CN105886421A - 一株拟无枝菌酸菌及利用该菌制备特戊依罗霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163以及利用该菌株发酵制备特戊酸依罗霉素的方法。拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163已于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445，保藏地址：中国武汉市武汉大学。本发明所述的拟无枝菌酸菌YIM M13163能够发酵产生抗生素特戊酸依罗霉素；同时，本发明利用该菌株制备特戊酸依罗霉素的方法简单，得率高，从而为特戊酸依罗霉素的药物价值的开发提供了足够的样品支持，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种海洋放线菌拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163以及利用该菌株制备特戊酸依罗霉素（efrotomycin
pivalate）的方法。
背景技术
依罗霉素（efrotomycin）具有广泛的生物活性，如在体外实验中，它对莫拉克斯氏菌属、巴氏杆菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌、嗜血杆菌属、链球菌属和棒状杆菌属等动物病原菌有良好的抗菌活性。对依罗霉素的抑菌活性测试表明，它对铜绿假单胞菌、大肠杆菌有稍弱的抑菌活性，而对苏云金芽孢杆菌有较强的抑菌活性。
这些良好的生物活性说明依罗霉素具有潜在的药物开发价值。但是，该化合物由于来源途径稀缺，仅在上个世纪80年代被人少量发现，由于获得依罗霉素的量较少，阻碍了对其进一步的研究。因此，寻找新的途径获得足够量的依罗霉素，对于依罗霉素的研发具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有依罗霉素研究的技术不足，提供一种新的能够发酵制备特戊酸依罗霉素（efrotomycin
pivalate）的拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.
YIM M13163）。该菌发酵产生的特戊酸依罗霉素（efrotomycin
pivalate），是一种含二糖的依罗霉素类抗菌素，
本发明另一个目的是提供所述拟无枝菌酸菌在制备抗生素特戊酸依罗霉素中的应用。
本发明再一个目的是提供上述拟无枝菌酸菌制备特戊酸依罗霉素的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，该菌株于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445。该菌株是从我国南海海底沉积物中分离获得，利用该菌株可以制备足量的特戊酸依罗霉素，具有很好的应用前景。
上述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163在制备特戊酸依罗霉素中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种利用上述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163制备特戊酸依罗霉素的方法，具体是将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163发酵得到发酵培养物，从发酵培养物中制备得到特戊酸依罗霉素。
进一步地，上述制备特戊酸依罗霉素的方法包括如下步骤：
S1.将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163进行恒温恒速液态发酵，得到发酵培养物；将该发酵培养物的发酵上清液与菌丝体分开；
S2.用丁酮萃取发酵上清液，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；
S3.用丙酮浸泡萃取菌丝体，超声处理得到丙酮浸提液，浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B；
S4.浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析提取馏分，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。
其中，作为一种可实施的优选方案，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养30～40h后，按照2～5v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养9 d，得到发酵培养物；
其中，所述种子培养基和发酵培养基的配方均为：可溶性淀粉2g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取粉2g/L，蛋白胨2g/L，K2HPO4
0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO3
2g/L，25g/L海盐，NaCl
4g/L。
更优选地，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于28℃、200 rpm条件下培养36 h后，按照4v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于28℃、200 rpm条件下培养8d，得到发酵培养物。
另外，上述制备特戊酸依罗霉素的方法中，步骤S1所述发酵培养物是经4000
r/min离心10 min得到发酵上清液和菌丝体；步骤S2所用丁酮与发酵上清液的体积比为1：1，反复萃取3次；步骤S3所用丙酮与菌丝体的体积比为1：1，反复萃取3次。
优选地，步骤S4所述浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析，以体积比100：1～1：100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的馏分合并后，再以甲醇或体积比10：1～1：10的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的馏分合并后，进行中压反相柱层析，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。
更进一步优选地，浸膏A经正相硅胶柱层析，以体积比4～49：1的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，再以甲醇或体积比1～9：1的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，进行中压反相柱层析，得到的各馏分随机合并后，再进行中压反相柱层析，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素；
浸膏B经正相硅胶柱层析，以体积比4～12：1的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，再以体积比1～4：1的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。
其中，所述纯化是经 60～100%的乙腈溶液（CH3CN/H2O）梯度洗脱30min，流速2.5 mL/min，保留时间16.7min。
利用上述方法制备纯化得到的特戊酸依罗霉素也在本发明的保护范围之内，其分子式为C59H88N2O20，其结构式如式（I）所示：
，
其中，R为式（II）所示：
。
另外，式（I）所示的特戊酸依罗霉素在抑菌方面的应用，和/或在制备抑菌药物中的应用，也均在本发明的保护范围之内。
优选地，所述菌为铜绿假单胞菌、大肠杆菌和/或苏云金芽孢杆菌。
更优选地，所述菌为苏云金芽孢杆菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株新的拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，可以产生特戊酸依罗霉素。
本发明还提供了一种新的特戊酸依罗霉素抗生素的生产工艺，即利用拟无枝菌酸菌YIM
M13163制备特戊酸依罗霉素的方法，得到的特戊酸依罗霉素对多种病菌具有很好的抗菌活性，比如铜绿假单胞菌、大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌，尤其是对苏云金芽孢杆菌有很强的抑菌活性；MIC（最小抑菌浓度）检测测得特戊酸依罗霉素对苏云金芽孢杆菌的MIC值达到2 μg/mL。这些良好的生物活性说明特戊酸依罗霉素具有潜在的药物开发价值，具有广泛的应用前景。
另外，本发明制备特戊酸依罗霉素的方法简单易实施，产品得率高，为特戊酸依罗霉素的药物价值的开发提供了足够的样品支持，对于依罗霉素的研发和应用推广具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例
1
拟无枝菌酸菌（
Amycolatopsis
sp.
）
YIM M13163
的分离与鉴定
1、菌株分离
（1）拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163是从我国南海海域海底沉积物中分离获得。
（2）上述分离得到菌株的成熟气生孢子成白色，基内菌丝呈橘红色。
2、菌株鉴定
提取上述分离的菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其16S rRNA，并测序分析，显示其与目前已公开的拟无枝菌酸菌菌株均不同。
同时，结合其他鉴定数据结果显示，该菌株为Amycolatopsis属的一个新菌株，将该菌株命名为Amycolatopsis sp.
YIM M13163，于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC
M 2015445，地址为中国武汉市武汉大学。
实施例
2
特戊酸依罗霉素的制备与鉴定
1、拟无枝菌酸菌YIM M13163的发酵
（1）种子培养基和发酵培养基的配方均为：可溶性淀粉 2g/L，葡萄糖 20g/L，酵母提取粉 2g/L，蛋白胨 2g/L，K2HPO4
0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO3
2g/L，25g/L海盐，NaCl
4g/L。
（2）种子的培养：
将活化的拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163接入装有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于28℃、200rpm的摇床上培养36 h，得到种子液；
装有200ml发酵培养基的1L锥形瓶中，于28℃、200rpm条件下培养9d，得到发酵培养物。
（3）规模发酵培养：
将上述锥形瓶中的50 mL种子培养液转接到装有200
mL发酵培养基的1L锥形瓶中，于28℃、200 r/min的摇床上培养8 d，获得拟无枝菌酸菌YIM M13163的发酵培养物。
2、发酵培养物的萃取
将该发酵培养物进行离心分离（4000 r/min，10 min）使发酵上清液与菌丝体分开；发酵上清液经丁酮萃取，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；菌丝体用丙酮浸泡萃取，超声处理得到丙酮浸提液，浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B。
3、特戊酸依罗霉素的提取
浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析提取馏分，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，即可得到特戊酸依罗霉素。
对于浸膏A和浸膏B，提取特戊酸依罗霉素的具体方法如下：
（1）浸膏A的提取
1）浸膏A经正相硅胶柱层析，以体积比从100：0～0：100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，其中，洗脱下来的馏分各记为：
100%氯仿梯度下洗脱下来的馏分记为A1，
氯仿-甲醇体积比为49：1梯度下洗脱下来的馏分记为A2，
氯仿-甲醇体积比为24：1梯度下洗脱下来的馏分记为A3，
氯仿-甲醇体积比为47：3梯度下洗脱下来的馏分记为A4，
氯仿-甲醇体积比为23：2梯度下洗脱下来的馏分记为A5，
氯仿-甲醇体积比为9：1梯度下洗脱下来的馏分记为A6，
氯仿-甲醇体积比为4：1梯度下洗脱下来的馏分记为A7，
氯仿-甲醇体积比为1：1梯度下洗脱下来的馏分记为A8，
100%甲醇梯度下洗脱下来的馏分记为A9。
2）将馏分A2和A3合并后以石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，其中，洗脱下来的馏分各记为：
100%石油醚梯度下洗脱下来的馏分记为D1，
石油醚-乙酸乙酯体积比9：1梯度下洗脱下来的馏分记为D2，
石油醚-乙酸乙酯体积比4：1梯度下洗脱下来的馏分记为D3，
石油醚-乙酸乙酯体积比7：3梯度下洗脱下来的馏分记为D4，
石油醚-乙酸乙酯体积比1：1梯度下洗脱下来的馏分记为D5，
石油醚-乙酸乙酯体积比1：4梯度下洗脱下来的馏分记为D6，
100%乙酸乙酯梯度下洗脱下来的馏分记为D7，
乙酸乙酯-甲醇体积比9：1梯度下洗脱下来的馏分记为D8，
乙酸乙酯-甲醇体积比4：1梯度下洗脱下来的馏分记为D9，
乙酸乙酯-甲醇体积比1：1梯度下洗脱下来的馏分记为D10，
100%甲醇梯度下洗脱下来的馏分记为D11。
3）将馏分A4，A5，A6，A7合并后以石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，其中，洗脱下来的馏分各记为：
100%石油醚梯度下洗脱下来的馏分记为F1，
石油醚-乙酸乙酯体积比4：1梯度下洗脱下来的馏分记为F2，
石油醚-乙酸乙酯体积比7：3梯度下洗脱下来的馏分记为F3，
石油醚-乙酸乙酯体积比1：1梯度下洗脱下来的馏分记为F4，
石油醚-乙酸乙酯体积比1：4梯度下洗脱下来的馏分记为F5，
100%乙酸乙酯梯度下洗脱下来的馏分记为F6，
乙酸乙酯-甲醇体积比9：1梯度下洗脱下来的馏分记为F7，
乙酸乙酯-甲醇体积比4：1梯度下洗脱下来的馏分记为F8，
乙酸乙酯-甲醇体积比1：1梯度下洗脱下来的馏分记为F9，
100%甲醇梯度下洗脱下来的馏分记为F10。
4）将上述得到的馏分D7，D8，D9，D10，D11合并，经中压反相柱得到G1，G2，G3，G4，G5，G6，G7馏分。再将G3，G4合并后经中压反相柱，得到I1，I2，I3，I4，I5，I6，I7，I8，I9，I10馏分。
将上述得到的馏分F8，F9，F10合并，经中压反相柱得到H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7，H8馏分。
（2）浸膏B的提取
1）浸膏B正相硅胶柱层析，以体积比从100：0～0：100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，其中，洗脱下来的馏分各记为：
100%氯仿梯度下洗脱下来的馏分记为B1，
氯仿-甲醇体积比为49：1梯度下洗脱下来的馏分记为B2，
氯仿-甲醇体积比为24：1梯度下洗脱下来的馏分记为B3，
氯仿-甲醇体积比为47：3梯度下洗脱下来的馏分记为B4，
氯仿-甲醇体积比为23：2梯度下洗脱下来的馏分记为B5，
氯仿-甲醇体积比为9：1梯度下洗脱下来的馏分记为B6，
氯仿-甲醇体积比为4：1梯度下洗脱下来的馏分记为B7，
氯仿-甲醇体积比为1：1梯度下洗脱下来的馏分记为B8，
100%甲醇梯度下洗脱下来的馏分B9。
2）将馏分B3，B4，B5，B6，B7，B8合并后以石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，其中，洗脱下来的馏分各记为：
100%石油梯度下醚洗脱下来的馏分记为J1，
石油醚-乙酸乙酯体积比7：3梯度下洗脱下来的馏分记为J2，
石油醚-乙酸乙酯体积比1：1梯度下洗脱下来的馏分记为J3，
石油醚-乙酸乙酯体积比1：4梯度下洗脱下来的馏分记为J4，
100%乙酸乙酯梯度下洗脱下来的馏分记为J5，
乙酸乙酯-甲醇体积比4：1梯度下洗脱下来的馏分记为J6，
乙酸乙酯-甲醇体积比1：1梯度下洗脱下来的馏分记为J7，
100%甲醇梯度下洗脱下来的馏分记为J8。
4、特戊酸依罗霉素的纯化于鉴定
（1）对上述从浸膏A和浸膏B中提取的各馏分进行高效液相分析，发现J6，J7，H6，H7，I6，I7，I8，I9馏分中含有特戊酸依罗霉素，经进一步纯化（CH3CN/H2O
60%～100%梯度洗脱30
min，流速2.5 mL/min，保留时间16.7min），得到21mg淡黄色粉末化合物。
（2）对上述纯化得到的淡黄色粉末化合物进行鉴定，（+）HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z：1145.60 [M + H]+，1167.58[M
+ Na]+，可得出该化合物的分子量为1144.60，计算分子式为C59H88N2O20。该化合物的波谱数据如下：
1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 7.55
(s，1H)，6.88
(d，J = 10.1 Hz，1H)，6.67 (t，J = 12.8 Hz，1H)，6.61 – 6.37 (m，5H)，6.10 – 6.00 (m，3H)， 6.00 – 5.93 (m，3H)， 5.73 – 5.55 (m，3H)， 5.51 – 5.41 (m，1H)， 4.91 (d，J = 7.3 Hz， 2H)， 4.72 – 4.62 (m，2H)， 4.36 – 4.27 (m，2H)， 4.26 (d，J = 5.7 Hz，2H)， 4.19 (s，2H)， 3.99 – 3.90 (m，3H)， 3.87 (dt，J = 15.5，6.3
Hz，3H)， 3.80
– 3.73 (m，3H)，3.73 – 3.66 (m，3H)， 3.61 (s，5H)，3.59 (d，J = 3.3 Hz， 1H)，3.55 (s，5H)，3.49 – 3.41 (m，11H)，3.38 (t，J = 10.7 Hz，2H)，3.34 (d，J =
6.7 Hz，3H)，3.16
(s，4H)，3.05
(t，J = 9.3 Hz，2H)， 2.85 – 2.78 (m，1H)， 2.15 (t，J =
9.7 Hz，2H)，2.00
(dd，J = 23.4，10.2 Hz，5H)， 1.73 (dd，J =
20.2，7.3 Hz，7H)，1.68 (d，J =
6.5 Hz，5H)，1.29
(d，J = 6.2 Hz，6H)，1.24 (d，J = 6.2 Hz，5H)，0.98 (s，8H)，0.93 (t，J =
7.4 Hz，5H)，0.82
(t，J = 6.5 Hz，4H)。
13C NMR
(126 MHz， MeOD) δ
178.21，177.93，142.24，136.29，133.91，131.36，131.20，130.81，130.63，129.75，128.47，128.17，126.78，104.20， 101.10，100.48，92.18，85.26，85.18，84.77，83.54，82.74，81.90，77.66，75.30，74.35，73.60，72.24，70.96，70.22，70.10，62.44，61.40，59.55，56.53，52.63，42.32，40.05，37.58，37.08，24.84，21.52，18.61，18.51，16.92，14.20，13.99，12.57，11.49。
综合高质量质谱以及核磁数据，并查阅文献进行对比，确定该化合物为特戊酸依罗霉素，其分子式为C59H88N2O20，其结构式如式（I）所示：
，
其中，R为式（II）所示：
。
另外，上述鉴定数据也与文献[Ray S. Dewey, Byron H. Arison, John Hannah, David
H. Shih and Georg Albers-Schonberg. The structure of efrotomycin[J]. J.
Antibiotics. 1985, 38(12):1691-8.]记载的一致，也证明了本发明所制备得到的化合物就是特戊酸依罗霉素。
实施例
3
特戊酸依罗霉素的抑菌活性
对本发明中的特戊酸依罗霉素的抑菌活性进行测试，结果表明，它对铜绿假单胞菌、大肠杆菌有一定的抑菌活性，而对苏云金芽孢杆菌有较强的抑菌活性。
另外，在进行MIC（最小抑菌浓度）检测时，测得特戊酸依罗霉素对苏云金芽孢杆菌的MIC值达到2 μg/mL。
这些良好的生物活性说明特戊酸依罗霉素具有潜在的药物开发价值。而且本发明制备特戊酸依罗霉素的方法简单，产量高，对于依罗霉素的研发和应用推广具有重要的意义。
Claims (10)
1.一种拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163，其特征在于，该菌株于2015年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015445。
2.权利要求1所述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163在制备特戊酸依罗霉素中的应用。
3.一种利用权利要求1所述拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，是将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163发酵得到发酵培养物，从发酵培养物中制备得到特戊酸依罗霉素。
4.根据权利要求3所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis sp.）YIM M13163进行恒温恒速液态发酵，得到发酵培养物；将该发酵培养物的发酵上清液与菌丝体分开；
S2.用丁酮萃取发酵上清液，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；
S3.用丙酮浸泡萃取菌丝体，超声处理得到丙酮浸提液，浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B；
S4.浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析提取馏分，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。
5.根据权利要求4所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养30～40h后，按照2～5v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于25～30℃、180～220 rpm条件下恒温恒速培养9 d，得到发酵培养物；
其中，所述种子培养基和发酵培养基的配方均为：可溶性淀粉2g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取粉2g/L，蛋白胨2g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO3 2g/L，25g/L海盐，NaCl 4g/L。
6.根据权利要求5所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，步骤S1所述发酵培养物的制备方法如下：将活化的拟无枝菌酸菌YIM M13163接入种子培养基中，于28℃、200 rpm条件下培养36 h后，按照4v/v%的接种量，转接到发酵培养基，于28℃、200 rpm条件下培养8d，得到发酵培养物。
7.根据权利要求4所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，步骤S1所述发酵培养物4000 r/min离心10 min得到发酵上清液和菌丝体；步骤S2所用丁酮与发酵上清液的体积比为1：1，反复萃取3次；步骤S3所用丙酮与菌丝体的体积比为1：1，反复萃取3次。
8.根据权利要求4所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，步骤S4所述浸膏A和/或浸膏B经正相硅胶柱层析，以体积比100：1～1：100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的馏分合并后，再以甲醇或体积比10：1～1：10的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的馏分合并后，进行中压反相柱层析，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。
9.根据权利要求8所述制备特戊酸依罗霉素的方法，其特征在于，浸膏A经正相硅胶柱层析，以体积比4～49：1的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，再以甲醇或体积比1～9：1的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，进行中压反相柱层析，得到的各馏分随机合并后，再进行中压反相柱层析，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素；
浸膏B经正相硅胶柱层析，以体积比4～12：1的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱，得到的各馏分随机合并后，再以体积比1～4：1的乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，得到的各馏分进行高效液相分析，对含有特戊酸依罗霉素的馏分进一步纯化，得到特戊酸依罗霉素。
10.根据权利要求3～9任一所述制备方法制备得到的特戊酸依罗霉素，其特征在于，其分子式为C59H88N2O20，其结构式如式（I）所示：
，
其中，R为式（II）所示：
。
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