KR101496697B1 - 바이오이미징 및 표적 광역동 치료 기능을 동시에 갖는 고형광성의 탄소 나노점 유도체 - Google Patents

바이오이미징 및 표적 광역동 치료 기능을 동시에 갖는 고형광성의 탄소 나노점 유도체 Download PDF

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Abstract

탄소 나노점의 표면에 선형 고분자로 패시베이션하고 세포 수용체 결합성의 리간드 화합물로 기능화한 탄소 나노점 유도체는 형광성, 생체적합성 및 표적화 특성이 우수하므로, 상기 탄소 나노점 유도체에 광감작제를 담지시켜 바이오이미징과 뿐만 아니라 암 등을 치료하기 위한 표적 광역동 치료에도 유용하고 편리하게 사용될 수 있다.

Description

바이오이미징 및 표적 광역동 치료 기능을 동시에 갖는 고형광성의 탄소 나노점 유도체{HIGHLY FLUORESCENT CARBON NANODOT DERIVATIVES FOR SIMULTANEOUS BIOIMAGING AND TARGETED PHOTODYNAMIC THERAPY}
본 발명은 바이오이미징 및 표적 광역동 치료에 사용되는 탄소 나노점 유도체에 관한 것이다.
형광 현미경, 레이저 기술 및 나노 기술 분야에서 세포 이미징(cellular imaging)이 가능한 생체학적 표지(biological label)에 대한 관심이 증가하고 있다(R. Weissleder, Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 11. 참조). 생체학적 표지는 질병 진단과 치료에 있어서 세포내 수송과 생화학적 현상을 추적하는데 유용하다(J. K. Willmann et al, Nat. Rev. Drug Discovery 2008, 7, 591. 참조).
발광성 생체학적 표지로서는 형광 유기염료 및 유전자 조작된 단백질이 현재 널리 사용되고 있으나, 최근 반도체 나노입자, 즉 양자점(quantum dot)이 우수한 발광성 및 안정성 같은 물리학적/화학적 특성 외에도 광물리학적 특성을 조정할 수 있다는 점에서 주목을 받고 있다(X. Michalet et al, Science 2005, 307, 538. 참조). 이러한 장점에도 불구하고, 양자점에 함유된 중금속에 의한 독성과 환경적 문제로 인해, 양자점을 임상에 적용하는 것은 여전히 제한되고 있다(R. Hardman, Environ. Health Perspect. 2006, 114, 165. 참조).
이에 적절한 대안을 찾기 위한 많은 연구가 행해졌으며, 최근에는 양자점의 우수한 광물리학적 특성을 보유하면서도 생체적합성, 무독성, 제조성 및 안정성 면에서 우수한 탄소 나노입자, 즉 탄소 나노점(carbon nanodot, C-dot, 또는 CD)이 새로운 생체표지(biolabel)로서 연구되고 있다(S. N. Baker et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6726. 참조). 탄소 나노점은 일반적으로 산소-함유 작용기를 갖는 컨주게이션(conjugation)된 탄소군의 형태로 sp2- 및 sp3-혼성화된 탄소 나노구조의 혼합상으로 이루어진다(S. C. Ray et al, J. Phys. Chem. C 2009, 113, 18546. 참조).
탄소 나노점은 높은 형광 성질 이외에도 이의 독특한 화학적 구조로 인하여 sp2 탄소 골격내에 치료제 분자들이 결합될 수 있고, 이의 표면에는 생체친화성 리간드 같은 분자들이 추가로 컨주게이션될 수 있다. 이와 같은 특성들로 인해, CD는 진단과 치료가 동시에 가능한 진단치료학(theranostics) 분야에 이상적인 물질로서 개인맞춤 의료(personalized medicine)를 실현할 수 있다(P. Huang et al, Adv. Mater. 2012, 24, 5104. 참조).
최근 암의 치료를 위한 비침습성(non-invasive) 치료법으로서 광역동 치료(photodynamic therapy)가 널리 사용되고 있다(D. E. Dolmans et al, Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 380. 참조). 광역동 치료에서, 광감작제(photosensitizers, PS)가 특정 파장의 빛에 조사되면 세포내 활성산소종(ROS)을 발생시켜 인접 조직의 세포 사멸 및 괴사를 유도하게 된다(B. W. Henderson et al, Photochem. Photobiol. 1992, 55, 145. 참조).
그러나, 광감작제는 일반적으로 용해도가 낮고 선택성이 저조하기 때문에, 이의 수용성(aqueous solubility)과 세포 침투성(cellular internalization)을 높이기 위해 담체(carrier)가 이용되고 있다(D. Bechet et al, Trends Biotechnol. 2008, 26, 612. 참조). 예를 들어, 리포좀, 중합체 나노입자, 금 나노입자, 탄소 나노튜브, 그래핀(graphene) 등과 같은 담체 내로 광감작제를 도입하는 기술들이 연구되었다(A. S. L. Derycke et al, Adv. Drug Delivery Rev. 2004, 56, 17. 참조).
이와 같은 종래의 담체를 이용하여 수성 매개체에 대한 용해도를 증가시킬 수 있지만, 그 외에도 치료 기능, 이미징 기능 및 표적화 기능을 동시에 갖는 담체의 개발이 요구되고 있다.
R. Weissleder, Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 11. J. K. Willmann et al, Nat. Rev. Drug Discovery 2008, 7, 591. X. Michalet et al, Science 2005, 307, 538. R. Hardman, Environ. Health Perspect. 2006, 114, 165. S. N. Baker et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6726. S. C. Ray et al, J. Phys. Chem. C 2009, 113, 18546. P. Huang et al, Adv. Mater. 2012, 24, 5104. D. E. Dolmans et al, Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 380. B. W. Henderson et al, Photochem. Photobiol. 1992, 55, 145. D. Bechet et al, Trends Biotechnol. 2008, 26, 612. A. S. L. Derycke et al, Adv. Drug Delivery Rev. 2004, 56, 17.
본 발명의 목적은 형광성, 생체적합성 및 표적화(targeting) 특성이 우수한 탄소 나노점 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바이오이미징과 표적 광역동 치료가 동시에 가능한 탄소 나노점 유도체를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 탄소 나노점, 상기 탄소 나노점의 표면에 결합된 선형 고분자, 및 상기 선형 고분자의 말단에 결합된 세포 수용체 결합성의 리간드 화합물을 포함하는, 탄소 나노점 유도체를 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 탄소 나노점 유도체, 및 상기 탄소 나노점 유도체에 담지된 광감작제를 추가로 포함하는, 광감작제-담지된 탄소 나노점 유도체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 탄소 나노점 유도체를 포함하는, 바이오이미징 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 광감작제-담지된 탄소 나노점 유도체를 포함하는, 바이오이미징 겸용 표적 광역동 치료 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 탄소 나노점 유도체는 형광성과 생체적합성이 우수할 뿐 아니라 표면에 결합된 리간드 화합물을 매개로 세포내흡입(endocytosis)될 수 있어서 표적화 특성이 우수하므로 바이오이미징 등에 활용할 수 있고, 광감작제를 담지시켜 바이오이미징과 뿐만 아니라 암 등을 치료하기 위한 표적 광역동 치료에도 유용하고 편리하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 첨부한 아래의 도면을 참조하여 설명한다.
도 1 은 본 발명의 일례에 따라 α-사이클로덱스트린으로부터 탄소 나노점(CD)을 제조하고, 이를 엽산으로 기능화하고 징크프탈로시아닌(ZnPc)을 담지시킨 탄소 나노점(CD-PEG-FA/ZnPc)으로 제조하여, 표적 광역동 치료(targeted photodynamic therapy)에 이용하는 것을 나타낸 개략도이다.
도 2 는 (a) 탄소 나노점의 구조의 일례, 및 (b) 이의 표면에 선형 고분자가 결합된 구조의 일례를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3 에서, (a)는 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 UV-vis 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이고, (b)는 CD-PEG-FA의 3차원 형광 스펙트럼을 나타낸 것이며, (c)는 CD-PEG-FA의 투과전자현미경(TEM) 이미지와 이의 입경 분포를 히스토그램으로 나타낸 것이고, (d)는 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이고, (e)는 원자힘 현미경(AFM)으로 CD-PEG-FA의 표면 높이를 관찰한 이미지(topography image)이다
도 4 의 (a) 내지 (d)는 HeLa 세포를 50μg/㎖ 탄소 나노점 유도체들로 12시간 동안 처리한 뒤 이의 광학 이미지와 형광 이미지를 관찰한 것이다.
도 5 의 (a) 내지 (d)는 HeLa 세포를 탄소 나노점 유도체로 처리하고 레이저로 조사한 뒤의 광학 및 형광 이미지이고, (e) 및 (f)는 광역동 효과를 정량적으로 측정한 결과이다.
도 6 은 시간상관 단일광자 계수법(TCSPC)에 의해 측정된 시간분해(time-resolved) 광발광 신호를 나타낸 것이다.
도 7 은 (a) CD, (b) CD-PEG, (c) CD-PEG-FA 및 (d) CD-PEG-FA/ZnPc의 발광 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.
도 8 은 각각 (a) CD, (b) CD-PEG 및 (c) CD-PEG-FA의 디컨볼루션된 고해상 XPS C 1s 피크를 나타낸 것이다.
도 9 는 원자힘 현미경(AFM)을 이용하여 (a) CD, (b) CD-PEG 및 (c) CD-PEG-FA의 표면 높이를 관찰한 것이다. 기준자 막대는 1㎛에 해당한다.
도 10 의 (a)는 CD-PEG-FA, CD-PEG-FA/ZnPc 및 ZnPc의 UV-vis 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이고, (b)는 ZnPc 및 CD-PEG-FA/ZnPc의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11 은 다양한 농도의 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA를 이용하여 HeLa 세포에 대해 CCK-8 기반의 세포 생존률 검정을 실시한 결과이다.
도 12 는 다양한 농도의 CD-PEG-FA/ZnPc를 이용하여 HeLa 세포에 대해 CCK-8 기반의 세포 생존률 검정을 실시한 결과이다.
도 13 은 HeLa 세포를 CD-PEG-FA/ZnPc로 처리하고 레이저로 조사한 후에 이의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
탄소 나노점
본 발명에서 사용하는 탄소 나노점은 탄수화물을 탈수한 뒤 열분해하여 수득된 것일 수 있으며(도 1 참조), 이와 같이 수득된 탄소 나노점은 생체적합성, 형광성 및 수분산성이 우수하다.
상기 탄수화물은 올리고당일 수 있으며, 예를 들어 2개 내지 10개의 당이 글리코시드 결합을 이룬 것일 수 있고, 구체적인 예로서 알파-사이클로덱스트린 또는 베타-사이클로덱스트린일 수 있다. 또는 상기 탄수화물은 시트르산 또는 글루코오스일 수 있으며, 앞서 예시한 구체적인 화합물들의 혼합물도 가능하다.
상기 탈수 공정은, 상기 탄수화물을 산과 반응시키는 것에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 황산, 질산, 염산 및 이들의 혼합산에 의해 가능하다.
또한, 상기 열분해 공정은 예를 들어 질소 분위기 하에서 환류 등에 의해 실시될 수 있다. 이 때 환류 시간은 5 내지 36 시간일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 20 시간일 수 있다.
탄소 나노점 유도체
본 발명은 (i) 탄소 나노점, (ii) 상기 탄소 나노점의 표면에 결합된 선형 고분자, 및 (iii) 상기 선형 고분자의 말단에 결합된 세포 수용체 결합성의 리간드 화합물을 포함하는, 탄소 나노점 유도체를 제공한다(도 1 참조).
상기 탄소 나노점에 관한 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 선형 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 이때 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 Mw 1000~2000일 수 있다.
또한, 상기 선형 고분자는 말단에 아민기를 갖는 것이 바람직하며, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 다이아민일 수 있다.
상기 선형 고분자는 말단의 아민기와 탄소 나노점 표면에 존재하는 카복실기 간에 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
도 2의 (a)는 탄소 나노점의 구조의 일례를 모식적으로 나타낸 것이며 (b)는 탄소 나노점의 표면에 선형 고분자가 결합된 구조의 일례를 모식적으로 나타낸 것이다.
상기 탄소 나노점은 이의 표면에 결합된 상기 선형 고분자에 의해 표면 패시베이션(surface passivation)이 이루어질 수 있으며, 그 결과 생체적합성과 형광성이 향상될 수 있다.
표면에 패시베이션된 리간드들은 탄소 나노점의 표면 상에서 여기자(exciton pair)가 생성된 이후의 홀-트랩핑(hole-trapping)을 감소시킴으로써 형광 효율을 증가시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Y. P. Sun et al, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 7756 참조).
상기 리간드 화합물은, 예를 들어 엽산(folic acid), 히알루론산(hyaluronic acid), 리툭시맙(rituximab), 압타머(aptamer), 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptors, EGFR), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 리간드 화합물은 바람직하게는 암 세포 수용체 결합성의 리간드 화합물일 수 있다.
특히, 상기 리간드 화합물이 엽산일 경우, 엽산에 양성인 암 세포(FA-positive cancer cell)에 대해 표적 전달(targeted delivery)을 수행할 수 있다.
엽산은 암 세포에 대한 높은 친화력과 안정성으로 인하여, 다양한 유형의 인간 암 세포에서 과발현되는 엽산 수용체(folate receptor)에 대한 이상적인 리간드이다 (C. P. Leamon et al, Drug Disc. Today 2001, 6, 44. 참조).
상기 리간드 화합물은 바람직하게는 카복실기를 하나 이상 가지는 화합물일 수 있으며, 상기 리간드 화합물의 카복실기와 상기 선형 고분자 말단의 아민기 간에 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 또한, 상기 아마이드 결합은 화학적 컨주게이션에 의한 것일 수 있다.
이와 같은 탄소 나노점 유도체는 형광성 및 생체적합성, 및 표적화 특성이 우수하므로, 바이오이미징에 유용하게 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 탄소 나노점 유도체를 포함하는 바이오이미징 키트를 제공한다.
탄소 나노점 유도체 (광감작제 담지)
상기 탄소 나노점 유도체는, 광감작제(photosensitizer)가 담지된 탄소 나노점 유도체로서 제공될 수 있다(도 1 참조).
상기 광감작제는 광 조사에 의하여 인접 세포에 일중항 산소와 같은 활성 산소종을 발생시킬 수 있는 물질이면 가능하다.
상기 광감작제의 예로는, 징크프탈로시아닌(zinc phthalocyanine, ZnPc), 헤마토포르피린(hematoporphyrin), 클로린(chlorin), ALA(5-aminoevulinic acid), 인도시아닌그린(Indocyanine green, ICG), 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.
이 중, 징크프탈로시아닌은 긴 수명을 갖는 삼중항(triplet) 여기 상태를 효율적으로 생성하여 광역동 효과가 우수하고, 임상 응용에 대한 미국 식품의약청(US Food and Drug Administration, FDA)의 승인을 받아서, 광감작제로서 각광을 받고 있다 (J. W. Owens et al, Inorg. Chim. Acta 1998, 279, 226; M. Triesscheijn et al, Oncologist 2006, 11, 1034; C. M. Allen et al, Porphyr. Phthalocyanines 2001, 5, 161. 참조).
상기 광감작제는 상기 탄소 나노점 유도체 상에 π-π 상호작용(π-π stacking interaction)에 의해 담지될 수 있다.
이와 같이 광감작제가 담지된 탄소 나노점 유도체는, 형광성과 생체적합성이 우수하고, 엽산을 매개로 세포내흡입(endocytosis)될 수 있어서 광감작제의 표적 전달이 가능하며, 광감작제로 인하여 광 조사시에 인접 세포에 활성 산소종을 발생시키므로 바이오이미징과 표적 광역동 치료를 동시에 달성할 수 있어서(도 1 참조), 치료진단(theranostic) 분야에 유용하다.
이에 따라, 본 발명은 상기 광감작제-담지된 탄소 나노점 유도체를 포함하는, 바이오이미징 겸용 표적 광역동 치료 키트를 제공한다.
이때 상기 표적 광역동 치료는 바람직하게는 암 세포에 대한 표적 광역동 치료이다.
구체적인 실시예 및 시험예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
이하에서, 용어 "CD"는 탄소 나노점(carbon nanodot, carbon dot 또는 C-dot)을 의미한다.
용어 "PEG"는 폴리에틸렌글리콜을 의미한다.
용어 "FA"는 엽산(folic acid 또는 folate)을 의미한다.
용어 "ZnPc"는 징크프탈로시아닌(zinc phthalocyanine)을 의미한다.
용어 "CD-PEG"는 PEG로 패시베이션(passivation)된 탄소 나노점을 의미한다.
용어 "CD-PEG-FA"는 FA로 기능화된 CD-PEG를 의미한다.
용어 "CD-PEG-FA/ZnPC"는 ZnPc가 담지된 CD-PEG-FA를 의미한다.
용어 "CD 유도체"는 CD-PEG, CD-PEG-FA 및 CD-PEG-FA/ZnPC를 모두 포함한다.
재료 및 원료:
- α-사이클로덱스트린, PEG 다이아민(M W=1,500), FA, 및 ZnPc는 시그마알드리치사(SigmaAldrich)에서 구입하였다.
- H2SO4, HNO3, 및 K2CO3은 대정화학사(한국)에서 구입하였다.
- CCK-8(Cell counting kit-8)은 도진도 연구소(Dojindo Laboratories, 일본)에서 구입하였다.
- 라이브/데드(Live/deadTM) 생존/세포독성 키트 및 SOSG(singlet oxygen sensor green) 시약은 몰레큘라 프로브즈사(Molecular Probes, 미국)에서 구입하였다.
- 10X 인산염 완충 식염수(PBS, phosphate buffered saline), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 소태아 혈청(FBS, fetal bovine serum)은 웰진사(한국)에서 구입하였다.
제조예 1: 탄소 나노점의 제조
탄수화물을 농축 황산(H2SO4)으로 탈수시켜 CD를 합성하였다. 구체적으로, α-사이클로덱스트린 2.00g을 황산 8mL에 서서히 첨가하고 여기에 물 5mL를 첨가하여 상기 α-사이클로덱스트린을 용해시켰다. 수득한 흑색 용액을 1시간 동안 격렬하게 교반한 후, 물 40mL로 희석하였다. 이후, 용액을 10분 동안 4000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 침전물을 증류수로 2회 세척하고, 물 5mL 및 22.5mM HNO3 6mL 중에 재현탁하고, 1시간 동안 초음파 처리하였다. 생성된 용액을 질소 하에서 12시간 동안 120℃에서 환류시킨 후, K2CO3로 중화시켰다. 과량의 K2CO3를 제거한 후 하루동안 투석(SpectraPore MWCO 1,000)하여 여분의 염분을 제거하였다.
실시예 1: ZnPC 담지된 CD-PEG-FA의 제조
앞서 얻은 CD 용액을 증류수를 이용하여 1/10 농도로 희석시키고, 120℃에서 72시간 동안 150mM PEG로 환류시켜 CD를 패시베이션한 뒤, 2일 동안 물로 투석하였다. 10mM FA 및 10mM 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC)를 NaHCO3로 포화된 증류수 1.0mL 중에서 혼합한 후, 실온에서 18시간 동안 1.0mg/mL CD-PEG과 반응시켜, FA와 컨주게이션된 CD-PEG(CD-PEG-FA)를 제조하고, 증류수로 2일 동안 투석하여 정제하였다. 이후, ZnPc 2.0mg을 클로로포름에 용해하여 60℃에서 증발시키고 1.0mg/mL CD-PEG-FA와 혼합하여, ZnPc이 담지된 CD-PEG-FA를 수득하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 초음파 처리한 후, 폴리비닐리덴다이플루오라이드(PVDF) 주사기 필터(0.2μm)로 여과하였다.
CD-PEG-FA에 대한 ZnPc의 담지량은 ZnPc의 흡광도의 표준 곡선으로부터 계산하였다. 그 결과, CD-PEG-FA 1g 당 약 0.6mg의 ZnPC가 담지됨을 확인하였다.
시험 방법
(1) 형광 소멸 시험
0.4μM ZnPc가 1.0mg/mL CD-PEG-FA에 담지되기 전/후의 형광 스펙트럼을 형광계(fluorometer, BioTek, 미국)을 이용하여 여기 파장 650nm에서 측정함으로써, CD-PEG-FA에 대한 ZnPc의 담지량을 평가하였다.
(2) 세포 배양
스트렙토마이신, 1% 페니실린 및 10% FBS을 함유하는 4.5g/L D-글루코스를 갖는 DMEM 중에서 HeLa 세포주를 5% CO2 및 37℃의 분위기에서 배양시켰다.
(3) 세포 독성 시험
CD의 세포 독성을 조사하기 위해, CCK-8 기반의 세포 생존률 검정(cell viability assay)을 실시하였다. HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 1x104세포/웰 농도로 24시간 동안 접종하고, HeLa 세포를 무혈청 배지에서 CD로 다양한 농도(0~450μg/mL)로 처리하였다. 12시간 배양 후, 세포를 1X PBS로 세척하고, 2시간 동안 혈청-함유 배지에서 배양하였다. 이후, 세포를 1X PBS로 조심스럽게 세척한 후, CCK-8 검정 용액을 첨가하고 1시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices Inc., 미국)를 사용하여 450nm 및 670nm에서 흡광도를 측정하였다.
CD-PEG-FA/ZnPc의 광역동 효과에 따른 세포 생존률을 정량적으로 측정하기 위해, HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 1x104세포/웰 농도로 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 실시예 1에서 제조한 CD-PEG-FA/ZnPc를 다양한 농도로 배양하였다. 12시간 배양 후, 각 웰을 10분 동안 660nm LED 레이저(30mW/cm2, 미광전자)로 조사하고, 상기 배지를 혈청-함유 배지로 교체하였다. 이후, 추가 12시간 동안 더 배양하고, CCK-8 기반의 세포 생존률 검정을 앞서와 같이 실시하였다. 이상의 시험을 3회 반복 실시하였다.
(4) 세포 이미징
HeLa 세포를 4-웰 유리 플레이트에 1.2x105세포/웰 농도로 접종하였다. 24시간 배양 후, 각 웰의 무혈청 배지에 CD 유도체들을 12시간 동안 접종하였다. FA 수용체를 갖는 세포의 흡수를 관찰하기 위해, FA가 컨주게이션된 CD 유도체들을 처리하기 전에 과량의 FA를 2시간 동안 처리하였다. 12시간 배양 후, 세포를 1X PBS로 조심스럽게 세척하고, 배지를 혈청-함유 배지로 교체하였다. 10X 대물렌즈(1.4 numerical aperture, Olympus, 일본)가 구비된 Ti 도립형광 현미경을 사용하여 세포 이미지를 얻었다.
광역동 효과를 측정하기 위해, 실시예 1에서 제조한 50㎍/mL CD-PEG-FA/ZnPc를 무혈청 배지에서 HeLa 세포에 1.2x105세포/웰 농도로 처리하고, 24시간 동안 12-웰 플레이트에서 예비 배양하였다. 혈청-함유 배지로 교체한 후, 660nm 광섬유 결합 레이저(30 mW/㎠, 레이저랩, 한국)로 10분 동안 세포를 조사하였다. 추가로 4시간 더 배양한 후, 라이브/데드 검정 시약을 제조사의 프로토콜에 기초하여 각 웰에 처리하였다. 이후, 10X 대물렌즈가 구비된 Ti 도립형광 현미경을 이용하여 세포의 형광 이미지를 수득하였다.
(5) 일중항 산소 검출
일중항 산소(SO)를 검출하기 위해, 일중항 산소의 존재 하에서 530nm의 강한 녹색 형광(λex=504nm)을 방출하는 SOSG 시약을 사용하였다. 2% 메탄올에 용해된 2.5μM SOSG를 3.8μM ZnPc 및 1.0mg/mL CD-PEG-FA/ZnPc에 첨가한 후, 660nm LED(30mW/cm2)를 조사하여 일중항 산소의 발생을 유도하였다. 일정 시간 조사 후, 530nm에서 방출되는 녹색 형광을 형광계(BioTek, 미국)를 이용하여 측정하였다.
(6) 특성화(characterizaion)
UV/Vis 분광광도계(UV-2550, Shimadzu)를 사용하여 흡광도를 측정함으로써 농도 제어 및 비교를 수행하였다. 흡광도 곡선을 통해 농도가 유사함을 확인하고, 이후 비교를 위해 농도를 조정하였다. 형광 데이터는 형광계(Agilent)를 이용하여 측정하였다. CD의 3차원 형광 스펙트럼은 분광형광계(FP-8300, JASCO)를 이용하여 수득하였다. CD의 크기와 형태를 측정하기 위해 투과 전자현미경(TEM, JEM-2100, JEOL) 및 원자힘 현미경(AFM, Dimension 3100, Veeco)을 사용하였다. XPS(K-알파, Thermo Fisher) 및 FT-IR(Agilent)을 이용하여, 패시베이션 이후의 작용기를 확인하였다.
(7) 발광 수명 측정
여기자(exciton)의 수명을 시간상관 단일광자 계수법(time-correlated single photon counting, TCSPC)에 의해 결정하였다. 375nm 파장, 54ps 펄스폭 및 40MHz 반복률을 갖는 컴퓨터 제어 다이오드 레이저를 여기원으로 사용하였다. 광발광 방출은 집광수단과 단색계(PicoQuant)를 사용하여 분광학적으로 산출하였다. 초고속 검출에는 MCP-PMT(R3809U-5X series, Hamamatsu)가 구비된 TCSPC 모듈(PicoHarp 300E, PicoQuant)을 사용하였다. 광발광 붕괴의 총 기기반응 함수(instrument response function, IRF)는 30ps 미만이었고, 일시적 시간분해능(temporal time resolution)은 10ps 미만이었다. 실제 형광 붕괴와 총 기기반응 함수(IRF)의 디컨볼루션(deconvolution)을 소프트웨어(FlouFit, PicoQuant)로 처리하여, 각각의 지수함수형 붕괴와 연관된 시간 상수를 산출하였다.
시험 결과
CD의 현탁액은 수용액 중에서 -39.8±0.45mV의 제타전위(zeta-potential)를 나타내고 매우 안정하였다. CD의 표면에서는 음전하가 관찰되었으며, 이는 카복실기 및 알콜기와 같이 표면 작용기의 존재를 의미하는 것이고, 이에 의해 콜로이드 안정성이 부여될 수 있다.
도 3에서, (a)는 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 UV-vis 흡광 스펙트럼을 나타내며, 삽입 이미지는 실내조명(왼쪽) 및 365nm UV 조명(오른쪽)에서의 CD-PEG-FA 현탁액을 각각 나타낸다. (b)는 여기 파장을 300~600nm 범위에서 10nm씩 증가시켜가며 측정한 CD-PEG-FA의 3차원 형광 스펙트럼을 나타낸다. (c)는 CD-PEG-FA의 투과전자현미경(TEM) 이미지와 이의 입경 분포를 히스토그램으로 나타낸 것이다. (d)는 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. (e)는 원자힘 현미경(AFM)으로 CD-PEG-FA의 표면 높이를 관찰한 이미지(topography image)이고, 삽입 그래프는 표면을 형상화한 것이다.
도 3에서 보듯이, 약 230nm에서 CD, 패시베이션된 CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 UV/vis 흡수 광대역 피크가 관찰되었으며, 이는 sp2 탄소 연결을 연상시키는 방향족계의 전형적인 흡수 피크에 해당한다 (L. B. Tang et al, ACS Nano 2012, 6, 5102 참조). 또한, 283nm에 나타난 피크로부터 CD의 표면에 FA가 결합되었음을 명확히 알 수 있다 (Y. C. Song et al, J. Mater. Chem. 2012, 22, 12568 참조). CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 제타전위는 각각 -12.4±0.75mV 및 -8.24±1.96mV(pH 7.3)이었으며, 이는 표면 패시베이션시에 작용기들이 감소하였음을 의미한다. 또한, CD-PEG 및 CD-PEG-FA는 UV 조사 하에서 밝은 청색 방출을 나타내었다(도 3의 (a)의 삽입 이미지 참조).
참고로, 퀴닌 설페이트(quinine sulfate)를 사용하였을때 CD의 양자수율(QY)은 2.1%로 측정되었다. 그러나 패시베이션 후, 양자수율은 CD-PEG의 경우 7.8%로, CD-PEG-FA의 경우 10.9%로 현저하게 증가하였다. 또한, 시간상관 단일광자 계수법(TCSPC)에 의해 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 여기자(exciton) 수명을 계산하였으며, 그 결과 1.55ns, 4.13ns 및 5.52ns로 각각 산출되었다. 하기 결과는 CD 유도체들의 양자수율과 잘 일치한다(도 6 및 하기 표 1 참조).
CD CD-PEG CD-PEG-FA
t1 (ns) 6.23 (0.07) 9.7 (0.37) 7.21 (0.58)
t2 (ns) 1.96 (0.48) 2.85 (0.08) 3.84 (0.33)
t3 (ns) 0.44 (0.45) 0.60 (0.55) 0.14 (0.09)
X2 1.04 1.2 1
taverage (ns) 1.55 4.13 5.52
CD-PEG 및 CD-PEG-FA 모두 형광 방출 피크(λex=360nm)의 최대 피크가 450nm에서 관찰되었고, 광대역 방출 피크의 최대 피크는 여기 파장에 크게 의존하였으며(도 3의 (b) 및 도 6 참조), 이는 전형적인 CD에 대해 알려진 바와 유사하다 (S. N. Qu et al, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 12215 참조). CD-PEG 및 CD-PEG-FA 모두 100nm 근방에서 반치전폭(full-width at half-maximum, FWHM)이 관찰되었으며, 이는 양자점에 대해 일반적으로 보고된 값보다 상당히 큰 것이다.
또한, FT-IR 분광법을 통해 표면 패시베이션에 따른 CD의 화학 작용기의 변화를 알 수 있었다. CD에서는 1068cm-1(C-O 스트레칭), 1608cm-1(C=C 스트레칭), 2848cm-1 및 2925cm-1(C-H 스트레칭)에서 피크가 관찰되었고, 3457cm-1에서 광대역 피크가 관찰되었으며, 이는 카복실기 및 하이드록실기에 해당한다(도 3의 (d) 참조). 표면 패시베이션 이후에 새로 관찰된 1594cm-1(N-H 평면내), 3283cm-1(N-H 스트레칭) 및 1340cm-1(C-N 스트레칭)에서 새로운 밴드는 CD 표면의 카복실기와 PEG의 말단 아민기가 화학적 컨주게이션에 의해 아마이드기를 형성하였음을 의미한다. 또한, PEG에 의한 표면 패시베이션 이후, C-O기에 해당하는 1102cm-1에서의 피크가 현저히 증가하였음을 확인할 수 있었다. FA가 패시베이션된 CD-PEG-FA의 경우, FA의 특징적인 피크에 해당하는 1481cm-1, 1605cm-1 및 1697cm-1에서의 피크가 관찰되었다 (H. Huang et al, Adv. Drug Delivery Rev. 2011, 63, 1332).
도 8은 각각 (a) CD, (b) CD-PEG 및 (c) CD-PEG-FA의 디컨볼루션된 고해상 XPS C 1s 피크를 나타낸 것이다. CD는 sp3 탄소(284.94eV), sp2 탄소(285.40eV), C-O기(286.8eV), C=O기(288.2eV) 및 COOH기(289.08eV)를 가지며, 이는 CD의 표면에 하이드록실기, 카보닐기 및 카복실기가 풍부하다는 것을 의미한다. 말단에 아민기를 갖는 PEG로 패시베이션한 후에는, PEG의 C-O기로 인해 286.28eV에서의 C-O 피크의 강도가 증가하였다. 또한, 카보닐기의 양이 6.06%로부터 0.50%로 감소되었으며, 이와 동시에 C-N기에 해당하는 새로운 피크가 287.43eV에서 관찰되었으며, 이는 CD의 카보닐기와 PEG의 아민기 사이에 g화학적 컨주게이션에 의한 아마이드 결합이 형성되었음을 의미한다. 또한, CD-PEG-FA의 경우에는 C-N기, C=O기 및 COOH기 피크의 강도가 증가하였으며, 이는 또한 FA로 처리한 후에 말단에 아민기를 갖는 PEG와 FA간의 아마이드 결합이 형성되었음을 의미한다.
이와 같은 고해상도 X선 광전자 분광법(high-resolution X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 통해 각 CD 유도체들의 조성 및 패시베이션 여부를 추가로 확인할 수 있었다(도 8 및 표 2 참조).
XPS에 의해 결정된 CD의 원소 조성
탄소 산소 질소
CD 17.39 50.48 0.79
CD-PEG 66.26 30.01 2.09
CD-PEG-FA 70.90 24.78 3.31
CD의 크기 및 형태는 투과 전자현미경(TEM)과 원자힘 현미경(AFM)에 의해 관찰되었다. TEM 이미지를 통해서 CD-PEG-FA가 4.5±0.2nm의 평균 직경을 갖는 구형 형태를 가짐을 확인할 수 있었다(도 3의 (c) 참조). 고해상도 TEM을 이용하여 층간 간격이 0.34nm임을 확인하였으며 이로서 CD가 흑연계 물질임을 알 수 있다.
도 9은 원자힘 현미경(AFM)을 이용하여 (a) CD, (b) CD-PEG 및 (c) CD-PEG-FA의 표면 높이를 관찰한 것이다. 기준자 막대는 1 ㎛에 해당한다. AFM 분석을 통해 CD, CD-PEG 및 CD-PEG-FA의 직경이 각각 약 3.5nm, 4.4nm 및 4.9nm임을 확인하였으며, 이는 CD의 표면에 PEG 및 FA가 순차적인 결합하였음을 의미한다(도 3의 (e) 및 도 9 참조).
CD-PEG-FA 상에 ZnPc는 π-π 상호작용(π-π stacking interaction)에 의해 담지된다. 도 10의 (a)는 CD-PEG-FA, CD-PEG-FA/ZnPc 및 ZnPc의 UV-vis 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이고, (b)는 ZnPc(실선) 및 CD-PEG-FA/ZnPc(점선)의 형광 스펙트럼(λex=650nm)을 나타낸 것이다. ZnPc가 담지된 CD-PEG-FA(CD-PEG-FA/ZnPc)는 ZnPc로부터 유래된 적색편이된(red-shifted) 흡수 피크가 607nm 및 689nm에서 관찰되었고 또한 ZnPc의 형광이 현저히 소멸되었으며(도 10 참조), 이는 ZnPc가 담지되었음을 의미한다 (M. Zhang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008, 105, 14773 참조).
도 7은 (a) CD, (b) CD-PEG, (c) CD-PEG-FA 및 (d) CD-PEG-FA/ZnPc의 발광 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)에서 각 곡선은 피크점이 높은 순서대로 각각 330nm, 340nm, 320nm, 350nm, 360nm, 370nm, 380nm, 390nm, 400nm 및 410nm 광에 대한 발광 스펙트럼을 나타내고; (b)에서 각 곡선은 왼쪽에서부터 각각 320nm, 330nm, 340nm, 350nm, 360nm, 370nm, 380nm, 390nm, 400nm 및 410nm 광에 대한 발광 스펙트럼을 나타내고; (c)에서 각 곡선은 피크점이 높은 순서대로 각각 400nm, 350nm, 370nm, 340nm, 380nm, 330nm, 320nm, 390nm, 400nm 및 410nm 광에 대한 발광 스펙트럼을 나타내고; (d)에서 각 곡선은 피크점이 높은 순서대로 각각 400nm, 350nm, 340nm, 370nm, 330nm, 380nm, 320nm, 390nm, 400nm 및 410nm 광에 대한 발광 스펙트럼을 나타낸다. 또한 삽입 이미지는 각각 주변광(왼쪽) 및 365nm UV 조명(오른쪽) 하에서의 CD 유도체들의 광학 이미지를 나타낸다. CD-PEG-FA의 특징적 형광 스펙트럼과 양자수율은 ZnPc의 담지에 따라 변하지 않았다.
CD-PEG-FA/ZnPc의 표적 전달과 광역동 치료의 효과를 평가하기 위해, FA 수용체-α를 과발현하는 것으로 알려진 인간 자궁경부암 HeLa 세포를 사용하였다 (L. S. Wang et al, ACS Nano 2010, 4, 4371 참조). CCK-8 기반의 세포 생존률 검정을 통해, 각각의 CD 유도체들이 시험 농도 범위(5~100μg/mL) 내에서 HeLa 세포에 대한 우수한 생체적합성을 가짐을 확인할 수 있었다(도 11 및 도 12 참조).
도 4의 (a) 내지 (d)는 HeLa 세포를 50μg/㎖ CD 유도체들로 12시간 동안 처리한 뒤 이의 광학 이미지와 형광 이미지를 관찰한 것으로서, 각각 (a) CD-PEG, (b) CD-PEG-FA, (c) CD-PEG-FA/ZnPc 및 (d) FA로 미리 처리된 CD-PEG-FA/ZnPc의 이미지를 나타낸다. CD(청색) 및 ZnPc(적색)의 형광 이미지가 각각 461nm(λex=358nm) 및 665nm(λex=647nm)에서 관찰되었다. 기준자 막대는 20μm에 해당한다.
도 4에서 보듯이, CD-PEG, CD-PEG-FA 및 CD-PEG-FA/ZnPc의 표적화를 평가하기 위하여, HeLa 세포를 12시간동안 배양하고 형광 현미경을 통해 CD(λex/λem=358/461nm) 및 ZnPc(λex/λem=647/665nm)의 청색 및 적색 형광을 관찰함으로써 CD 및 ZnPc의 세포내 침투를 확인하였다. 그 결과, CD-PEG-FA로 처리하여 배양한 세포들에서는 세포 원형질 내에서 강한 CD 형광이 관찰된 반면, CD-PEG로 처리하여 배양된 세포에서는 CD-PEG-FA와 동일한 농도로 처리하였음에도 HeLa 세포내에 침투한 흔적이 전혀 나타나지 않았다. 또한, CD-PEG-FA/ZnPc로 처리하여 배양한 세포에서는 HeLa 세포내에서 CD(청색)과 ZnPc(적색)의 강한 형광 신호가 관찰되었으며, 이는 CD 담체에 의해 ZnPc이 성공적으로 세포내 침투되었음을 의미한다.
아울러, FA의 표적화 역할을 확인하기 위하여, FA만을 처리하여 동일한 검정을 실시하였다. HeLa 세포 상의 FA 수용체들을 FA로 포화 반응시키고 나서, 이후에 CD-PEG-FA/ZnPc으로 처리하였으며, 그 결과 CD-PEG-FA/ZnPc의 세포내 침투가 전혀 없음을 확인할 수 있었다(도 4의 (d) 참조).
상기 결과들을 고려해볼 때, HeLa 세포의 표면에서의 과발현된 FA 수용체들이 CD-PEG-FA을 인지하고 수용체-매개 세포내흡입(receptor-mediated endocytosis)에 의해 CD-PEG-FA을 우선적으로 흡입하였음을 알 수 있다 (L. S. Wang et al, ACS Nano 2010, 4, 4371 참조).
광감작제가 수동적인 표적화 특성을 가지는 것은 약물 투여를 통한 생체 내의 광역동 치료에는 불충분할 수 밖에 없으므로, CD의 표면을 활성 표적화 리간드로 개질함으로써 종양에 광감작제를 국지적으로 증가시키는 것은 매우 중요하며 이를 통해 부작용을 방지하고 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.
ZnPc가 담지된 CD 유도체들의 HeLa 세포에 대한 광역동 효과를 평가하였다.
도 5의 (a) 내지 (d)에서 상부 이미지는 HeLa 세포를 50μg/㎖ CD 유도체들로 12시간 동안 처리하고 660nm 레이저(30mW/cm2)로 10분간 조사한 뒤의 광학 이미지이고, 하부 이미지는 이를 라이브/데드 검정을 통해 생존 세포와 사멸 세포를 각각 녹색 및 적색으로 착색한 형광 이미지이다. 각각 (a) CD-PEG, (b) CD-PEG-FA, (c) CD-PEG-FA/ZnPc 및 (d) 과량의 FA로 예비처리된 CD-PEG-FA/ZnPc의 이미지를 나타낸다. 기준자 막대는 100μm에 해당한다. 또한, (e) 및 (f)는 광역동 효과를 정량적으로 측정한 것이다. (e)는 SOSG(singlet oxygen sensor green) 시약을 이용하여 일중항 산소를 검출한 결과이다. 660nm 레이저(30mW/cm2)를 조사하면서 시간에 따른 형광 세기(λex/λem=504/530nm)를 측정하였다. 이때 3.8μM ZnPc 및 2.5μM SOSG를 사용하였다. CD-PEG-FA/ZnPc에 세포 용해물(cell lysate) 1 μL를 첨가한 경우에도 ZnPc와 SOSG의 실제 농도는 변하지 않았다. (f)는 ZnPc가 담지된 CD-PEG-FA 및 ZnPc를 10분 동안 조사하거나 조사하지 않은 채로 농도에 따른 세포 생존률 검정을 실시한 결과이다. 이상의 시험들은 3회 반복 수행되었으며, 오차막대는 표준편차를 나타낸다.
HeLa 세포를 CD 유도체로 12시간 동안 처리한 후, 레이저를 10분 동안 조사하였다(660nm, 30mW/cm2). 도 13은 HeLa 세포를 50μg/mL CD-PEG-FA/ZnPc로 12시간 동안 처리하고 660nm 레이저(30mW/cm2)로 10분 동안 조사한 후에 이의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 그 결과, CD-PEG-FA/ZnPc로 처리한 세포의 경우 명확한 세포 사멸이 관찰된 반면, CD-PEG, CD-PEG-FA 및 FA-전처리 CD-PEG-FA/ZnPc로 처리된 세포들에서는 광역동적 특성이 관찰되지 않았다(도 5 및 도 13 참조). 생존 세포와 사멸 세포들이 라이브/데드 검정에 의해 각각 녹색 및 적색으로 착색되었다. 기준자 막대는 100μm에 해당한다.
또한, ZnPc로부터의 광유발 에너지 이동(photoinduced energy transfer)을 통해 발생하는 활성 일중항 산소종을 SOSG(singlet oxygen sensor green) 시약을 사용하여 정량 측정하였다 (I. J. MacDonald et al, J. Porphyrins Phthalocyanines 2001, 5, 105 참조). 광감작제로부터 발생한 일중항 산소와 SOSG가 반응하는 경우 녹색 형광(λem=525nm)이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 이를 통해 일중항 산소 발생을 정량 측정할 수 있다 (A. Gollmer et al, Photochem. Photobiol. 2011, 87, 671 참조).
도 5의 (e)는 LED 광(30mW/cm2)의 조사하는 시간이 증가함에 따라 형광 세기가 점진적으로 증가하는 것을 나타내고 있다. 대조군으로서 ZnPc를 SOSG와 반응시키지 않은채로 측정한 것은 어떠한 형광 변화도 관찰되지 않은 반면, ZnPc와 CD-PEG-FA/ZnPc에 SOSG를 혼합할 경우 조사하는 시간에 따라 형광 세기의 증가를 나타냈다. SOSG는 자체로서 광감작제로 작용하고 일중항 산소종을 발생시키기 때문에 조사하는 시간이 증가함에 따라 형광 강도가 증가하였다 (X. Ragas et al, Chem. Commun. 2009, 45, 2920 참조). CD-PEG-FA/ZnPc의 경우에는, ZnPc와 CD 간의 분자내 에너지로 인해, SOSG와 혼합된 ZnPc에 비해 일중항 산소를 효과적으로 발생시키지 않았다. 그러나, 세포 용해물을 첨가(도 5의 (e) 참조, t=25분)하면서 일중항 산소의 발생이 크게 가속화되었으며, 이는 세포 용해물 내의 생체분자들과의 상호작용에 의해 ZnPc가 경쟁적 치환(competitive displacement)되어 CD로부터 ZnPc가 방출되었음을 의미하며, 이에 따라 광역동 치료의 효과가 입증되었다.
농도와 레이저 조사의 효과를 측정하는데 유용한 CCK-8 기반의 정량적 세포 생존률 검정을 HeLa 세포를 사용하여 실시하였다. 그 결과, ZnPc(레이저 조사됨), CD-PEG-FA/ZnPc(레이저 조사되지 않음) 및 CD-PEG-FA/ZnPc(레이저 조사됨)로 처리된 세포의 생존률이 100μg/mL의 농도에서 각각 60.9%, 94.2% 및 8.2%인 것으로 측정되었다.
상기 결과를 통해, 광감작제의 적절한 농도와 더불어 적절한 레이저 조사가 수행되어야 일중항 산소의 발생과 그에 따른 광역동 작용이 효과적으로 이행됨을 알 수 있었다. 더욱이, 레이저 조사된 CD-PEG-FA/ZnPc와 ZnPc 간의 생존률에서의 현저한 차이를 통해 CD-PEG-FA/ZnPc의 HeLa 세포 내로의 우수한 침투성을 확인할 수 있으며, 이에 따른 광역동 효과의 개선이 기대된다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

Claims (10)

  1. 탄소 나노점(carbon nanodot 또는 carbon dot),
    상기 탄소 나노점의 표면에 결합된 선형 고분자, 및
    상기 선형 고분자의 말단에 결합된 세포 수용체 결합성의 리간드 화합물을 포함하는 탄소 나노점 유도체로서,
    상기 탄소 나노점 유도체에 광감작제(photosensitizer)가 담지된, 탄소 나노점 유도체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 탄소 나노점이 2개 내지 10개의 당이 글리코시드 결합을 이룬 탄수화물을 탈수한 뒤 열분해(thermal decomposition)하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 탄소 나노점 유도체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 선형 고분자가 말단에 아민기를 갖는 것을 특징으로 하는, 탄소 나노점 유도체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 선형 고분자가 폴리에틸렌글리콜 다이아민인 것을 특징으로 하는, 탄소 나노점 유도체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 리간드 화합물이 암 세포 수용체 결합성의 리간드 화합물인 것을 특징으로 하는, 탄소 나노점 유도체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 리간드 화합물이 엽산인 것을 특징으로 하는, 탄소 나노점 유도체.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 광감작제가 징크프탈로시아닌인 것을 특징으로 하는, 탄소 나노점 유도체.
  9. 제 1 항의 탄소 나노점 유도체를 포함하는, 바이오이미징 키트.
  10. 제 1 항의 탄소 나노점 유도체를 포함하는, 바이오이미징 겸용 표적 광역동 치료 키트.
KR20130144905A 2013-11-26 2013-11-26 바이오이미징 및 표적 광역동 치료 기능을 동시에 갖는 고형광성의 탄소 나노점 유도체 KR101496697B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101928037B1 (ko) 2017-02-28 2018-12-11 창원대학교 산학협력단 알지네이트 기반 생체적합성 양친매성 중합체로 기능화된 바이오 이미징용 업컨버젼 발광 나노 입자
CN109232906A (zh) * 2018-09-20 2019-01-18 福建师范大学 多氟烷基轴向取代硅（iv）酞菁-碳纳米管纳米超分子体系及其制备方法与应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Phys. Chem. C, 2010, Vol.114, pp.12062-12068 (2010.06.24.) *
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