CN111012910A - 一种纳米银结合光敏剂聚合物胶束及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米银结合光敏剂的聚合物胶束的制备方法及应用。它是以嵌段共聚物聚天冬氨酸‑b‑聚己内酯形成聚合物胶束为纳米载体，在胶束的聚天冬氨酸外层原位还原形成纳米银；其中，聚天冬氨酸‑b‑聚己内酯胶束PM：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：(0.1‑0.5)：(0.01‑0.1)。本发明的聚合物胶束可明显提高对细菌的杀灭效率。其制备工艺简单，纳米银的使用以及光动力治疗均不会使细菌产生耐药性。与单独负载纳米银或光敏剂的聚合物胶束相比，能通过发挥纳米银和光动力治疗的协同抗菌作用，展现出更强的抗菌活性，具有良好的应用前景。

Description

一种纳米银结合光敏剂聚合物胶束及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种内部包载疏水光敏剂原卟啉且外层原位负载纳米银的聚合物胶束的制备方法及其在协同治疗细菌感染中的应用。
背景技术
近年来抗生素的滥用导致多药耐药细菌数量的增长速度已远远超过新抗生素的发现速度。因此，探索能替代抗生素的抗菌剂或抗菌治疗策略已成为人们研究的热点。由于光动力疗法是利用光敏剂和光源将组织氧转化为具有毒性的活性氧物质（Reactiveoxygen species, ROS）去破环细胞膜和造成DNA损伤，具有创伤小、选择性高、毒副作用低、不会诱导细菌产生耐药性等优点，因此近年来光动力疗法在抗菌和抗感染方面的研究日益增多。光敏剂在光动力治疗中的作用是至关重要的。目前人们已经发现的可以转化和吸收光能的化合物大多具有稳定性差、转化效率低、毒副作用大等缺点，所以它们无法作为光敏剂应用于光动力治疗中。原卟啉（Protoporphyrin IX, PpIX）作为血红蛋白、叶绿体和细胞色素C的重要组成成分，具有良好的生物相容性，而且是一种应用广泛的光敏剂。然而，PpIX水溶性差及在生理环境下易聚集，导致其ROS产生效率和生物利用度低，限制了它作为光敏剂在临床方面的应用。
大量研究表明，利用载体材料如二氧化硅颗粒、转铁蛋白包覆的上转换纳米颗粒、石墨烯氧化物量子点、聚合物胶束等可有效负载疏水性PpIX并明显改善PpIX在生理环境中的溶解度和稳定性问题。其中，聚合物胶束凭借稳定、低毒、缓释等特点在PpIX递送方面具有很大优势。而且，聚合物胶束可同时负载多种药物，为实现联合治疗提供了机会。
纳米银作为一种广谱纳米抗菌剂可以破坏细胞壁结构，改变细菌渗透性并诱导细菌释放具有杀伤作用的ROS。与此同时，进入细菌内部的纳米银会与其遗传物质结合，阻止细菌自身的转录和翻译过程。但是，纳米银在生理环境中很不稳定，容易聚集，致使抗菌效率大大下降。而聚合物胶束作为一种优异的纳米药物载体可有效防止纳米银的聚集。因此，利用聚合物胶束将纳米银和光敏剂原卟啉良好地结合于一体，实现光动力治疗与纳米银协同抗菌，是一种具有发展潜力的联合抗菌方法。
发明内容
本发明旨在发明一种纳米银结合光敏剂的聚合物胶束，用于实现光动力治疗与纳米银的协同抗菌，从而增强细菌感染的治疗效果。本发明的协同抗菌体系将具备以下一些优势：1）能解决纳米银聚集沉淀的问题，提高纳米银在生理环境下的稳定性；2）纳米银的使用以及光动力治疗均不会使细菌产生耐药性；3）利用光动力治疗中产生的活性氧物质与具有广谱抗菌性能的纳米银实现协同抗菌，提高对细菌的杀灭作用。例如以生物发光的金黄色葡萄球菌为目标细菌通过96孔板生物发光实验测定四种聚合物胶束对细菌的杀灭作用。实验结果显示空白胶束在有、无光照条件下均不具备抗菌能力；单独负载纳米银的聚合物胶束对细菌的杀灭能力与光照无关；在光照条件下，浓度为200μg/mL的单独负载原卟啉的聚合物胶束展现出优异的杀菌能力，而在相同光照条件下，浓度仅为150μg/mL的纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束即可达到相同效果，展现出优异的协同抗菌效果）。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：
一种纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag，其特征在于它是以嵌段共聚物聚天冬氨酸-b-聚己内酯形成聚合物胶束为纳米载体，在胶束的聚天冬氨酸外层原位还原形成纳米银，同时利用胶束的聚己内酯内核负载光敏剂原卟啉，从而将具有广谱抗菌作用的纳米银与能发挥光动力治疗作用的光敏剂原卟啉有效结合于一体，制备得到具有协同抗菌作用的聚合物胶束。其中，聚天冬氨酸-b-聚己内酯胶束PM：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：(0.1-0.5)：(0.01-0.1)。
本发明进一步公开了纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18 mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得空白胶束溶液（PM）；
2）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯和（1.0-5.0 mg）原卟啉溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得单独负载原卟啉的胶束溶液（PM@PpIX）；
3）向冰水浴搅拌下的PM胶束溶液中逐滴加入(10-100 μL)10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，可观察到溶液颜色有淡黄色迅速变为棕色，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到单独负载纳米银的胶束溶液（PM@Ag）；
4）向冰水浴搅拌下的PM@PpIX胶束溶液中逐滴加入(10-100 μL)10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到同时负载原卟啉和纳米银的胶束溶液（PM@PpIX@Ag）, 胶束：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：(0.1-0.5)：(0.01-0.1)；
其中所述的聚天冬氨酸-b-聚己内酯（PAsp-b-PCL）的制备步骤如下：
1）称取5.0 g 减压蒸馏处理过的ε-己内酯（43.9 mmol）和10 mL重蒸的甲苯加入到干燥的25 mLSchlenk瓶中，随后加入 0.1 g N-（叔丁氧羰基）乙醇胺（0.6 mmol）作为引发剂，然后加入0.06 mg 辛酸亚锡作为催化剂；
2）通过三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程去除液体中的气体，之后液体在氩气保护下置于110°C的油浴锅中搅拌12h；
3）待反应结束后，将反应液经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，然后通过抽滤洗涤和真空干燥，得到端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯；
4）将上述3）中所得的端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯溶于三氟乙酸和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，置于室温下反应12 h，然后将反应液旋蒸以去除三氟乙酸，再利用二氯甲烷稀释逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色粉末；
5）将4）中白色粉末溶解于三乙胺和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，室温反应12 h，通过旋蒸去除三乙胺，然后经冰乙醚沉淀，抽滤洗涤，真空干燥，得到端基为氨基的聚己内酯；
6）称取1.0 g上述5）中得到的端基为氨基的聚己内酯（0.1 mmol）和1.5 g L-天冬氨酸苄酯-N-羧酸酐（6 mmol）加入到干燥的Schlenk瓶中，随后加入10 mL二氯甲烷溶解，经三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程后，在氩气保护下，30°C搅拌24 h；反应后的液体经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚产生沉淀，通过抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯；
7）将1.0 g上述6）中得到的聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯与10 mL三氟乙酸，1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸混合均匀，然后在0°C搅拌4 h，随后旋蒸去除三氟乙酸，经二氯甲烷稀释、冰乙醚沉淀、抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸-b-聚己内酯。
本发明更进一步公开了所述纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag在制备协同治疗细菌感染药物中的应用。实验结果显示空白胶束在有、无光照条件下均不具备抗菌能力；单独负载纳米银的聚合物胶束对细菌的杀灭能力与光照无关；在光照条件下，浓度为200μg/mL的单独负载原卟啉的聚合物胶束展现出优异的杀菌能力，而在相同光照条件下，浓度仅为150μg/mL的纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束即可达到相同效果，展现出优异的协同抗菌能力。
以金黄色葡萄球菌为例，纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束对其杀灭能力方面效果显著，步骤如下：
1）将制备的四种聚合物胶束（胶束浓度为0–200μg/mL，PBS，pH 7.4）加入到转染生物发光基因的金黄色葡萄球菌S. aureus Xen36 （1010 bacteria/mL）悬浮液（体积比1：1）混合均匀，96孔板中每孔加入100μL混合液置于37℃环境中培养2小时；
2）用635nm激光照射混合液10min，随后用生物发光成像仪（IVIS® Lumina II,Imaging System, Perkin Elmer）观测96孔板中生物发光情况。
本发明更加详细的描述如下：
纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag，它是以嵌段共聚物聚天冬氨酸-b-聚己内酯形成聚合物胶束为纳米载体，在胶束的聚天冬氨酸外层原位还原形成纳米银，同时利用胶束的聚己内酯内核负载光敏剂原卟啉，从而将具有广谱抗菌作用的纳米银与能发挥光动力治疗作用的光敏剂原卟啉有效结合于一体，制备得到具有协同抗菌作用的聚合物胶束。
纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束PM@PpIX@Ag的制备方法，其特征在于对细菌的杀灭能力，以金黄色葡萄球菌为例，步骤如下：
1）将制备的四种聚合物胶束（胶束浓度为0–200μg/mL，PBS，pH 7.4）加入到转染生物发光基因的金黄色葡萄球菌S. aureus Xen36 （1010 bacteria/mL）悬浮液（体积比1：1）混合均匀，96孔板中每孔加入100μL混合液置于37℃环境中培养2小时；
2）用635nm激光照射混合液10min，随后用生物发光成像仪（IVIS® Lumina II,Imaging System, Perkin Elmer）观测96孔板中生物发光情况。
两亲性嵌段共聚物聚天冬氨酸-b-聚己内酯（PAsp-b-PCL）在水体系中形成具有亲水性聚天冬氨酸外壳和疏水性聚己内酯内核的聚合物胶束。胶束的聚天冬氨酸外壳中的羧基基团（-COOH）可通过静电作用吸引Ag+离子，通过加入还原剂（如硼氢化钠）可将其原位还原成纳米银；而胶束的聚己内酯内核可通过疏水作用负载疏水性的光敏剂原卟啉。因此，通过聚合物胶束将纳米银与光敏剂原卟啉良好地结合在一起，制备得到一种新型的协同抗菌体系PM@PpIX@Ag。
纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束的制备方法，步骤如下：
1）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯和（1.0-5.0 mg）原卟啉溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得单独负载原卟啉的胶束溶液（PM@PpIX）；
2）向冰水浴搅拌下的PM@PpIX胶束溶液中逐滴加入(10-100 μL)10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到同时负载原卟啉和纳米银的胶束溶液（PM@PpIX@Ag）,胶束：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：(0.1-0.5)：(0.01-0.1)。
进一步的，所述的聚天冬氨酸-b-聚己内酯（PAsp-b-PCL）的制备步骤如下：
1）称取5.0 g 减压蒸馏处理过的ε-己内酯和10 mL重蒸的甲苯加入到干燥的25mLSchlenk瓶中，随后加入 0.1 g N-（叔丁氧羰基）乙醇胺作为引发剂，然后加入0.06 mg辛酸亚锡作为催化剂；
2）通过三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程去除液体中的气体，之后液体在氩气保护下置于110°C的油浴锅中搅拌12h；
3）待反应结束后，将反应液经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，然后通过抽滤洗涤和真空干燥，得到端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯；
4）将上述3）中所得的端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯溶于三氟乙酸和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，置于室温下反应12 h，然后将反应液旋蒸以去除三氟乙酸，再利用二氯甲烷稀释逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色粉末；
5）将4）中白色粉末溶解于三乙胺和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，室温反应12 h，通过旋蒸去除三乙胺，然后经冰乙醚沉淀，抽滤洗涤，真空干燥，得到端基为氨基的聚己内酯；
6）称取1.0 g上述5）中得到的端基为氨基的聚己内酯和1.5 g L-天冬氨酸苄酯-N-羧酸酐加入到干燥的Schlenk瓶中，随后加入10 mL二氯甲烷溶解，经三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程后，在氩气保护下，30°C搅拌24 h；反应后的液体经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚产生沉淀，通过抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯；
7）将1.0 g上述6）中得到的聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯与10 mL三氟乙酸，1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸混合均匀，然后在0°C搅拌4 h，随后旋蒸去除三氟乙酸，经二氯甲烷稀释、冰乙醚沉淀、抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸-b-聚己内酯。
本发明主要解决了光敏剂原卟啉水溶性差及纳米银在生理环境下不稳定易聚集降低抗菌效率的问题，重点考察了具有广谱抗菌作用的纳米银与发挥光动力治疗作用的原卟啉对金黄色葡萄球菌的协同抗菌效果，主要的难点在于利用聚合物胶束将纳米银与光敏剂原卟啉有效结合于一体，利用纳米银的自身的抗菌作用与原卟啉的光动力学治疗作用协同，从而增强抗菌效果。
本发明公开的纳米银结合光敏剂聚合物胶束及其制备方法所具有的积极效果在于：
本发明以嵌段共聚物形成的聚合物胶束为模板，将广谱抗菌剂纳米银和光敏剂原卟啉有效结合，以实现光动力学治疗与纳米银协同抗菌的目的，具有如下优势：1）材料的制备工艺简单；2）纳米银的使用以及光动力治疗均不会使细菌产生耐药性；3）通过发挥纳米银与光动力治疗的协同抗菌作用，显著提高抗菌效果。综上，本发明的胶束体系是一种具有良好应用前景的联合抗菌策略。
附图说明
图1为制备的四种聚合物胶束的物理化学性质表征：空白胶束（PM），单独负载原卟啉的胶束（PM@PpIX），单独负载纳米银的胶束（PM@Ag）和同时负载原卟啉和纳米银的胶束（PM@PpIX@Ag）；其中A为不同聚合物胶束溶液的照片；B.不同聚合物胶束的Zeta电位；C. 不同聚合物胶束的紫外吸收光谱；D.不同聚合物胶束的荧光光谱；
图2为四种聚合物胶束的粒径分布；其中A为空白胶束；B为单独负载纳米银的胶束；C为单独负载原卟啉的胶束；D为纳米银与原卟啉同时负载的胶束；
图3为四种聚合物胶束单线态氧产生能力的测定；其中A为纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束PM@PpIX@Ag在不同光照时间下ROS的产生情况； B为四种不同聚合物胶束及单线态氧检测探针在有、无光照条件下的ROS产生效率；
图4为四种聚合物胶束对金黄色葡萄球菌的杀伤作用；其中A为不同浓度的四种聚合物胶束溶液在有、无光照条件下杀灭转染生物发光基因的金黄色葡萄球菌的生物放光照片；B为不同浓度的四种聚合物胶束溶液在有、无光照条件下对转染生物发光基因的金黄色葡萄球菌的杀灭效率。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂来源如下：
ε-己内酯（99%），甲苯，N-（叔丁氧羰基）乙醇胺（99%），辛酸亚锡（96%），二氯甲烷（99%），无水乙醚（99%），三氟乙酸（99%），三乙胺（99%），L-天冬氨酸苄酯-N-羧酸酐，苯甲醚（98%），三氟甲磺酸（98%），N,N-二甲基甲酰胺（99%），硝酸银（99.9%），硼氢化钠（98%）均购自阿法埃萨化学有限公司。原卟啉（95%）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。
实施例1
（一）聚天冬氨酸-b-聚己内酯（PAsp-b-PCL）的制备，步骤如下：
1）称取5.0 g 减压蒸馏处理过的ε-己内酯（43.9 mmol）和10 mL重蒸的甲苯加入到干燥的25 mLSchlenk瓶中，随后加入 0.1 g N-（叔丁氧羰基）乙醇胺（0.6 mmol）作为引发剂，然后加入0.06 mg 辛酸亚锡作为催化剂；
2）通过三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程去除液体中的气体，之后液体在氩气保护下置于110°C的油浴锅中搅拌12h；
3）待反应结束后，将反应液经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，然后通过抽滤洗涤和真空干燥，得到端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯；
4）将上述3）中所得的端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯溶于三氟乙酸和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，置于室温下反应12 h，然后将反应液旋蒸以去除三氟乙酸，再利用二氯甲烷稀释逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色粉末；
5）将4）中白色粉末溶解于三乙胺和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，室温反应12 h，通过旋蒸去除三乙胺，然后经冰乙醚沉淀，抽滤洗涤，真空干燥，得到端基为氨基的聚己内酯；
6）称取1.0 g上述5）中得到的端基为氨基的聚己内酯（0.1 mmol）和1.5 g L-天冬氨酸苄酯-N-羧酸酐（6 mmol）加入到干燥的Schlenk瓶中，随后加入10 mL二氯甲烷溶解，经三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程后，在氩气保护下，30°C搅拌24 h；反应后的液体经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚产生沉淀，通过抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯；
7）将1.0 g上述6）中得到的聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯与10 mL三氟乙酸，1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸混合均匀，然后在0°C搅拌4 h，随后旋蒸去除三氟乙酸，经二氯甲烷稀释、冰乙醚沉淀、抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸-b-聚己内酯。
（二）四种不同聚合物胶束的制备，步骤如下：
1）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18 mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得空白胶束溶液（PM）；
2）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯和1.0 mg原卟啉溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18 mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得单独负载原卟啉的胶束溶液（PM@PpIX）；
3）向冰水浴搅拌下的PM胶束溶液中逐滴加入20 μL10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，可观察到溶液颜色有淡黄色迅速变为棕色，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到单独负载纳米银的胶束溶液（PM@Ag）。
4）向冰水浴搅拌下的PM@PpIX胶束溶液中逐滴加入20 μL 10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到同时负载原卟啉和纳米银的胶束溶液（PM@PpIX@Ag），胶束：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：0.1 ：0.02。
实施例2
参见图1和图2，给出了制备的四种聚合物胶束（PM、PM@PpIX、PM@Ag和PM@PpIX@Ag）的物理化学性质表征结果，步骤如下：
1）图1A可观察不同聚合物胶束的外观颜色，其中空白胶束PM为无色透明，单独负载原卟啉的胶束PM@PpIX为紫红色，表明原卟啉的成功负载，而外壳层原位还原纳米银的胶束PM@Ag和同时负载原卟啉与纳米银的胶束PM@PpIX@Ag的颜色分别为深棕色和深紫色；
2）通过ZetaPALS来测定不同聚合物胶束的表面电位，图1B表明四种胶束均显示负电性，空白胶束PM的负电性最强，其次是PM@PpIX和PM@Ag，PM@PpIX@Ag负电性最弱，间接证明了胶束成功负载纳米银与原卟啉；
3）用UV-2550型紫外可见分光光度计对四种聚合物胶束在200-800nm范围内的紫外吸收进行测量。如图1C所示，空白胶束PM在该范围内无明显紫外吸收，PM@Ag在400 nm处有很宽的纳米银的吸收峰，PM@PpIX在200-800 nm范围内有原卟啉的5个特征吸收峰，而PM@PpIX@Ag同时含有纳米银与原卟啉的特征吸收峰，证明了纳米银与原卟啉的成功负载；
4）用F-4600型荧光分光光度计在425nm的激发波长下对四种聚合物胶束进行扫描得到的荧光光谱，如图1D所示，PM@PpIX有一个较宽的发射光谱，而PM@PpIX@Ag的荧光强度有明显的下降，这归因于纳米银的作用，进一步证明成功合成了聚合物胶束；
5）取1 mL不同溶液分别放入测试池中，通过光散射测定不同溶液的粒径及粒径分布，图2显示PM、PM@Ag、PM@PpIX@Ag的流体力学直径Dh均在58-68 nm左右，而PM@PpIX的流体力学直径Dh在88nm左右，且粒径分布均比较窄；
参见图3，给出了四种不同的聚合物胶束在有、无光照条件下单线态氧的产生效率，步骤如下：
1）取50μL 9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸（ABDA）溶液（5 mM，DMSO）加入到950μL聚合物胶束（胶束浓度为0.5mg/mL，PBS，pH 7.4）中混合均匀
2）用635 nm的激光器照射混合液，每间隔一分钟取10μL的样品溶液利用高精度分光光度计测定其在200-900nm范围内的紫外吸收。
3）将不同时刻混合液在490 nm的吸收值对比0min时490 nm处的吸收值得到ROS的产生效率。
附图4评估了四种不同的聚合物胶束对生物发光基因转染的金黄色葡萄球菌的杀灭作用，步骤如下：
1）将制备的四种聚合物胶束（胶束浓度为0–200μg/mL，PBS，pH 7.4）加入到转染生物发光基因的金黄色葡萄球菌S. aureus Xen36（1010 bacteria/mL）悬浮液（体积比1：1）混合均匀，96孔板中每孔加入100μL混合液置于37℃环境中培养2小时；
2）用635nm激光照射混合液10min后，随后用生物发光成像仪（IVIS® Lumina II,Imaging System, Perkin Elmer）观测96孔板中生物发光情况。以PBS组的生物发光强度；
3）利用转染发光基因的金黄色葡萄球菌通过生物发光成像仪检测生物发光情况测定不同聚合物胶束对细菌的杀灭能力。结果如图4所示，空白胶束不具备抗菌能力；单独负载纳米银的聚合物胶束有浓度依赖性，但并没有表现出明显的细菌杀灭作用，且其杀菌能力与光照无关；单独负载原卟啉的聚合物胶束有明显的浓度依赖性，在浓度为200μg/mL时展现出优异的抗菌能力，同时负载纳米银与原卟啉的聚合物胶束在浓度150μg/mL时可达到相同效果，表现出优异的协同抗菌作用。
实施例3
不同配比如下：
制备胶束：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：0.2：0.05的样品，制备方法同实施例1，只是聚天冬氨酸-b-聚己内酯，原卟啉和10 mg/mL 硝酸银溶液的投料分别是10.0 mg，2.0 mg和 50 μL。
制备胶束：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：0.5：0.08的样品，制备方法同实施例1，只是聚天冬氨酸-b-聚己内酯，原卟啉和10 mg/mL 硝酸银溶液的投料分别是10.0 mg，5.0 mg和 80 μL。
实施例4
急性荨麻疹是常见的皮肤病之一，主要诱因为金黄色葡萄球菌及病毒的感染。以生物发光的金黄色葡萄球菌为例，通过96孔板生物发光实验测定四种聚合物胶束对细菌的杀灭作用。实验结果显示空白胶束在有、无光照条件下均不具备抗菌能力；单独负载纳米银的聚合物胶束对细菌的杀灭能力与光照无关且在浓度为200μg/mL未表现出对细菌的完全杀灭能力；在光照条件下，浓度为200μg/mL的单独负载原卟啉的聚合物胶束展现出对细菌的完全杀灭能力，而在相同光照条件下，浓度仅为150μg/mL的纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束即可达到相同效果，展现出优异的协同抗菌效果。因此，纳米银结合光敏剂原卟啉的聚合物胶束有望成为治疗急性荨麻疹的新型抗菌剂。

Claims (5)

1.一种纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag，其特征在于：它是以嵌段共聚物聚天冬氨酸-b-聚己内酯形成聚合物胶束为纳米载体，在胶束的聚天冬氨酸外层原位还原形成纳米银；其中，聚天冬氨酸-b-聚己内酯胶束PM：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：0.1-0.5：0.01-0.1。
2.权利要求1所述纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18 mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得空白胶束溶液（PM）；
2）称取10.0 mg聚天冬氨酸-b-聚己内酯和（1.0-5.0 mg）原卟啉溶解于2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，在电磁搅拌下将上述N,N-二甲基甲酰胺混合溶液以20s/滴的速度加入到18mL超纯水中，滴加完毕后将此溶液置于室温中搅拌过夜，随后将溶液进行透析处理以去除有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺，获得单独负载原卟啉的胶束溶液（PM@PpIX）；
3）向冰水浴搅拌下的PM胶束溶液中逐滴加入(10-100 μL) 10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，可观察到溶液颜色有淡黄色迅速变为棕色，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到单独负载纳米银的胶束溶液（PM@Ag）；
4）向冰水浴搅拌下的PM@PpIX胶束溶液中逐滴加入(10-100 μL)10 mg/mL 硝酸银溶液后，置于黑暗环境中均匀搅拌0.5 h，随后快速加入200 μL 10 mg/mL 新鲜配制的硼氢化钠溶液，继续搅拌4 h稳定胶束，之后透析24 h得到同时负载原卟啉和纳米银的胶束溶液（PM@PpIX@Ag）, 胶束：原卟啉：纳米银的重量份数比为1：0.1-0.5：0.01-0.1。
3.权利要求2所述的的制备方法，其特征在于聚天冬氨酸-b-聚己内酯（PAsp-b-PCL）的制备步骤如下：
1）称取5.0 g 减压蒸馏处理过的ε-己内酯（43.9 mmol）和10 mL重蒸的甲苯加入到干燥的25 mLSchlenk瓶中，随后加入 0.1 g N-（叔丁氧羰基）乙醇胺（0.6 mmol）作为引发剂，然后加入0.06 mg 辛酸亚锡作为催化剂；
2）通过三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程去除液体中的气体，之后液体在氩气保护下置于110°C的油浴锅中搅拌12h；
3）待反应结束后，将反应液经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，然后通过抽滤洗涤和真空干燥，得到端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯；
4）将上述3）中所得的端基为叔丁氧羰基保护的聚己内酯溶于三氟乙酸和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，置于室温下反应12 h，然后将反应液旋蒸以去除三氟乙酸，再利用二氯甲烷稀释逐滴加入到冰乙醚中产生沉淀，滴加完毕后低温静置，经抽滤洗涤，真空干燥后得到白色粉末；
5）将4）中白色粉末溶解于三乙胺和二氯甲烷（体积比为1：1）的混合溶剂中，室温反应12 h，通过旋蒸去除三乙胺，然后经冰乙醚沉淀，抽滤洗涤，真空干燥，得到端基为氨基的聚己内酯；
6）称取1.0 g上述5）中得到的端基为氨基的聚己内酯（0.1 mmol）和1.5 g L-天冬氨酸苄酯-N-羧酸酐（6 mmol）加入到干燥的Schlenk瓶中，随后加入10 mL二氯甲烷溶解，经三次循环液氮冷冻-抽真空-通氩气-解冻过程后，在氩气保护下，30°C搅拌24 h；反应后的液体经二氯甲烷稀释后逐滴加入到冰乙醚产生沉淀，通过抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯；
7）将1.0 g上述6）中得到的聚天冬氨酸苄酯-b-聚己内酯与10 mL三氟乙酸，1 mL苯甲醚和1 mL三氟甲磺酸混合均匀，然后在0°C搅拌4 h，随后旋蒸去除三氟乙酸，经二氯甲烷稀释、冰乙醚沉淀、抽滤洗涤、真空干燥后得到聚天冬氨酸-b-聚己内酯。
4.权利要求1所述纳米银结合光敏剂聚合物胶束PM@PpIX@Ag在制备协同治疗细菌感染药物中的应用。
5.权利要求1所述的应用，其中协同治疗细菌感染指的是对金黄色葡萄球菌的协同杀灭能力。
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