CN113577274B - 一种基于纳米银和光动力学疗法的抗菌材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于纳米银和光动力学疗法的抗菌材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米银和光动力学疗法的抗菌材料及其制备方法和应用，属于生物纳米抑菌材料领域。所述抗菌材料包括聚乙烯亚胺PEI、Ce6和银纳米粒子AgNPs；Ce6与聚乙烯亚胺PEI分子链上的氨基以共价键连接，银纳米粒子AgNPs包载在连接有Ce6的聚乙烯亚胺中。该材料将AgNPs的杀菌活性和Ce6光动力途径杀菌相结合，能有效改善AgNPs的聚集并提高材料的杀菌活性。该新型AgNPs‑PEI‑Ce6纳米抗菌材料能有效杀灭浮游菌以及清除成熟生物被膜。

Description

一种基于纳米银和光动力学疗法的抗菌材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物纳米抑菌制剂领域，具体涉及一种AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料，以及该材料的制备方法，和该材料的应用。
背景技术
细菌感染一直是人类所面临的一大健康威胁，在抗生素出现之前，细菌感染表现出超强的致死率。在过去几十年里，抗生素的使用大大降低了细菌感染的发病率和致死率。但是，目前由抗生素滥用导致的耐药细菌感染已构成了新世纪抗感染治疗的新挑战，是当今人类健康的重要威胁(Science2008, 321, 356)。在自然环境下，细菌通常是以游离态(planktonic)和生物被膜(Bacterial Biofilm, BF)两种不同的形态生存。BF是细菌常见的存在方式，80 %以上的细菌以BF的形式存在。体内感染相关的BF一旦形成则很难被彻底清除，尤其导管和植入物感染都会吸引大量细菌紧密附着形成BF，导致感染迁延不愈，是慢性感染和感染周期性发作的重要原因。同时，BF也是细菌耐药性产生的重要机制之一，因此寻找传统抗生素以外的新疗法具有重要意义(Science1999, 284, 5418)。
银不同于其他金属，具有独特的抗菌性能。传统的银抗菌剂包括金属银、硝酸银、磺胺嘧啶银等，近年来，随着纳米技术的推陈出新，人们发现银纳米材料不但具有金属纳米材料的共性，又保留一定的抗菌性能，是目前研究最广泛的纳米抗菌剂，其作为抗菌剂具有安全、广谱、长效、无耐药性、抑菌效果明显等优点(Biomaterials2011, 32, 693)。但银离子的不稳定性以及加工成本高的特点也限制了其进一步的广泛应用。因此，开发一种稳定易制备低成本的银纳米粒子(AgNPs)用于杀菌具有良好的科学意义和实际应用前景。
光动力学疗法(Photodynamic Therapy, PDT)是使用一定波长的光将基态光敏剂(Photosensitizer, PS)激活，发生光化学反应，从而在局部产生高浓度的具有细胞毒性的活性氧(ROS)，ROS不但具有细胞毒性，而且还具有杀菌作用。细菌可以通过PDT被特异性地消灭，因此PDT也可以作为抗生素替代疗法治疗耐药菌造成的感染(Biomaterials2017,113, 145)。目前还没有菌株对其产生耐药的报道，因此光动力学疗法被认为是杀灭细菌并清除BF的有效方法之一。光敏剂Ce6是目前常用的一种光敏剂，但其水溶性不佳，且单一的光动力疗法杀菌效果不足以清除生物被膜。
综合以上研究背景，本发明将具有良好杀菌效果的AgNPs和光动力疗法相结合，制备AgNPs-PEI-Ce6(银纳米粒子-聚乙烯亚胺-二氢卟吩e6)纳米抗菌材料用于浮游菌和细菌被膜的杀灭和清除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于纳米银和光动力学疗法的抗菌材料，该材料制备方法简单、生物相容性好，对浮游菌和生物被膜的良好杀灭和清除效果。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于纳米银和光动力学疗法的抗菌材料，包括聚乙烯亚胺PEI、Ce6和银纳米粒子AgNPs；Ce6与聚乙烯亚胺PEI分子链上的氨基以共价键连接，银纳米粒子AgNPs包载在连接有Ce6的聚乙烯亚胺中；
所述聚乙烯亚胺的分子量为10000 ~ 1000000。
上述抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将Ce6用缩合剂、碱和N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中与PEI分子链上的氨基以共价键的形式连接，形成PEI-Ce6；
步骤2，将银源和配体加入去离子水中，随后加入还原剂制备AgNPs；
步骤3，通过包载方式将AgNPs载入PEI-Ce6，即可得到所述抗菌材料。
进一步地，所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种。
进一步地，所述碱为三乙胺、N, N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯或4-二甲氨基吡啶中的至少一种。
进一步地，所述有机溶剂为N, N-二甲酰亚胺、二甲亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、丙酮中的一种。
进一步地，步骤1中，Ce6、N-羟基琥珀酰亚胺、缩合剂、碱与PEI的摩尔质量比为1:(1 ~ 3) : (1 ~ 3) : (1 ~ 3) : (0.001 ~ 1)；反应温度为0 ~ 40 ℃，反应时间为2 ~24 h。
进一步地，所述银源为硝酸银和/或银氨。
进一步地，所述配体为3-巯基-1-丙磺酸盐、柠檬酸钠、牛血清白蛋白、油胺、巯基丙烷、谷胱甘肽中的一种。
进一步地，所述还原剂为硼氢化钠、氢化铝锂、氯化亚锡、氢气、钯碳中的一种。
进一步地，步骤2中，反应温度为0 ~ 30 ℃，反应时间为0.5 ~ 24 h。
进一步地，步骤3中，所述包载采用涡旋、超声、搅拌中的一种，包载时间为0.5 ~12 h。
上述抗菌材料在制备抗菌制品中的应用。
本发明的抗菌材料中，含有的PEI-Ce6和AgNPs相互连结，且PEI-Ce6均匀的包裹在纳米银的表面，AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的尺寸为20 ~ 100 nm。更优选的，所述AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的尺寸为30 ~ 50 nm。
本发明的纳米抗菌材料具有优越的杀灭浮游菌和清除生物被膜能力，其中细菌包括革兰阳性菌和革兰阴性菌，以及由上述两种菌形成的生物被膜。
现有技术相比，本发明的优势在于：带正电荷的PEI能有效提高纳米材料与细菌和生物被膜的结合能力；AgNPs在光照下可以更有效地激发光敏剂，提高光动力学疗法的效率；光动力学疗法中产生的活性氧又可以在生物被膜的酸性环境下氧化纳米银，促进银离子的释放。因此该材料可以在不使用抗生素的情况下高效率地清除浮游菌和生物被膜。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明抗菌材料的制备流程图。
图2为本发明实施例1中的(a) AgNPs及(b)AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的透射电镜图；
图3为本发明实施例1中Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料在有光照和无光照条件下产生ROS能力的评价图。
图4为本发明试验例1中AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的对(a)浮游金黄色葡萄球菌(b)浮游大肠杆菌的杀灭效果图。
图5为本发明试验例2中AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对(a)金黄色葡萄球菌(b)大肠杆菌成熟生物被膜的清除效果图。
图6为本发明试验例3中AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对皮肤感染生物被膜的小鼠的治疗效果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。
下列实施例中所说的室温是：25-28 ℃；所用原料及试剂均为市售品。
实施例1
一种新型纳米抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：
取2 mg Ce6溶于167 μL二甲亚砜中，随后溶于5 mL乙醇。向乙醇中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10 μM)、N-羟基琥珀酰亚胺(10 μM)和三乙胺(10 μM)室温搅拌。反应2 h后，向Ce6乙醇溶液中加入PEI，搅拌过夜。用透析袋除去未连接上PEI的Ce6，避光保存于4 ℃冰箱。
氮气保护下，将硝酸银溶液(5 mmol)加入50 mL的三颈烧瓶中，3-巯基-1-丙磺酸盐(0.5940 mg)溶于2 mL去离子水，超声10 s以上使之分散均匀，加入到硝酸银溶液中磁力搅拌10 min；硼氢化钠(0.1033 g)溶于6 mL去离子水，滴加到硝酸银溶液中。剧烈搅拌3 h后溶液呈黑色悬浊液即合成了。用5000 rpm离心20 min分离收集产物，并用去离子水洗涤3次。最终将产物溶于10 mL去离子水中，形成稳定的棕黑色AgNPs溶液，4 ℃冰箱保存。
向AgNPs溶液中逐滴滴加PEI-Ce6溶液，使用涡旋搅拌器轻微搅拌均匀，得到褐色澄清溶液即为AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料，制备过程如图1所示。
采用动态光散射仪和透射电镜对本实施例中制备的新型AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料进行表征。银纳米离子和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料透射电镜图如图2所示，由图2a可知，银纳米离子的尺寸为2 ~ 10 nm，由图2b可知，AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的尺寸为30 ~ 50 nm。PEI-Ce6可以均匀的包覆在纳米银离子表面，表明PEI-Ce6与银纳米离子可以较好的复合。
对本实施例中制备的新型AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的ROS生成能力评价。评价方法根据先前相关报道。将200 μM 1 ,3-二苯基异丙基苯(DPBF)溶液分别与0.04 μM的Ce6溶液和0.04 μM的AgNPs-PEI-Ce6溶液等体积混合，在波长650 nm 的光照或无光照条件下，利用酶标仪测量混合溶液在411 nm处的吸光度，连续测量10 min，即可比较Ce6和AgNPs-PEI-Ce6在不同条件下的ROS的释放速率，如图3所示，无光照时，DPBF的紫外吸收值几乎没有变化，说明此状态下Ce6和AgNPs-PEI-Ce6都不会产生ROS；当给予光照时，DPBF的吸收值逐渐下降，且AgNPs-PEI-Ce6可以使DPBF的吸收值下降更快，这意味着与单独使用光敏剂相比，AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料可以有效激发光敏剂更快产生大量ROS。
实施例2
一种新型纳米抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：
取2 mg Ce6溶于167 μL二甲亚砜中，随后溶于5 mL乙醇。向乙醇中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10 μM)和N-羟基琥珀酰亚胺(10 μM) 和N, N-二异丙基乙胺(10 μM)室温搅拌。反应2 h后，向Ce6乙醇溶液中加入PEI，搅拌过夜。用透析袋除去未连接上PEI的Ce6，避光保存于4 ℃冰箱。
氮气保护下，将硝酸银溶液(5 mmol)加入50 mL的三颈烧瓶中，柠檬酸钠(0.004g)溶于2 mL去离子水，超声使之分散均匀，加入到硝酸银溶液中磁力搅拌10 min；硼氢化钠(0.1033 g)溶于6 mL去离子水，滴加到硝酸银溶液中。剧烈搅拌3 h后溶液呈黑色悬浊液即合成了AgNPs。用5000 rpm离心20 min分离收集产物，并用去离子水洗涤3次。最终将产物溶于10 mL去离子水中，形成稳定的棕黑色AgNPs溶液，4 ℃冰箱保存。
向AgNPs溶液中逐滴滴加PEI-Ce6溶液，使用涡旋搅拌器轻微搅拌均匀，得到褐色澄清溶液即为AgNPs-PEI-Ce6。
试验例1
选择金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)为模型，对AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对浮游菌杀灭效果进行评价。在96孔板中每孔加入10 μL标准菌液，90 μL培养基及100 μL不同材料溶液，对照组只加入培养基。光照后37 ℃共孵育2h。2 h后吸取不同稀释倍数的上清液(浮游菌液)均匀涂布在LB琼脂平板上，37 ℃培养24 h后进行菌落计数。以上每组平行三次重复。图4是AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料的对(a)金黄色葡萄球菌(b)大肠杆菌浮游菌的杀灭效果图。如图所示，AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌浮游菌有良好的杀灭效果。
试验例2
选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为模型，对AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对成熟生物被膜的清除效果进行评价。培养成熟生物被膜后，丢弃菌液，以生理盐水清洗孔壁2~3次去除浮游菌，每孔各加入100 μL培养基和不同材料，对照组只加入培养基，37 ℃共孵育24 h，使材料可以渗透进入BF。光照后去除多余材料和死菌。吸取不同稀释倍数的BF悬浮液均匀涂布在LB琼脂平板上，37 ℃培养24 h后进行菌落计数。以上每组平行三次重复。图5是AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对(a)金黄色葡萄球菌(b)大肠杆菌成熟生物被膜的清除效果图。如图所示，AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌所形成的生物被膜均有良好的清除效果。
试验例3
采用金黄色葡萄球菌引起的外伤感染模型考察AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对细菌感染伤口的治疗效果。建立小鼠背部皮肤感染模型，伤口需要累及肌层。移液枪精密移取150 μL中富集的高浓度革兰阳性/革兰阴性菌菌液接种于皮肤伤口，待菌液吸收，连续给菌2天，同时设立空白对照组。给予材料后每天记录伤口恢复情况。图6是AgNPs、PEI-Ce6和AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料对皮肤感染生物被膜的小鼠的治疗效果图。如图所示，与其他组别相比AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料治疗组在给药后12天能有效清除感染细菌，伤口完全愈合，说明新型纳米抗菌材料有良好的抗菌促进伤口愈合效果。
综合以上实验结果，该新型AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料生物相容性良好，体外实验证明该材料杀灭和清除浮游菌和生物被膜效果显著，活体实验表明该材料能有效清除细菌促进伤口恢复，在杀菌和治疗生物被膜感染领域具有良好的应用前景。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均包括在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种抗菌材料，其特征在于：采用以下步骤制备得到：
取2 mg Ce6溶于167 μL二甲亚砜中，随后溶于5 mL乙醇，向乙醇中加入10μM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、10μM N-羟基琥珀酰亚胺和10μM三乙胺室温搅拌，反应2 h后，向Ce6乙醇溶液中加入PEI，搅拌过夜，用透析袋除去未连接上PEI的Ce6，避光保存于4 ℃冰箱；
氮气保护下，将5 mmol硝酸银溶液加入50 mL的三颈烧瓶中，0.5940 mg 3-巯基-1-丙磺酸盐溶于2 mL去离子水，超声10 s以上使之分散均匀，加入到硝酸银溶液中磁力搅拌10min；0.1033 g硼氢化钠溶于6 mL去离子水，滴加到硝酸银溶液中，剧烈搅拌3 h后溶液呈黑色悬浊液即合成了，用5000 rpm离心20 min分离收集产物，并用去离子水洗涤3次，最终将产物溶于10 mL去离子水中，形成稳定的棕黑色AgNPs溶液，4 ℃冰箱保存；
向AgNPs溶液中逐滴滴加PEI-Ce6溶液，使用涡旋搅拌器轻微搅拌均匀，得到褐色澄清溶液即为AgNPs-PEI-Ce6纳米抗菌材料。
2.权利要求1所述的抗菌材料在制备杀灭浮游菌和清除生物被膜药物中的应用。
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