CN1415758A

CN1415758A - 盐酸万古霉素原料生产工艺

Info

Publication number: CN1415758A
Application number: CN 01132048
Authority: CN
Inventors: 陈代杰; 李继安; 戈梅; 刘垚; 邹韵华; 徐炳祥; 孟根水
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2001-10-30
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2003-05-07

Abstract

本发明属抗生素药物技术领域。本发明提供了一种盐酸万古霉素原料生产工艺。本发明的工艺采用了诱变选育的新菌种，发酵单位提高了400％。本发明工艺制得的产品质量好、纯度高，工艺成本低，三废少，宜于规模型工业化生产。

Description

盐酸万古霉素原料生产工艺

技术领域

本发明属抗生素药物技术领域。具体涉及一种盐酸万古霉素原料生产工艺。

背景技术

万古霉素是由Micormick等于1956年从一株东方链霉菌的发酵液中分离得到的一种糖肽类抗生素，1958年获美国FDA批准，由美国礼莱(Lilly)公司开发上市。万古霉素问世后的前20年，由于青霉素和头孢菌素类抗生素的上市使用，万古霉素仅作为保留药物，治疗由少数金黄色葡萄球菌引起的严重感染性疾病，临床使用很少。后来随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，导致由MRSA所引起的感染逐渐流行。至1982年，有报道称在美国大医院中，MRSA引起的感染已由原来的2％上升到20％。在这种情况下，万古霉素愈来愈引起人们的重视，并被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。由于它在临床中的重要地位，使之具有“王牌抗生素”之称。另外，由于万古霉素的作用机制独特，且多肽类抗生素在体内容易分解，使其不仅在临床上而且在畜牧业上也得到了广泛的应用。

五十年代中期国外从东方链霉菌的代谢产物中分离出万古霉素，经鉴定其结构属于糖肽类抗生素。后来由美国礼莱公司开发成功，用于治疗由革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。尤其对由β-内酰胺类抗生素引起的耐药金葡菌及难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium diffcile)有较好的疗效。

四十年来，国外医药界学者对该产品进行了大量的研究。包括其化学性质、药理、毒理、临床应用、微生物、分析测定及制剂等各个方面。在七十年代及八十年代对其化学结构进行了反复论证并最终得以确定，同时对其化学稳定性进行了深入的研究。近年来，又对万古霉素的结构进行了改造，目的在于进一步提高其抗菌效果。目前经结构改造获得的半合成万古霉素衍生物有LY333328等，其中LY333328正在进行临床研究。由于MRSA引起的感染病例不断增多，万古霉素的临床应用的重要性进一步凸现。

近几年来，万古霉素产品的质量也在不断的提高，由于纯度低而引起的毒副作用也在不断减少。万古霉素作为一种疗效独特的抗生素在临床应用上具有日益重要的地位。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于设计盐酸万古霉素原料生产工艺，提高产品质量。

本发明提供一种盐酸万古霉素原料生产工艺，该工艺为：

本发明的菌种是东方拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis orientalisSIPI-43491)本发明的工艺，包括下列步骤：

①含卡那霉素分离平板的制备

将无菌卡那霉素配成一定浓度的溶液，用0.3μm的无菌微孔滤膜过滤。取其溶液混合至高氏一号培养基配成含一定浓度卡那霉素的分离培养基，制备成为分离平板。

②诱变处理

在待诱变处理的新鲜斜面孢子中加入10毫升无菌水，刮下孢子振荡30分钟，过滤后得到单孢子悬浮液。将此单孢子悬浮液置于无菌平板中，缓缓转动下进行紫外线照射(紫外灯功率30W、波长253.7nm、照射距离33cm)60秒。按一定比例倍数稀释后涂布于分离平板，28℃避光培养5-6天。挑选大的菌落接种斜面28℃培养5-6天。

③摇瓶筛选

将经自然分离或诱变处理后的单菌落接种斜面28℃培养5-6天后进行摇瓶二级发酵。

④发酵

本发明工艺中发酵培养基的配方为：甘油6.0％；黄豆饼粉(热榨)2.0；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂ 0.02％；KNO₃ 0.6％；CaCO₃ 0.3％；消前pH7.2该配方在10L玻璃罐及中试生产中的发酵水平也基本能够稳定在2500μg/ml以上。

本发明工艺为发酵条件为温度25-30℃，最佳25℃；pH为6.5-7.0，最佳6.5；发酵周期5-8天；通气量1-1.5∶1(vol∶vol)；搅拌转速：300-400rpm。

⑤分离纯化：

加入盐酸酸化预处理；通过D1300吸附；纳滤浓缩脱盐；SephadexC25柱层纯化；冷冻干燥。

Sephadex C25柱层纯化的条件为：层析介质为：Sephadex C15、Sephadex C25、Sephadex C50；洗脱剂为0-1mol/L的NH₄HCO₃水溶液、0-1mol/L的(NH₄)₂CO₃水溶液；洗脱方式为梯度洗脱；洗脱顺序为洗脱剂浓度由低到高；洗脱可采用正向或反向；洗脱温度为4-25℃。

本发明工艺获得的产品质量符合USP质量标准，纯度高、色泽好，工艺成本低，三废少，易处理，可以大规模工业化生产。

附图说明图1万古霉素产生菌菌种选育系谱

具体实施方式

实施例1

①含卡那霉素分离平板的制备

②诱变处理

③摇瓶筛选

装量为100毫升/750毫升，接种量为10-12％，在转速为220rpm的摇床上28℃培养5-7天。取10％左右的高单位菌种进行复筛，初筛时做1只摇瓶试验，复筛时做3只摇瓶试验。经过这种方法得到的高产菌株Van-18-2的系谱如图1所示。与出发菌株SIPI-43491相比，该菌株的发酵单位提高了400％以上

实施例2

万古霉素发酵培养基的研究

培养基配方的选择及确定：

通过对培养基配方中的碳源、氮源及无机盐等的种类及浓度的研究，确定了发酵水平较高且稳定的斜面、种子及发酵培养基配方。

斜面培养基：

经培养基配方的筛选比较，确定万古霉素产生菌的斜面培养基采用高氏一号斜面培养基，具体配方如下：

可溶性淀粉2.0％；NaCl 0.05％；KNO₃ 0.01％；MgSO₄ 0.05％；FeSO₄ 0.001％；KH₂PO₄ 0.05％；琼脂2.2％，消后pH7.2-7.4

斜面接种后，于25℃培养6-7天。生长好的斜面丰满，表面呈灰白色，菌落呈馒头状，表面有浅灰色环纹，孢子乳白色，直径在3-5mm之间。

种子培养基：

经培养基配方的筛选比较，确定万古霉素产生菌的种子培养基具体配方如下：

可溶性淀粉4.0％；葡萄糖1.5％；甘油2.0％；黄豆饼粉(热榨)2.0％；KNO₃ 0.6％；KH₂PO₄0.02％；MgCl₂ 0.02％；泡敌0.06％消前pH6.8

摇瓶种子培养基装量：750ml摇瓶装量为100ml；培养温度：25℃；培养时间：44-48hr；生长良好的摇瓶种子液pH7.0左右，外观呈乳黄色，4000rpm离心10min，菌丝量在20-25％之间；镜检菌丝粗壮，无杂菌即可作为种子接入下一级种子罐培养或小试发酵罐发酵。

发酵培养基：

经过发酵培养基配方的碳、氮源及无机盐种类的选择及正交实验设计比较，确定了发酵培养基配方(采用自来水配制)如下：

甘油6.0％；黄豆饼粉(热榨)2.0；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂ 0.02％；KNO₃ 0.6％；CaCO₃ 0.3％；消前pH7.2该配方在10L玻璃罐及中试生产中的发酵水平也基本能够稳定在2500μg/ml以上。

实施例4

发酵条件的选择及确定：

通过试验，确定了万古霉素摇瓶及10L玻璃罐发酵的发酵条件。包括发酵温度、pH、摇床转速、摇瓶装量、玻璃罐通气量、搅拌转速等。

发酵温度：

通过在摇瓶条件下，25℃、28℃、30℃三个不同的温度发酵试验，结果证明在25℃时的发酵水平最高，发酵液中的副产物较其余两个温度条件为少，因此确定万古霉素发酵温度为25℃。发酵最适pH

通过在摇瓶条件下发酵培养基的初始pH为6.5、6.8及7.0三种不同的pH发酵条件试验，结果证明在发酵培养基的初始pH为6.5时的发酵水平最高，发酵液的颜色较另外两种条件为浅，副产物也较少，因此确定万古霉素的发酵培养基的初始pH为6.5左右。其它发酵条件

发酵周期：摇瓶发酵周期为6-8天，发酵罐发酵周期为5-7天。

摇瓶装量：750ml摇瓶装量为80-100ml时发酵水平最高。

10L玻璃罐发酵参数：通气量1-1.5∶1(vol∶vol)，搅拌转速500-600rpm。发酵罐放大及生产

根据摇瓶及10L玻璃罐的发酵参数，确定了100L小试罐及7吨中试罐的发酵条件，使实验室的研究在工厂得到验证。结果表明，该发酵工艺具有工业化生产的价值。

100L小试罐的发酵参数

培养基装量：50-80L；接种量：8-12％；通气量：1-1.5∶1(vol∶vol)；搅拌转速：300-400rpm；发酵周期：5-7天。7吨中试罐的发酵参数

培养基装量：4-5吨；接种量：8-12％；通气量：1-1.5∶1(vol∶vol)；搅拌转速：250-300rpm；发酵周期：5-7天，放罐pH7.0-7.5左右，放罐单位2500μg/ml以上。

实施例5

万古霉素分离纯化工艺

发酵液的预处理

由于在万古霉素的发酵终点时发酵液的pH在7.4左右，因此在发酵液中万古霉素是以游离碱的形式存在。而在分离纯化的第一步，即将万古霉素通过交换吸附到大孔吸附树脂(D1300)上。此交换过程要求抗生素以游离酸的形式存在。因此，需要用稀酸将发酵液酸化并使其pH调至3.0-3.5左右。考虑到酸化的同时具有促使发酵液中蛋白质变性沉淀的作用，采用草酸时对蛋白的沉淀效果优于盐酸，但由于万古霉素产品为盐酸盐形式，因此最终确定以盐酸作为酸化剂。

在此酸化过程中，同时可加入絮凝剂及助滤剂等使发酵液易于过滤且获得质量较好的发酵滤液。HPLC检测一般要求其万古霉素的峰面积积分面积比在40％左右。吸附、脱盐及脱色

为了进一步将发酵滤液中的万古霉素与其他的水溶性杂质相分离，需要将发酵滤液通过装有大孔羧酸型吸附树脂的树脂柱，水洗除去其他杂质后，再采用乙醇水溶液将抗生素解吸下来。采用D1300作为吸附树脂，在将发酵滤液通过树脂柱进行吸附前，应首先用4N NaOH将发酵滤液pH回调至4.5左右。解吸采用pH2.0的80％酸性乙醇水溶液。解吸液经HPLC分析检测，其积分面积比一般在75％左右，单位平均应在10,000μg/ml以上。

上述过程得到的解吸液经纳滤浓缩脱盐，再经针用活性炭脱色，并加入适量的黄血盐及硫酸锌除去铁离子后，可获得万古霉素积分面积比在75％左右、单位在80,000μg/ml以上的脱盐脱色浓缩液。该步骤获得的脱盐脱色浓缩液的质量对于后续的柱层纯化及成品质量十分重要，一般要求HPLC检测其面积积分比应在75％以上，万古霉素浓度不低于80,000μg/ml。

柱层纯化

柱层纯化的目的是将万古霉素进一步纯化，即将积分面积75-80％左右的脱盐脱色浓缩液的万古霉素含量提高到符合药典规定的含量在90％以上。通过对大量分离介质的选择试验，最终确定柱层采用的层析介质为Sephadex C-25，并进行了柱层条件、洗脱剂、洗脱方式等方面的深入细致的研究，确定了最佳的纯化方案，该纯化工艺方案采用0-1M NH4HCO3水溶液进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，洗脱液HPLC检测积分面积比应在95％以上，合格部分合并经过纳滤浓缩脱盐即为收得的层析精制液。上述精制液再经活性炭脱色、0.22um微孔滤膜过滤除热源后，即可得到可用于冷冻干燥的盐酸万古霉素精滤液。

合格的精制液经活性炭脱色、0.22um微孔滤膜过滤除热源后，HPLC检测其积分面积比为95％以上，该盐酸万古霉素精滤液通过冷冻干燥可获盐酸万古霉素无菌原料粉。

Claims

1.一种盐酸万古霉素原料生产工艺，其特征在于该工艺为：

2.根据权利要求1所述的一种盐酸万古霉素原料生产工艺，其特征在于其中所述的发酵培养基的配方为：甘油6.0％；黄豆饼粉(热榨)2.0；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂ 0.02％；KNO₃ 0.6％；CaCO₃ 0.3％；消前pH7.2该配方在10L玻璃罐及中试生产中的发酵水平也基本能够稳定在2500μg/ml以上。

3.根据权利要求1所述的发酵条件为：温度25-30℃，最佳25℃；pH为6.5-7.0，最佳6.5；发酵周期5-8天；通气量1-1.5∶1(vol∶vol)；搅拌转速：300-400ppm。

4.根据权利要求1所述的一种盐酸万古霉素原料生产工艺，其特征在于工艺中的该菌种是通过下列步骤选育得到的：

①含卡那霉素分离平板的制备

将无菌卡那霉素配成一定浓度的溶液，用0.3μm的无菌微孔滤膜过滤。取其溶液混合至高氏一号培养基配成含一定浓度卡那霉素的分离培养基，制备成为分离平板；

②诱变处理

在待诱变处理的新鲜斜面孢子中加入10毫升无菌水，刮下孢子振荡30分钟，过滤后得到单孢子悬浮液，将此单孢子悬浮液置于无菌平板中，缓缓转动下进行紫外线照射(紫外灯功率30W、波长253.7nm、照射距离33cm)60秒，按一定比例倍数稀释后涂布于分离平板，28℃避光培养5-6天，挑选大的菌落接种斜面28℃培养5-6天；

③摇瓶筛选

④本发明工艺中发酵培养基的配方为：甘油6.0％；黄豆饼粉(热榨)2.0；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂ 0.02％；KNO₃ 0.6％；CaCO₃ 0.3％；消前pH7.2该配方在10L玻璃罐及中试生产中的发酵水平也基本能够稳定在2500μg/ml以上。

5.根据权利要求3所述发酵条件得到的发酵液通过下述步骤进行分离纯化：加入盐酸酸化预处理；通过D1300吸附；纳滤浓缩脱盐；Sephadex C25柱层纯化；冷冻干燥。

6.根据权利要求5所述的Sephadex C25柱层纯化的条件为：层析介质为：Sephadex C15、Sephadex C25、Sephadex C50；洗脱剂为0-1mol/L的NH₄HCO₃水溶液、0-1mol/L的(NH₄)₂CO₃水溶液；洗脱方式为梯度洗脱；洗脱顺序为洗脱剂浓度由低到高；洗脱可采用正向或反向；洗脱温度为4-25℃。