CN102807955B

CN102807955B - 一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法及其专用菌株

Info

Publication number: CN102807955B
Application number: CN 201110453153
Authority: CN
Inventors: 车永胜; 李彦
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2031-12-30
Also published as: CN102807955A

Abstract

本发明公开了一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法及其专用菌株。该菌株为矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059，其保藏编号为CGMCC No.5526。本发明的菌株矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059具有产生抗肿瘤化合物Rasfonin的功能。本发明制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法，收率高(8.0g粗提物经过分离纯化而得到200mg纯化合物Rasfonin，其纯度为99％以上，收率为2.5％)，而且本发明方法操作简单、成本低廉、省时省力。

Description

一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法及其专用菌株

技术领域

本发明涉及一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法及其专用菌株。

背景技术

恶性肿瘤又称为癌症，是威胁人类健康生存的重大恶性疾病。世界卫生组织在第18届国际抗癌联盟大会上的报告表明，今后20年新发肿瘤患者人数将由目前每年1000万增加到1500万，每年由恶性肿瘤而死亡的人数也将由600万增加至1000万，占世界死亡总数的12％。癌症正在成为新世纪人类的第一大杀手。

经过各国科学家们40多年的努力，新的抗肿瘤药物不断出现，肿瘤的化学药物治疗出现飞速的发展，患者生命明显延长，生活质量得到明显改善，特别是对白血病、淋巴瘤等的治疗有了突破性进展。但对危害人类健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的恶性肿瘤如宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肝癌及胰腺癌等还缺乏有效治疗药物。此外，抗肿瘤药物的高昂价格、临床治疗中产生的耐药性及给患者带来的毒副作用等都表明，人类迫切需要研究与开发新型、高效的抗癌药物。

2000年，由来自日本千叶大学和东京大学的研究者们分别从真菌Taleromyces sp.3656-A1[参见，Journal of Antibiotics(抗生素杂志).2000，53，848-850]和真菌Trichurus terrophilus[参见，120th Annual Meeting ofthe Pharmaceutical Society of Japan(第120届日本药学学会年会).Gifu，March 2000，p.68.]的固体发酵提取物中分离到一个具有显著肿瘤和免疫抑制活性的化合物，命名为Rasfonin。据报道，Rasfonin对癌基因ras诱导的肿瘤细胞株有显著的抑制活性(IC₅₀为0.16μg/mL)[参见，Journal of Antibiotics(抗生素杂志).2000，53，848-850]，并分别对刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖有显著的免疫抑制活性(IC₅₀分别为0.7和0.5μg/mL)[参见，Chemical &Pharmaceutical Bulletin(生物学与药学通报).2005，53，923-929]，由此可见，化合物Rasfonin具有潜在抗癌作用，但是由于从自然资源中获得足够量的Rasfonin十分困难，所以，在很长一段时间内一直没有人能成功研究和开发该化合物。直到2005和2006年，Rasfonin才分别被日本的Ishibashi研究组[参见，Tetrahedron(四面体杂志).2005，61，1827-1833]和美国的Boeckman研究组[参见，Journal of the AmericanChemical Society(美国化学会会志).2005，128，11032-11033]全合成，但合成方法非常复杂，包含了复杂的有机反应，反应步骤分别是23步和16步，产量非常微小，无法进一步进行抗癌机理的深入研究。因此，开发能够大量制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法，是研究其抗癌机理和评价其能否成为新抗癌药物的首要条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株矛束霉(Doratomyces sp.)。

本发明所提供的真菌为矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059，其保藏编号为CGMCC No.5526。

该菌株已于2011年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.5526，分类命名为矛束霉(Doratomyces sp.)，菌株名称为XZ059。

本发明的另一个目的是提供一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法。

本发明所提供的制备Rasfonin的方法，包括如下步骤：

a)将Doratomyces sp.进行固体(稻米)发酵，得到发酵培养物；

b)向所述发酵培养产物中加入乙酸乙酯进行提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物；

c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析分离而得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到化合物Rasfonin。

所述Rasfonin的化学式如式I所示：

(式I)。

上述过程中，所述发酵中使用的培养基是稻米。

上述过程中，所述发酵的条件为：温度为25℃，静置培养，时间为40d。

上述过程中，在所述发酵后，包括如下提取步骤：用不溶于水的且在25℃是液态的有机溶剂对所述含有Rasfonin的发酵培养产物进行浸泡提取三次，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物8.0g。

上述不溶于水的且在25℃是液态的有机溶剂为乙酸乙酯。

上述过程中，在得到粗提物后，将粗提物用正己烷-二氯甲烷-甲醇体系进行减压硅胶柱层析，所用流动相为：正己烷∶二氯甲烷(v/v)＝100∶0，99∶1，97∶3，95∶5，92∶8，90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100；二氯甲烷∶甲醇(v/v)＝200∶1，100∶1，100∶1.5，100∶2，100∶2.5，100∶3，100∶4，100∶5，0∶100；共计26个梯度，每个梯度的洗脱体积均为400mL，将每个梯度的洗脱液减压蒸馏，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成26个组分，在活性跟踪[测试26个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性]指导下，发现在二氯甲烷∶甲醇＝100∶2.5(v/v)作为流动相洗脱得到的组分有抑制活性，收集活性组分(400mg)。

所述用减压硅胶柱分离纯化中，所用的填料为薄层层析硅胶H；

所述减压硅胶柱的大小为高40cm和直径6cm；

所述减压硅胶柱中装125g硅胶。

上述过程中，在所述用减压硅胶柱分离纯化后，包括高效液相色谱分离的步骤；所述高效液相色谱分离条件是：采用Agilent 1260型半制备高压液相色谱仪，Agilent C₁₈反相半制备色谱柱(5μm、9.4x 250mm)，流速2.0mL/min，用甲醇和水作为流动相，以甲醇与水的体积比为75∶25的混合溶液进行等度洗脱，洗脱时间为25min，收集保留时间为17.45min的洗脱峰，得到抗肿瘤化合物Rasfonin共200mg。

上述过程中，所述用减压硅胶柱分离纯化中，是将所述含有Rasfonin的发酵培养产物的乙酸乙酯粗提物进行分离纯化；

所述高效液相色谱分离中，是将所述用二氯甲烷和甲醇的体积比为100∶2.5的混合溶液洗脱下来的溶液浓缩组分进行分离。

本发明的菌株矛束霉(Doratomyces sp.)CGMCC No.5526具有产生抗肿瘤活性化合物Rasfonin的功能。本发明制备抗肿瘤活性化合物Rasfonin的方法，收率高(8.0g粗提物经过分离纯化而得到200mg纯化合物Rasfonin，其纯度为99％以上，收率为2.5％)，而且本发明方法操作简单、成本低廉、省时省力。

附图说明

图1为Rasfonin的制备高效液相图。

图2为纯化后Rasfonin的分析高效液相图。

图3为Rasfonin的核磁共振氢谱图。

图4为Rasfonin的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、菌株的分离及鉴定

一、菌株的分离

分离方法：取西藏昌都地区丁青县卡马多乡土壤样品，将保存的土样进行充分混合后，称取10g(如果土壤潮湿或含水量过大，取15～20g；放置一个月以上的土样可视具体情况酌情取样18～25g)，加入盛有90mL灭菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上110～130转/分，振荡20～25min，使土壤颗粒均匀分散于蒸馏水中，得到稀释倍数为10的土壤悬浮液；从中吸取1mL，置入装有9mL灭菌水的试管中，得到稀释倍数为100的悬浮液。灭菌的1/4PDA培养基(Potato DextroseAgar Medium，马铃薯葡萄糖琼脂培养基)在冷却到60℃左右时，加入链霉素100μg/mL，氯霉素100μg/mL，倒入培养皿凝固降温后，将得到的稀释倍数为100的土壤悬浮液充分摇匀，吸取0.1mL，滴入培养皿，用灭菌的涂棒将其均匀涂抹后，将该培养皿倒置，分别放于4℃，10℃和20℃生化培养箱内培养，7～30天后，体视镜下观察。挑单个孢子或者菌落到PDA培养基上，纯化后，保存菌种。

最后分离得到一株真菌菌株，将该菌株命名为XZ059。

二、菌株的鉴定

(一)形态

方法：将菌株接种到PDA平板上，20℃条件下黑暗培养10天，测量菌落直径并记录菌落颜色。从平板上切下5mm的方形带菌培养基块，置于灭菌载玻片上，加盖玻片，在50mL离心管或培养皿中培养一周，取下盖玻片制普通玻片进行观察。

结果：PDA培养基上菌落平展，20℃黑暗条件下10天菌落直径15～30mm，起初白色，后橄榄褐色，肉眼可见直立的孢梗束。菌丝体表生，部分埋生，菌丝褐色，光滑，具隔膜，宽1.5～3μm，孢梗束高400～800μm，柄部由分生孢子梗紧密排列在一起构成，多隔膜，光滑，暗褐色，宽10～16μm，环痕梗单生或更多情况下轮生，长6～12μm，基部宽2.5～4.0μm，至端部环痕带骤窄，宽2～3μm，无色，光滑。环痕孢子卵形，光滑，淡棕色，端部钝圆，基部平截，常聚集在一起呈暗褐色，6.0～7.5×4.0～5.0μm。

(二)rDNA-ITS序列

方法：真菌总DNA提取步骤：PDA平板培养5天菌落用解剖刀刮取菌丝，置1.5mL离心管中，加200μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液、少量石英砂和PVP，用玻棒研磨，然后再加入400μL CTAB，65℃水浴1h，12000rpm离心10min，取上清，饱和酚和氯仿异戊醇分别抽提，最后用异丙醇沉淀，12000rpm离心，去上清，晾干。最后，复溶于50μL ddH₂O中备用。

PCR扩增：

通用引物

ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’(SEQ ID NO：1)

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(SEQ ID NO：2)

扩增体系(25μl体系)：

纯水15μL；Buffer 2.5μL；Mg ²⁺1.5μL；dNTP 1μL；引物各1μL；DNA聚合酶2μL(2U)；模板1μL。

扩增程序：95℃ 3min，

94℃ 1min，

54℃ 40s，

72℃ 1min，

30个循环后，在72℃保持10min。

仪器：050-801TGradient 96型PCR仪。

测序：北京诺赛基因组研究中心有限公司。

测序仪：ABI 3730xl型测序仪。

测序引物：ITS1。

结果：得到标志序列如SEQ ID NO：3序列所示，包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S区序列片断。通过与genbankDNA序列数据库比对后，确定该真菌为矛束霉(Doratomyces sp.)。

SEQ ID NO：3：

CGCGTTGTCTCGGCGGGAGGCGGTGGGCGTCGCGCGCCCTAGCGGGCCGTGCCGCTCCCGTCCCCGCCGGCGGCGCCAAACTCTAAATTTACAGCGGACTGTATGTTCTGATTTACAAAAAAAACAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAAC GCAGC GAAATGC GATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAACCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGGCAGTAATCTGCCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTACCCTCGAGCGAGTCCAGCATCTAGGTGCTGGGCCCGCCCGGCGTTGGAGCACTACGGGAAGCCCTGTGCTGTCCCCCGTAGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGTCCTGCCGCGGCGCCCCCTGCGTAGTATAACAGCTCGCTTCGGGACCCGGTGGAGGCCTGCCGTCAAACCTTACTCTCTAAGTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG

证明本发明菌株属于矛束霉(Doratomyces sp.)。

该菌株XZ059已于2011年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5526，分类命名为矛束霉(Doratomyces sp.)。

实施例2：化合物Rasfonin的制备

一、菌发酵

1、菌活化

挑取实施例1获得的矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059(保藏编号CGMCC No.5526)菌丝体接种于PDA平板上，25℃培养5天；

PDA培养基的组成：由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和蒸馏水1L组成，121℃高压蒸汽灭菌30min，制成PDA平板。

2、种子培养

方法：待菌长满平板后，将5个1cm²大小的菌块连同培养基接种到含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中并在摇床上培养5天(培养温度：25℃；转速：200rpm)后作为种子培养液。得到的种子培养液中孢子的浓度为10⁶个/mL。

种子培养基的配方：葡萄糖4g、麦芽提取物10g、酵母提取物4g、蒸馏水1L，灭菌前将pH调节到6.5。

每个250mL三角瓶中加入50mL培养基并在121℃灭菌30min。

麦芽提取物和酵母提取物购自英国Oxoid公司。

3、发酵

将80g稻米和120mL纯净水加入500mL三角瓶中，共12瓶约1公斤稻米，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却待用；将步骤2中制备好的种子培养液5mL接种于稻米培养基上，在25℃无菌培养间培养40天。

二、Rasfonin的提取与分离

1、粗提

将步骤一中得到的发酵培养产物用器械捣碎，将2.4L乙酸乙酯加入500mL三角瓶中(共12瓶，每瓶200mL)，静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液I，将残渣记作残渣I；

将2.4L乙酸乙酯加入到残渣I中(共12瓶，每瓶200mL)，静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液II，将残渣记作残渣II；

将2.4L乙酸乙酯加入到残渣II中(共12瓶，每瓶200mL)，静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液III，将残渣记作残渣III；

合并粗提液I、粗提液II和粗提液III，记作Rasfonin粗提液。

将Rasfonin粗提液减压蒸馏至干燥，得到8.0g的Rasfonin粗提物；

2、用减压硅胶柱进行分离纯化

减压硅胶柱(40cm×直径6cm)购自新维尔玻璃仪器公司；所用的硅胶为薄层层析硅胶H，购自青岛海洋化工有限公司。每个柱子中装125g硅胶。

将前述步骤1中得到的Rasfonin粗提物装入减压层析硅胶柱，用正己烷-二氯甲烷-甲醇体系进行减压硅胶柱层析，所用流动相为：正己烷∶二氯甲烷(v/v)＝100∶0，99∶1，97∶3，95∶5，92∶8，90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100；二氯甲烷∶甲醇(v/v)＝200∶1，100∶1，100∶1.5，100∶2，100∶2.5，100∶3，100∶4，100∶5，0∶100；共计26个梯度，每个梯度的洗脱体积均为400mL，将每个梯度的洗脱液减压蒸馏，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成26个组分，在活性跟踪[测试26个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性]指导下，发现在二氯甲烷∶甲醇＝100∶2.5(v/v)作为流动相洗脱得到的组分有抑制活性，收集活性组分(400mg)。

3、HPLC制备

仪器：Agilent 1260型半制备高压液相色谱仪。

色谱柱为Agilent C₁₈反相半制备色谱柱(5μm；9.4×250mm)，填充介质为C18键合硅胶，粒径5μm；柱温25℃。

进样：手动进样，进样量10μL(400mg活性组分溶于600μL丙酮溶剂中，混匀)。

流动相的组成为：流动相为甲醇和水的混合溶液；流速为2.0mL/min；以甲醇与水的体积比为75∶25的混合溶液洗脱液，进行线性等度洗脱，等度洗脱时间为25min。

检测器为多波长紫外检测器。

收集保留时间为17.45min的洗脱峰，得到Rasfonin，并记录峰面积值。

结果如图1所示，制备得到200mg抗肿瘤化合物Rasfonin。

4、纯度检测

将步骤3中得到的化合物Rasfonin进行HPLC分析，检测纯度。

方法：应用Agilent 1260型半制备高压液相色谱仪进行检测。

色谱柱为Agilent C₁₈反相分析色谱柱(3.5μm；100×4.6mm)，填充介质为C18键合硅胶，粒径3.5μm；柱温25℃；

手动进样，进样量5μL；

流动相的组成为：甲醇和水的混合溶液；流速为1.0mL/min。

梯度洗脱步骤如下：

结论：结果如图2所示，表明本发明中的活性化合物Rasfonin纯度高，可达99％。

三、Rasfonin的确认

将上述方法制备的Rasfonin进行红外光谱和核磁共振谱分析。

红外光谱实验中测试仪器型号为Nicolet Magna-IR 750(北京大学分析测试中心)；

核磁共振谱实验方法中测试仪器型号为Varian Mercury-400(中国医学科学院药物研究所)。

本发明制备的Rasfonin的物化常数、氢谱和碳谱数据分别见表1和2，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别见图3和图4。

表1.化合物Rasfonin的物化常数

表2.化合物Rasfonin的氢谱(¹H-NMR)和碳谱(¹³C-NMR)数据

^a在400MH以CDCl₃为溶剂测试。

^b在100MHz以CDCl₃为溶剂测试。

制备得到的Rasfonin的化学式如式I所示。

式I

将该化合物与文献“Journal of Antibiotics(抗生素杂志).2000，53，848-850”中所报道的数据相比，证实得到的产物是Rasfonin。

综上，8.0g粗提物经过分离纯化而得到200mg纯抗肿瘤活性化合物Rasfonin，其纯度为99％，收率为2.5％。

Claims

1.矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059，其保藏编号为CGMCC No.5526。

2.一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法，包括如下步骤：

a)将权利要求1所述的矛束霉(Doratomyces sp.)XZ059进行固体发酵，得到发酵培养物；

c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析分离而得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到化合物Rasfonin，

所述Rasfonin的化学式如式Ⅰ所示：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵中使用的培养基是稻米；

所述发酵的条件为：温度为25°C，静置培养，时间为40d。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵后，包括如下提取步骤：用不溶于水的且在25°C是液态的有机溶剂对含有Rasfonin的发酵培养产物进行浸泡提取三次，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物8.0g；

所述不溶于水的且在25℃是液态的有机溶剂为乙酸乙酯。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述得到粗提物后，将粗提物用正己烷-二氯甲烷-甲醇体系进行减压硅胶柱层析,所用流动相为：正己烷:二氯甲烷（v/v）=100:0,99:1,97:3,95:5,92:8,90:10,85:15,80:20,75:25,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,10:90,0:100；二氯甲烷:甲醇（v/v）=200:1,100:1,100:1.5,100:2,100:2.5,100:3,100:4,100:5,0:100；共计26个梯度，每个梯度的洗脱体积均为400mL，将每个梯度的洗脱液减压蒸馏，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成26个组分，在活性跟踪指导下，发现在二氯甲烷:甲醇=100:2.5（v/v）作为流动相洗脱得到的组分有抑制活性，收集活性组分；

减压硅胶柱分离纯化中，所用的填料为薄层层析硅胶H；

所述减压硅胶柱的大小为高40cm和直径6cm；

所述减压硅胶柱中装125g硅胶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的活性跟踪是测试26个组分对乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞A549的抑制活性。

7.根据权利要求2或3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在用减压硅胶柱分离纯化后，包括高效液相色谱分离的步骤；所述高效液相色谱分离条件是：采用Agilent1260型半制备高压液相色谱仪，Agilent C₁₈反相半制备色谱柱，流速2.0mL/min，用甲醇和水作为流动相，以甲醇与水的体积比为75：25的混合溶液进行等度洗脱，洗脱时间为25min，收集保留时间为17.45min的洗脱峰，得到抗肿瘤化合物Rasfonin共200mg。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的Agilent C₁₈反相半制备色谱柱的尺寸为5μm、9.4x250mm。

9.根据权利要求2或3中任一所述的方法，其特征在于：减压硅胶柱分离纯化中，是将含有Rasfonin的发酵培养产物的乙酸乙酯粗提物进行分离纯化；

所述高效液相色谱分离中，是将用二氯甲烷和甲醇的体积比为100：2.5的混合溶液洗脱下来的溶液浓缩组分进行分离。