CN110623937B - 茶多酚基多功能纳米复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茶多酚基多功能纳米复合物及其制备方法与应用，在醛基化合物存在下，茶多酚与氨基化合物/巯基化合物快速发生组装反应，形成茶多酚基多功能纳米复合物，由于反应温度低、时间短，极大降低了对茶多酚、氨基化合物/巯基化合物等功能分子的活性影响，能够最大发挥茶多酚所具有的自由基清除能力，且引入的氨基化合物或巯基化合物可以使所得纳米复合物的荧光性、还原响应性及靶向性，从而使得到的纳米复合物表现出多种优异性能。

Description

茶多酚基多功能纳米复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米功能生物材料技术领域，涉及一种以茶多酚为基础原料的多功能纳米复合物制备方法及该多功能纳米复合物的应用。
背景技术
氧化损伤是人体健康的最大威胁之一，而氧自由基是引起氧化损伤的主要原因。氧自由基不但会加快衰老，还与许多衰老有关的疾病相关联，比如动脉硬化症、高血压、骨关节炎、白内障以及帕金森氏病等。抗氧化剂有助于提高机体的抗氧化能力，对各种氧化损伤相关疾病的预防和治疗有着非常重要的作用。纳米抗氧化材料作为一种抗氧化剂，不仅可以捕获氧自由基或者降低氧自由基产生速率，相对于游离的抗氧化分子，还可以避免被机体快速代谢清除，因此可以在体内实现长循环，具有长效的抗氧化效果；此外，纳米抗氧化材料还可以通过修饰从而靶向到特定的组织。
绿茶是世界范围内一种非常受欢迎的饮料，长期饮用绿茶具有多种有益效应，如抗氧化、抗癌、抗心血管疾病、抑制炎症和肥胖等。绿茶的健康有益效应主要来源于茶叶中含有的茶多酚类物质。茶多酚在茶叶中的含量超过茶叶干重的30％，是茶叶中多酚类物质的总称，其主要包括表儿茶素(Epicatechin,EC),没食子酸盐(Gallate,G),儿茶素(Catechin,C)，表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG),表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG),表没食子儿茶素(Epigallocatechin,EGC)和没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin gallate,GCG)等。利用茶多酚单体制备纳米抗氧化材料，不仅可以提高茶多酚在体内的生物利用度还可以赋予纳米抗氧化材料抗氧化性、抗肿瘤活性等生物有益效应。因此，以茶多酚原料制备纳米抗氧化材料具有极大的应用前景。
目前，已有一些以茶多酚为原料制备纳米粒子的报道：(1)专利申请CN201710727170.3公开了一种抗氧化聚茶多酚纳米材料的制备方法和应用，将茶碱和茶多酚在75～85℃反应24～36h，反应结束后静置24～72h，再经离心分离得到茶多酚纳米粒子；(2)专利申请CN201210375599.8公开了一种包封多酚类活性物质的纳米粒子及其制备方法，先利用蛋白和多糖发生maillard反应制备蛋白-多糖共价化合物，然后使蛋白-多糖共价化合物和多酚相互作用，戊二醛或京尼平扥交联剂分子交联得到负载茶多酚的纳米粒子，茶多酚负载量最低为12％，最高不超过31％；(3)专利申请CN201711186770.X公开了一种基于透明质酸装载茶多酚的自组装纳米复合物、制备方法和应用，通过聚乙二醇(PEG)和透明质酸(HA)在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联体系下形成PEG-HA，然后再与茶多酚自组装得到包载茶多酚的纳米粒子，茶多酚包载量为5～10％。上述有关茶多酚为原料制备纳米粒子的方法，均需要经过多步、长时间的合成过程，且有些制备方法不是以茶多酚为原料直接制备纳米粒子，而是将茶多酚装载到合成的有机载体上，这样不仅难以保证茶多酚的含有率，也会在后期分离处理过程中造成原料的极大浪费。
因此，目前以茶多酚为原料的多功能纳米粒子制备工艺仍处于摸索研究中，如何方便、快捷、高产率的制备茶多酚基多功能纳米粒子仍是生物材料技术领域的研究难点。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有技术的不足，提供一种茶多酚基多功能纳米复合物及其制备方法，获得含茶多酚的纳米复合物，在不破坏茶多酚抗氧化性的同时，简化工艺流程、提高产率。本发明另一目的旨在提供所得茶多酚基多功能纳米复合物的应用。
本发明将含有游离氨基或游离巯基的功能分子(具有荧光性能、还原响应性能或靶向性能等)结合到茶多酚分子上构建具有多种功能的茶多酚基纳米复合物。本发明提供的茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，是将茶多酚、氨基化合物或巯基化合物在醛基化合物存在下快速发生组装反应形成茶多酚基多功能纳米复合物，因此该反应不会影响茶多酚的抗氧化性。这里的溶剂为水或水与乙醇的混合液，其中乙醇的体积浓度不大于20％，其用量为将茶多酚、氨基化合物或巯基化合物和醛基化合物溶解完全。上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法具体步骤为：将茶多酚、氨基化合物或巯基化合物、醛基化合物按照重量比10:(0.1～10):(0.1～5)溶于溶剂中形成反应体系，然后将所述反应体系于0～100℃搅拌至呈乳光或乳白色即完成反应，再将所得反应液固液分离，并将分离出的固态产物洗涤、干燥即得到茶多酚基多功能纳米复合物。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述茶多酚、氨基化合物或巯基化合物、醛基化合物重量比优选为10:(1～10):(1～5)，在该比例条件下，所制备的茶多酚基多功能纳米复合物具有较高的产率。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述反应体系在室温下即可反应，而且通过提升反应体系的反应温度可以加快反应。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述茶多酚为表儿茶素、没食子酸盐、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯中的至少一种。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述氨基化合物可以是自身带有游离氨基的化合物也可以是通过修饰后带有游离氨基的化合物，由于氨基化合物在自然界、合成化合物以及现有药物中占据了非常重要的位置，数量巨大，因此该制备方法及其产物具有非常广泛的应用范围。本发明中采用的氨基化合物主要为氨基酸、氨基封端聚乙二醇、叶酸、RGD肽或胺类化合物。所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、多聚赖氨酸和多聚精氨酸中的至少一种；所述氨基封端聚乙二醇为HO-PEG-NH2或NH2-PEG-NH2；所述胺类化合物为半胱胺、胱胺二盐酸盐、尿素、乙二胺、己二胺、二亚乙基三胺、四亚乙基五胺、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺封端的聚乙二醇(PEI-PEG)、氨基乙醛缩二甲醇、氨基乙醛缩二乙醇、聚醚酰亚胺封端的二氢卟吩(PEG-PEI-Ce6)、N-BOC-乙二胺、多巴胺或炔丙胺。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述巯基化合物可以是自身带有游离巯基的化合物也可以是通过修饰后带有游离巯基的化合物。本发明中采用的巯基化合物为半胱胺、半胱胺二盐酸盐或二硫苏糖醇。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述醛基化合物可以为甲醛、乙醛或戊二醛，也可以为在上述制备过程中由其它聚合物分解产生的醛，如可以为多聚甲醛或六亚甲基四胺分解产生的含有醛基的化合物。
上述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，所述溶剂为水或水与乙醇的混合液，所述混合液中乙醇的体积浓度不大于20％。所采用的水只要能够满足实际生产需求即可，例如去离子水、蒸馏水等。
通过上述方法制备得到的茶多酚基多功能纳米复合物，一方面茶多酚的抗氧化性基本没有受到影响，具有优异的自由基清除能力，另一方面引入的氨基化合物或巯基化合物可以为具有荧光性、还原响应性或靶向性的功能性分子，从而使得到的纳米复合物表现出优异的荧光性、还原响应性或靶向性等多种性能。此外，通过调整原料配比、反应时间等，可实现对所制备得到的多功能纳米复合物形状、大小、结构等的调控，有助于设计具有多种功能的个性化材料，所制备得到的纳米复合物的粒径范围可达30nm～700nm，从而扩展了该纳米复合物的应用范围。
上述茶多酚基多功能纳米复合物在制备抗癌药物和药物载体中的应用。基于茶多酚基多功能纳米复合物优异的抗氧化性能、荧光性、还原响应性或靶向性，且绿色无毒，可以用于制备抗癌药物和药物载体，还可以用于制备食品添加剂或化妆品、防晒剂等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，在醛基化合物存在下，茶多酚与氨基化合物/巯基化合物快速发生组装反应，形成茶多酚基多功能纳米复合物，由于反应温度低、时间短，极大降低了对茶多酚、氨基化合物/巯基化合物等功能分子的活性影响，能够最大发挥茶多酚所具有的自由基清除能力，且引入的氨基化合物或巯基化合物可以使所得纳米复合物的荧光性、还原响应性及靶向性，从而使得到的纳米复合物表现出多种优异性能。
2、本发明所述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，通过一步合成反应完成纳米复合物的制备，不仅操作简单，避免使用其它耗能设备，而且产率可达到78～93％，适于大规模工业化生产。
3、本发明所述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，没有使用有机溶剂等，避免了对环境产生污染及后期处理所带来的流程繁琐、周期长、成本高等问题。
4、本发明所述制备方法得到的茶多酚基多功能纳米复合物，在确保茶多酚抗氧性不受影响的同时，表现出优异的荧光性、还原响应性或靶向性等多种性能，还可以作为抗癌药物和药物载体，具有极大的工业应用前景。
5、本发明所述制备方法得到的茶多酚基多功能纳米复合物，粒径均一，分散性好，可长时间稳定存在，且其可调控粒径范围从几十纳米到几百纳米，从而扩展了该纳米复合物的应用范围。
附图说明
图1为实施例1制备的甘氨酸-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图2为实施例3制备的半胱氨酸-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图3为实施例4制备的赖氨酸-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图4为实施例10制备的NH2-PEG-茶多酚纳米复合物的透射电镜图。
图5为实施例13制备的(PEG-PEI-Ce6)-茶多酚纳米复合物的透射电镜图。
图6为实施例16制备的胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物在不同GSH环境下的还原响应产物的扫描电镜图，其中A为胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物在模拟正常血液中GSH环境下的还原响应产物的扫描电镜图，A1为胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物在模拟正常血液中GSH环境下的还原响应产物的透射电镜图，B为胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物在模拟肿瘤细胞中GSH环境下的还原响应产物的扫描电镜图，B1为胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物在模拟肿瘤细胞中GSH环境下的还原响应产物的透射电镜图。
图7为实施例20制备的尿素-茶多酚纳米复合物进行共聚焦检测效果图，其中a为尿素-茶多酚纳米复合物在405nm紫外激光下的激光共聚焦图，b为尿素-茶多酚纳米复合物在明场中的图像，c为a和b的叠加效果图，d为尿素-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图
图8为实施例23制备的RGD肽-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图9为实施例24制备的乙二胺-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图10为实施例25制备的己二胺-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图11为实施例26制备的二亚乙基三胺-茶多酚纳米复合物的扫描电镜图。
图12为实施例1制备的氨基酸-茶多酚纳米复合物抗氧化测试分析结果，其中a为不同浓度的纯EGCG水溶液和甘氨酸-茶多酚纳米复合物悬浮液自由基清除效果对照图(Gly-NPs代表甘氨酸-茶多酚纳米复合物)，b不同浓度的纯EGCG水溶液和甘氨酸-茶多酚纳米复合物悬浮液自由基清除率。
图13为实施例23制备的的RGD肽-茶多酚纳米复合物与EGCG对肿瘤细胞抑制效果对照图。
具体实施方式
以下通过实施例并结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
以下实施例中所制备得到的茶多酚基多功能纳米复合物中茶多酚含量通过Folin-cilcalteu比色法检测得到：配制一系列浓度的茶多酚水溶液，取1mL不同浓度的茶多酚水溶液和4mL质量浓度为10％的Folin-cilcalteu酚试剂(购自索莱宝)充分混合3～8分钟，然后向所得混合液中加入5mL质量浓度为7.5％的碳酸钠溶液，之后于避光条件下反应1h，反应结束后用紫外分光光度计(UV-vis)在765nm处对所得反应液进行吸光度测试，测定吸光值；测定得到的吸光值随茶多酚浓度的变化曲线记为茶多酚吸光度标准曲线。将所得茶多酚基多功能纳米复合物均匀分散于去离子水中得到纳米粒悬浮液，取1mL纳米粒悬浮液和4mL质量浓度为10％的Folin-cilcalteu酚试剂实际充分混合3～8分钟，然后向所得混合液中加入5mL质量浓度为7.5％的碳酸钠溶液，之后于避光条件下反应1h，反应结束后用UV-vis在765nm处对所得反应液进行吸光度测试，测定吸光值；利用测定得到的吸光值与茶多酚吸光度标准曲线比对，便可得出纳米粒悬浮液中茶多酚含量，进而计算得到茶多酚在茶多酚基多功能纳米复合物中的含量。
以下实施例中所述冻干操作过程为：先将所得固态产物在-40℃预冻10小时，然后在-40℃～-20℃内每8小时升高5℃进行梯度冷冻干燥，冷冻干燥32小时即得干粉样的纳米粒。
实施例1-实施例8氨基酸-茶多酚纳米复合物
以下实施例1-实施例8制备氨基酸-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份茶多酚、1～5重量份氨基酸和1重量份甲醛溶于去离子水中形成反应体系，然后将反应体系于25℃搅拌至反应体系呈乳白色即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到氨基酸-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表1所示。
表1：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000061
注：EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)购自太阳绿宝。EC(儿茶素)购自成都普瑞法。ECG(表儿茶素没食子酸酯)购自成都普瑞法。GCG(没食子儿茶素没食子酸酯)购自成都普瑞法。茶多酚购自成都普瑞法。氨基酸(包括甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸等)购自百灵威。甲醛购自科隆。
上述氨基酸还可以为精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸或组氨酸等。氨基酸是一种安全无毒、可生物降解而且可提供适于生物生长的营养成分，因此通过上述方法制备得到的茶多酚基多功能纳米复合物适于生物体体内应用，例如作为食品添加剂添加到食用油中，防止食用油氧化。
实施例1、实施例3、实施例4所制备得到的氨基酸-茶多酚纳米复合物形貌如图1至图3所示，从图中可以看出，采用本实施例提供的上述方法可以制备出大小均一，球形度较好的氨基酸-茶多酚纳米复合物，其粒径约为200～700nm。
实施例1-实施例8所制备得到的氨基酸-茶多酚纳米复合物中茶多酚含量为78-93％，表明所制备的纳米复合物中具有超高的茶多酚含量。
将纯的EGCG利用去离子水配置成不同浓度的水溶液，同时将实施例1制备的甘氨酸-茶多酚纳米复合物利用去离子水配置成不同浓度的悬浮液，然后通过DPPH检测不同浓度的纯EGCG水溶液和-茶多酚纳米复合物悬浮液自由基清除能力(自由基清除效果如图12a所示)，并对其自由基清除率进行测量，每次同时对三个平行样测量取平均值，得到不同浓度的EGCG水溶液和甘氨酸-茶多酚纳米复合物悬浮液的自由基清除率，如图12b所示。从图12中可以看出，甘氨酸-茶多酚纳米复合物与纯EGCG对照组相比其自由基清除能力变化不大，说明甘氨酸-茶多酚纳米复合物与纯EGCG的抗氧化作用是一样的，本实施例的氨基酸-茶多酚纳米复合物制备方法不会改变茶多酚的抗氧化能力。
实施例9-实施例11 NH2-PEG-OH-茶多酚纳米复合物
以下实施例9-实施例10制备NH2-PEG-OH-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份EGCG、1～10重量份HO-PEG-NH2(氨基封端聚乙二醇)和0.1～2重量份甲醛溶于去离子水中形成反应体系，然后将反应体系于25℃搅拌至反应体系呈乳白色即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到NH2-PEG-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表2所示。
表2：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000071
注：HO-PEG-NH2(氨基封端聚乙二醇)购自百灵威。
实施例10所制备得到的NH2-PEG-茶多酚纳米复合物形貌如图4所示，从图中可以看出由HO-PEG-NH2与茶多酚合成的纳米复合物粒径约为40～50nm，且大小均一。
经测试，实施例9-实施例11所制备得到的NH2-PEG-茶多酚纳米复合物中茶多酚含量为超过40％。
实施例12-实施例14(PEG-PEI-Ce6)-茶多酚纳米复合物
以下实施例12-实施例14采用的PEG-PEI-Ce6的制备如下：
(1)合成PEG-PEI，将HO-PEG-COOH(羧基化聚乙二醇)和PEI(聚醚酰亚胺)按照摩尔比1:1溶解于去离子水中得到第一混合液，之后向所得第一混合液中加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)反应5min得到第二混合液，再向第二混合液中加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)下反应24h，继后对所得反应液透析48h，透析所得溶液经冻干即得到PEG-PEI；EDC的用量为与原料中的羧基等摩尔量；NHS的用量为与原料中的羧基等摩尔量；
(2)合成PEG-PEI-Ce6，将PEG-PEI和Ce6(二氢卟吩)按照摩尔比1:1溶解于DMSO(二甲基亚砜)中得到第三混合液，之后向所得第三混合液中加入EDC反应5min得到第四混合液，再向第四混合液中加入NHS反应24h，继后对所得反应液透析48h，透析所得溶液经冻干即得到PEG-PEI-Ce6；EDC的用量为与步骤(1)原料中的羧基等摩尔量；NHS的用量为与步骤(1)原料中的羧基等摩尔量。
以下实施例12-实施例14制备(PEG-PEI-Ce6)-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份EGCG、1～10重量份PEG-PEI-Ce6和1重量份甲醛溶于由去离子水和乙醇组成的复合溶剂(其中乙醇的体积浓度为20％)中形成反应体系，然后将反应体系于100℃搅拌至反应体系呈乳光即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到(PEG-PEI-Ce6)-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表3所示。
表3：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000081
注：PEG-COOH、PEI和Ce6购自美国的Sigma。
实施例13所制备得到的(PEG-PEI-Ce6)-茶多酚纳米复合物形貌如图5所示，从图中可以看出由PEG-PEI-Ce6与茶多酚合成的纳米复合物粒径约为30～50nm，且大小均一。
实施例15-实施例17胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物
以下实施例15-实施例17制备胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份EGCG、0.1～5重量份胱胺二盐酸盐和1重量份甲醛溶于去离子水中形成反应体系，然后将反应体系于30℃搅拌至反应体系呈乳白色即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表4所示。
表4：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000082
注：胱胺二盐酸盐购自百灵威。
实施例18-实施例20尿素-茶多酚纳米复合物
以下实施例18-实施例20制备尿素-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份EGCG、0.1～5重量份尿素和1重量份戊二醛溶于由去离子水和乙醇组成的复合溶剂(其中乙醇的体积浓度为10％)中形成反应体系，然后将反应体系于45℃搅拌至反应体系呈乳白色即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到尿素-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表5所示。
表5：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000091
注：尿素和戊二醛均购自科隆。
将实施例20制备的尿素-茶多酚纳米复合物在405nm紫色激光下进行共聚焦检测，得到的共聚焦图谱如图7所示。从图中可以看出，尿素-茶多酚纳米复合物在405nm紫色激光下发出蓝色荧光信号，表明茶多酚在接枝尿素后得到的尿素-茶多酚纳米复合物具有优异的荧光性能，可能用于茶多酚在体内的代谢标记。
实施例21-实施例23 RGD肽-茶多酚纳米复合物
以下实施例21-实施例23制备RGD肽-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份EGCG、0.1～5重量份RGD肽和0.1～5重量份甲醛溶于去离子水中形成反应体系，然后将反应体系于35℃搅拌至反应体系呈乳光即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到RGD肽-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表6所示。
表6：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000092
注：RGD肽购自大连美仑生物。
实施例23所制备得到的RGD肽-茶多酚纳米复合物形貌如图8所示，从图中可以看到大量可见纳米粒子，即为RGD肽-茶多酚纳米复合物。
实施例24-实施例26胺类化合物-茶多酚纳米复合物
以下实施例24-实施例26制备胺类化合物-茶多酚纳米复合物的方法如下：将10重量份EGCG、0.1～5重量份胺类化合物和1重量份甲醛溶于去离子水中形成反应体系，然后将反应体系于0℃搅拌至反应体系呈乳光即完成反应，再将所得反应液经离心进行固液分离，并将分离出的固态产物经去离子水洗涤、冻干即得到胺类化合物-茶多酚纳米复合物。上述制备过程中所采用的原料配比、工艺参数及所得产物代表性参数如表7所示。
表7：原料配比(重量份)及工艺参数
Figure BDA0002098341310000101
注：乙二胺、己二胺和二亚乙基三胺均购自美国的Sigma。
实施例24-实施例26所制备得到的胺类化合物-茶多酚纳米复合物形貌如图9至图11所示。从图中可以看出，本实施例提供上述方法可以制备出的胺类化合物-茶多酚纳米复合物大小均一，球形度较好，粒径约为150～300nm。
应用例1
由于胱胺盐酸盐含有二硫键，二硫键在还原条件(如存在谷胱甘肽时)下易被破坏，而且二硫键的破坏具有浓度依赖性，在GSH高浓度条件下二硫键可以快速的被破坏，在GSH浓度极低时，二硫键将不能被破坏或者破坏速度很慢。
本应用例中，以含有10μmol/L GSH的磷酸盐缓冲液模拟正常血液内GSH环境(正常血液中GSH浓度约为10μmol/L)，以含有10mmol/L GSH的磷酸盐缓冲液模拟肿瘤细胞内GSH环境(肿瘤细胞中GSH浓度约为10mmol/L)，向1mL模拟正常血液内GSH环境和1mL模拟肿瘤细胞内GSH环境中分别加入浓度为100μg/mL的胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物悬浮液(由实施例16制备的胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物加入到去离子中分散均匀得到)，之后于37℃条件下共孵育24h，然后对胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物在不同GSH环境下的还原响应产物进行测试，测试结果如图6所示。从图中可以看出，模拟正常血液内GSH环境中的纳米复合物形态没有发生变化，而在模拟肿瘤细胞内GSH环境中的纳米复合物结构完全被破坏，难以看到结构完整的纳米复合物。这是由于模拟肿瘤细胞内GSH环境中GSH与含有二硫键的胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物快速发生氧化还原反应，使大量二硫键被破坏。由此看出，本实施例制备的含有二硫键的胱胺二盐酸盐-茶多酚纳米复合物具有很好的还原响应性，将其作为肿瘤药物载体，可较好的实现药物靶向释放。
应用例2
RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合，能有效地促进细胞对生物材料的粘附。
本应用例将纯EGCG溶于水中配成一系列浓度的EGCG溶液，并将实施例23制备的RGD肽-茶多酚纳米复合物均匀分散于水中配成一系列浓度的RGD-茶多酚纳米复合物悬浮液，RGD-茶多酚纳米复合物悬浮液与EGCG溶液中EGCG的浓度相同。然后分别将不同浓度的EGCG溶液和RGD-茶多酚纳米复合物悬浮液加入到HT-29肿瘤细胞中，在细胞培养箱中共孵育24h，通过MTT法检测肿瘤细胞存活率，检测结果如图13所示。从图中可以看出，相比于单纯的EGCG，RGD肽-茶多酚纳米复合物具有更好的抗肿瘤效果，这是由于含RGD靶向肽的茶多酚基多功能纳米复合物可以增加材料与细胞的结合能力，进而增强茶多酚的抗肿瘤效果。

Claims (6)

1.一种茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，其特征在于将茶多酚、氨基化合物、醛基化合物按照重量比10:(1~10):(1~5)溶于溶剂中形成反应体系，然后将所述反应体系于0~100℃搅拌至呈乳光或乳白色即完成反应，再将所得反应液固液分离，并将分离出的固态产物洗涤、干燥即得到茶多酚基多功能纳米复合物；
所述氨基化合物为甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、胱胺二盐酸盐、尿素、乙二胺、己二胺、二亚乙基三胺、氨基封端聚乙二醇、PEG-PEI-Ce6或RGD肽。
2.根据权利要求1所述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，其特征在于所述醛基化合物为甲醛、乙醛或戊二醛。
3.根据权利要求1所述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，其特征在于所述醛基化合物为多聚甲醛或六亚甲基四胺分解产生的含有醛基的化合物。
4.根据权利要求1所述茶多酚基多功能纳米复合物的制备方法，其特征在于所述溶剂为水或水与乙醇的混合液，所述混合液中乙醇的体积浓度不大于20%。
5.权利要求1至4 中任一权利要求所述方法制备得到的茶多酚基多功能纳米复合物。
6.权利要求5 所述茶多酚基多功能纳米复合物在制备抗癌药物和药物载体中的应用。
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