胞的细胞毒性图。从三个细胞的细胞毒性图中可以看出，在所测试的2～100μg·mL^-1浓度范围内，三者细胞存活率均保持在95％以上，说明在Green-CDs检测浓度范围内对三株细胞无毒性作用，具有较好的生物相容性。

2)细胞成像实验

选用L929成纤维细胞为正常细胞模型，选用人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2为肿瘤细胞模型进行细胞摄取行为及Green-CDs对细胞内Cu2+检测的研究。首先配制含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗(青霉素/链霉素)的培养基。将4×10⁵个细胞分散于8mL培养基中并分别加入4个激光共聚焦皿中，于培养箱37℃下培养24h。在倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞状态良好时向4个激光共聚焦皿内分别加入2mL Green-CDs浓度为10μg·mL^-1的培养基溶液，培养4h后弃掉材料液，用PBS溶液洗涤2-3次后，向其中三个激光共聚焦皿内加入含有不同浓度铜离子的培养基溶液。浸泡5min后将含有铜离子的培养基弃掉，并用PBS溶液洗涤2-3次后，将细胞浸泡于PBS溶液中于激光共聚焦观察细胞内荧光情况。

参见图9，为HepG-2细胞经100μg·mL^-1的Green-CDs孵育4h后对不同浓度铜离子响应的激光共聚焦图，从图中可以看出Green-CDs对HepG-2细胞的形貌没有影响，具有非常好的生物相容性。当加入不同浓度的铜离子后，Cu²⁺自由扩散进入细胞内并被胞内Green-CDs捕获致使胞内荧光淬灭。由于细胞膜内外荧光探针存在渗透压，且Green-CDs荧光探针的生物毒性低，只有细胞对它摄取量足够，才能够准确实现对细胞内对Cu²⁺的灵敏检测的荧光成像。

综上所述，本发明采用没食子酸为碳源，尿素为氮源，PEG₄₀₀为钝化剂；采用微波辅助法制得Green-CDs，Green-CDs可实现对Cu²⁺的高灵敏检测，其主要优势如下：

(1)所制备的Green-CDs的平均粒径分别为23.2nm，表面电荷分别为+15.32mV。

(2)通过红外表征，Green-CDs出现羟基、氨基和羧基的特征峰，说明Green-CDs具有较好的水溶性。

(3)PL图谱显示，Cu²⁺可使Green-CDs荧光发生淬灭，对Cu²⁺的检测区间为0～600μmol·L^-1，检测极限为0.0005μmol·L^-1。

(4)通过EDTA验证实验，说明促使Green-CDs荧光发生淬灭的主要原因为其表面的氨基捕获溶液中的Cu²⁺并形成铜氨络合物导致的。

(5)通过专一性实验，其结果显示，所制备的Green-CDs可专一性的检测Cu²⁺。

(6)细胞毒性实验说明所制备的Green-CDs具有较好的生物相容性；通过激光共聚焦图像可知，Green-CDs可通过胞吞作用进入到HepG-2细胞。在外加Cu²⁺时，胞内荧光发生淬灭，且淬灭时间为40s。说明所制备的Green-CDs可实现对细胞内Cu²⁺的检测。

Claims (4)

1.一种绿色荧光量子点作为铜离子检测荧光探针的应用，其特征在于，以没食子酸为碳源，以尿素为氮源，以PEG₄₀₀为钝化剂，采用微波辅助法制得能够发绿光的绿色荧光碳量子点，包括以下步骤：

1）按没食子酸：尿素=1:1的摩尔比，将没食子酸与尿素超声分散于添加有PEG₄₀₀的蒸馏水中，然后于300~800 W下微波反应10~30min，冷却至室温；其中，尿素、蒸馏水和PEG₄₀₀的用量比为1g：1mL：（1~3）g；

2）将步骤1）制得的反应产物超声分散于其体积3~5倍的蒸馏水中，然后离心取上清液，上清液经微孔滤膜过滤、透析及冷冻干燥处理，制得能够发绿光的绿色荧光量子点；

离心条件为10000 rpm；微孔滤膜过滤是将上清液采用0.22μm注射器滤膜过滤；透析是将过滤后的滤液用1000 Da的透析袋透析处理24 h；

所述绿色荧光量子点的平均粒径为23.2 nm。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述绿色荧光量子点的表面电荷为+15.32mV。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述绿色荧光量子点对铜离子的检测浓度区间为0.05μmol·L^-1~600 μmol·L^-1。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述绿色荧光量子点能够专一性检测细胞内的铜离子。

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