CN112391430B - 一种用于生产平阳霉素的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种用于生产平阳霉素的发酵培养基及发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于生产平阳霉素的发酵培养基及发酵方法。其包括以下组分：氮源、碳源、无机盐、微量元素和水；所述氮源占所述发酵培养基的质量分数为3.55％‑9.25％；所述氮源包括冷榨黄豆饼粉，以及植物药；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种；所述植物药占所述发酵培养基的质量分数为0.1％‑1.5％。本发明发酵培养基中碳、氮源为农副产品，价格低廉，化学性质稳定，来源广泛，运输和储存方便，发酵过程中无有毒害物质残留，提高平阳霉素产量，缩短发酵周期，适用于工业化生产。

Description

一种用于生产平阳霉素的发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种用于生产平阳霉素的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
平阳霉素是指从我国浙江平阳县土壤中的放线菌培养液中分离得到的抗肿瘤抗生素。可用于治疗头颈部鳞癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌、食管癌及鼻咽癌等，亦可用于其他处如肺、子宫颈及皮肤的鳞癌。
有相关研究表明，植物药中含有丰富的纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等物质，利用植物药提取物进行药用菌株的深层发酵生产，药用菌株具有分解纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等物质的强大酶系，可对培养基质进行分解利用。但植物药提取物中成分复杂而且多变，不同植物药种类和添加量对药用菌株的生长及代谢产物的合成影响各异，部分植物药可促进药用菌株生长及代谢产物，部分菌株则起抑制作用。另外，植物药的提取操作复杂，生产成本高，不利于工业化生产。
因此，寻找可以提高平阳霉素产量，来源广泛、价格低廉的植物药，降低成本对于本领域来说是迫切解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服采用现有技术中生产平阳霉素的发酵工艺制得的平阳霉素的产率低，采用植物药提取液作为添加剂的发酵培养基制备方法复杂等缺陷，提供一种用于生产平阳霉素的发酵培养基及发酵方法，所述发酵培养基中碳、氮源为农副产品，价格低廉，化学性质稳定，来源广泛，运输和储存方便，发酵过程中无有毒害物质残留，提高平阳霉素产量，缩短发酵周期，适用于工业化生产。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种用于生产平阳霉素的发酵培养基，其包括以下组分：氮源、碳源、无机盐、微量元素和水；
所述氮源占所述发酵培养基的质量分数为3.55％-9.25％；所述氮源包括冷榨黄豆饼粉，以及植物药；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种；所述植物药占所述发酵培养基的质量分数为0.1％-1.5％。
所述氮源占所述发酵培养基的质量分数较佳地为4.55％-7.05％，例如4.65％、4.85％、5.35％或5.95％。
所述冷榨黄豆饼粉占所述发酵培养基的质量分数可为2.5％-4.5％，较佳地为3.5％。若将本发明中的所述冷榨黄豆饼粉替换为热榨黄豆饼粉或中温黄豆饼粉，则效果不理想，会降低平阳霉素的产量。
所述植物药占所述发酵培养基的质量分数较佳地为0.2％-0.9％，例如0.3％、0.4％或者0.5％。
所述植物药可为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶或薏米。
较佳地，所述氮源还可包括玉米浆和/或榴花酵母粉。
所述玉米浆占所述发酵培养基的质量分数可为0.75％-1.75％。所述榴花酵母粉占所述发酵培养基的质量分数可为0.2％-1.5％。
较佳地，所述碳源可为本领域常规，较佳地包括葡萄糖和/或α-淀粉酶液化淀粉。
所述葡萄糖占所述发酵培养基的质量分数可为0.5％-1.5％。所述α-淀粉酶液化淀粉占所述发酵培养基的质量分数可为4％-7％，较佳地为6％。
所述无机盐可为本领域常规，较佳地包括NaNO3和/或KH2PO4。
所述无机盐占所述发酵培养基的质量分数可为0.05％-0.45％。其中，所述NaNO3占所述发酵培养基的质量分数可为0.1％-0.3％，较佳地为0.2％。所述KH2PO4占所述发酵培养基的质量分数可为0.05％-0.15％，较佳地为0.1％。
所述微量元素可为本领域常规，较佳地包括ZnSO4·7H2O和/或CuSO4·5H2O。
所述微量元素占所述发酵培养基的质量分数可为0.005％-0.09％。其中，所述ZnSO4·7H2O占所述发酵培养基的质量分数可为0.025％-0.075％，较佳地为0.05％。所述CuSO4·5H2O占所述发酵培养基的质量分数可为0.005％-0.015％，较佳地为0.01％。
较佳地，所述发酵培养基还进一步包括铵盐。所述铵盐可为本领域常规，较佳地为硝酸铵。
所述铵盐占所述发酵培养基的质量分数可为0.02％-0.08％，较佳地为0.05％。
本发明所述发酵培养基中，各组分的质量分数总和为100％，所述水的用量以补足各组分质量分数之和为100％计。
本发明中，所述发酵培养基的pH可为6.0-7.0，较佳地为6.5。
本发明一优选实施方案中，所述的发酵培养基，其包括以下组分：植物药0.9％、玉米浆0.75％、冷榨黄豆饼粉3.5％、榴花酵母粉0.2％、葡萄糖0.5％、α-淀粉酶液化淀粉6％、NaNO3 0.2％、KH2PO4 0.1％、ZnSO4·7H2O 0.05％和CuSO4·5H2O 0.01％，余量为水，上述百分比为各组分占所述发酵培养基的质量分数；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种；所述发酵培养基的pH为6.5。
本发明还提供一种生产平阳霉素的摇瓶发酵方法，其包括下述步骤：
(1)将轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensis n.sp)的种子液接种于如上所述发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得到发酵液1；
(2)从所述发酵液1中分离出所述平阳霉素。
本发明还提供一种生产平阳霉素的罐发酵方法，其包括下述步骤：
(1)将轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensis n.sp)的种子液接种于如上所述发酵培养基中进行罐发酵培养，在所述罐发酵培养的第24h时开始添加发酵罐补料，所述发酵罐补料的添加周期为10h-12h，所述发酵罐补料的添加次数为6-12次，所述发酵罐补料的每次添加量相对于所述发酵培养基的质量分数为1％-1.6％，得发酵液2；
(2)从所述发酵液2中分离出所述平阳霉素。
较佳地，所述发酵罐补料，其包括以下组分：植物药9％-30％、玉米浆3.5％-10％、冷榨黄豆饼粉2％-5％、榴花酵母粉1％-3％、KH2PO4 0.05％-0.15％、ZnSO4·7H2O0.025％-0.075％、CuSO4·5H2O 0.005％-0.015％和NaNO3 0.1％-0.3％，余量为水，上述百分比为各组分相对于所述发酵罐补料的质量分数；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种。
所述发酵罐补料的pH可为6.0-7.0，较佳地为6.5。
所述发酵罐补料中，所述植物药占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为9.38％-28.13％，更佳地为18.75％。
所述发酵罐补料中，所述玉米浆占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为7％。
所述发酵罐补料中，所述冷榨黄豆饼粉占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为3.5％。
所述发酵罐补料中，所述榴花酵母粉占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为2.1％。
所述发酵罐补料中，所述KH2PO4占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为0.1％。
所述发酵罐补料中，所述ZnSO4·7H2O占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为0.05％。
所述发酵罐补料中，所述CuSO4·5H2O占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为0.01％。
所述发酵罐补料中，所述NaNO3占所述发酵罐补料的质量分数较佳地为0.2％。
所述发酵罐补料较佳地包括：宁夏枸杞嫩叶18.75％、玉米浆7％、冷榨黄豆饼粉3.5％、榴花酵母粉2.1％、KH2PO4 0.1％、ZnSO4·7H2O 0.05％、CuSO4.5H2O 0.01％和NaNO30.2％，余量为水，上述百分比为各组分相对于所述发酵罐补料的质量分数。
本发明中，所述轮枝链霉菌平阳变种可以是现有的各种产平阳霉素的轮枝链霉菌平阳变种，较佳地为轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensis n.sp)，所述轮枝链霉菌平阳变种的编号为CPCC 200554。
需注意：本发明中在术语之后的数字“1”或者“2”，例如发酵液1和发酵液2中的“1”和“2”并无实际意义，仅为区分相同的术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种有利于轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensis n.sp)高效发酵生产平阳霉菌的发酵培养基及发酵方法。本发明通过添加植物药宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种作为发酵原材料，能够有效促进发酵产量的提高，也缩短发酵周期。同时，本发明发酵培养基中碳源、氮源主要选取一些农副产品，价格低廉，适用于工业化生产，且化学性质稳定，来源丰富，运输和储存方便。农副产品的使用使发酵液中无有毒害物质残留，能够达到降低污染，提高发酵产量，降低成本的目的，为后期发酵液的处理提供了有利的条件。
附图说明
图1为实施例10和对照组进行罐发酵实验时，平阳霉素产量的对照图。
图2为实施例10-12进行罐发酵实验时，平阳霉素产量的对照图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
一、实验材料
1、仪器
本发明实施例1-14和对比例1-5所用仪器设备见表1。
表1
Figure BDA0002166896290000061
2、试剂
以下实施例1-14和对比例1-5中试剂的规格和生产厂家请见表2。
表2
Figure BDA0002166896290000062
Figure BDA0002166896290000071
3、菌种
本发明采用的菌种为轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensisn.sp)，购买于中国药学微生物菌种保藏管理中心(CPCC)，菌种编号CPCC 200554。
4、培养基
斜面培养基：可溶性淀粉2％，KNO3 0.1％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，NaCl 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，玉米浆0.05％，琼脂2％和余量的水，pH为7.4～7.6，121℃灭菌20分钟，上述百分比为各组分相对于斜面培养基的质量分数。
种子培养基：玉米浆3％，黄豆饼粉2％，榴花酵母粉0.2％，葡萄糖1％，麦芽糊精1％，KH2PO4 0.1％，ZnSO4·7H2O 0.05％，CuSO4.5H2O 0.01％和余量的水；pH为6.5，121℃灭菌20分钟，上述百分比为各组分相对于种子培养基的质量分数。
二、方法
1、培养方法
本发明包含以下过程：
灭菌条件：121℃，20min。
在无菌条件下，用已灭菌的接种针将保存有轮枝链霉菌平阳变种的冻干管中接种到装有斜面培养基的茄子瓶中培养，将接种菌种的斜面置于29℃恒温培养箱中，斜面培养第2天，表面见浅白色菌体，斜面培养第3-4天，颜色加深，并看到少量白色孢子生成，继续培养7天可以看到培养基表面产生大量白色孢子，培养基基体本身由于轮枝链霉菌平阳变种色素的产生变成姜黄色。此斜面可进行传代或者接种使用。
根据种子培养基配方配制种子培养基，无菌条件下，用灭菌接种铲轻轻划破长有孢子的斜面培养基，取尽量薄(厚度约为1mm)的0.8cm×1.5cm左右长满孢子的斜面培养基，接种到装有25mL已经灭菌的种子培养基的摇瓶中，摇床培养温度为29℃，在转速为240rpm的摇床上培养28h，摇瓶中培养物颜色由深棕色变成黄色浑浊物，摇之，有流动感，粘度较大，贴壁均匀滑下。显微镜镜检菌丝成团状，向四周发散，菌丝较长，无杂菌，种子培养基的pH为7.0。
摇瓶发酵方法：将培养好的摇瓶中种子接种到已经灭菌的发酵培养基中，接种量为3mL/35mL，摇床培养温度为29℃，在转速为240rpm摇床上培养8-9天，得发酵液1。发酵摇瓶在24h左右发酵培养基变稠，颜色加深，3-4天摇瓶上壁出现一层白色孢子层，8-9天摇瓶粘度并未下降，显微镜镜检发现菌丝断裂较多，菌丝体内产生密集空泡，菌丝细弱，说明进入次级代谢后期，发酵培养基pH为7.0～8.0。
罐发酵方法：将培养好的种子接种到已经灭菌的发酵培养基中进行罐发酵培养，接种量为40％，罐发酵培养的温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，在摇床上培养0-4h的转速为250r/min，4-6h的转速为300r/min，6-8h的转速为350r/min，8h之后的转速为375r/min，发酵周期为168h，得发酵液2。在所述罐发酵培养的第24h时开始添加发酵罐补料，所述发酵罐补料的添加周期为12h，所述发酵罐补料的添加次数为6次，所述发酵罐补料的每次添加量相对于所述发酵培养基的质量分数为1.6％。
2、检测方法
发酵液经12000rpm离心，取上清，根据上清液与甲醇的体积比为1：3的比例添加甲醇用于沉淀蛋白杂质，12000rpm离心，取上清，高效液相色谱(HPLC)测发酵单位。
具体如下：
仪器：Agilent 1200一体化液相色谱仪
分析柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)
液相条件：柱温为40℃；检测波长254nm；进样量为20μL；进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的冲洗程序请见表3。
流动相A：己烷磺酸钠7.53g/L，EDTA二钠3.72g/L，乙酸0.08mol/L，用纯氨水调pH至4.3；流动相B：甲醇与乙腈的体积比为70:30；流速为1.0mL/min。
表3冲洗程序
Figure BDA0002166896290000091
Figure BDA0002166896290000101
若没有特殊说明，以下实施例中涉及的百分比“％”均为某特定组分的质量占培养基总质量的百分比。
实施例1-9
实施例1-9采用上述的摇瓶发酵方法，发酵培养基的组分和含量见表4。
表4
Figure BDA0002166896290000102
Figure BDA0002166896290000111
实施例10-14
实施例10-14采用上述的罐发酵方法，其中，发酵培养基的组分和含量同实施例7，发酵罐补料的组分和含量见表5。
表5
Figure BDA0002166896290000112
对比例1-5
对比例1-5采用上述的摇瓶发酵方法，其中，发酵培养基的组分和含量请见表6。
表6
Figure BDA0002166896290000113
Figure BDA0002166896290000121
效果实施例1
实施例1-9和对比例1-5探索采用上述摇瓶发酵方法时，发酵培养基中组分种类和含量对平阳霉素产量的影响。实施例10-14探索采用上述罐发酵方法时，发酵罐补料中各组分的种类和含量对平阳霉素产量的影响，并采用上述检测方法，利用高效液相色谱测试发酵120h时平阳霉素的产量，结果见表7。
表7
Figure BDA0002166896290000122
Figure BDA0002166896290000131
上述实施例2、3、9和对比例1-3探索了植物药的种类对平阳霉素产量的影响，从结果可看出，采用摇瓶发酵方法，当发酵培养基中添加有宁夏枸杞嫩叶、宁夏枸杞或薏米时，平阳霉素的产生量显著高于发酵培养基中不添加有植物药的对比例5。可见，发酵培养基中添加宁夏枸杞嫩叶、宁夏枸杞或薏米对平阳霉素的产生均具有促进作用。但发酵培养基中添加有黑枸杞、红花或宁夏枸杞嫩叶芽茶时，平阳霉素产量低于对比例5，可见，并非所有植物药对平阳霉素的产量均具有促进作用。
其中，实施例7可看出，当宁夏枸杞嫩叶占发酵培养基的质量分数为0.9％时，平阳霉素产量最高，可达到21.3μg/mL。
对比例4进一步探索了宁夏枸杞嫩叶添加量的上限，当宁夏枸杞嫩叶的浓度高于本申请限定范围时，添加宁夏枸杞嫩叶反而抑制平阳霉素的生成。
效果实施例2
设置对照组，对照组将实施例10发酵罐补料中添加的9.38％宁夏枸杞嫩叶替换为相同含量的水，发酵罐补料中其他组分同实施例10。通过实施例10和对照组探索采用罐发酵培养方法时，发酵罐补料中添加宁夏枸杞嫩叶对发酵周期和平阳霉素产量的影响。采用上述检测方法，利用高效液相色谱测发酵单位，结果见图1。
图1可看出，当发酵罐补料中添加宁夏枸杞嫩叶，在发酵120h时，其最高发酵单位可达28.7μg/mL，而对照组120h时的发酵单位为13.4μg/mL，其较对照组产量提高114.2％；从发酵周期角度看，其发酵周期可缩短至120h。发酵罐补料中宁夏枸杞嫩叶的添加对平阳霉素产量的提高效果明显。
效果实施例3
实施例10-12以宁夏枸杞嫩叶为添加物质，探究发酵罐补料中不同含量的宁夏枸杞嫩叶对平阳霉素产量的影响。实施例10-12的所述发酵罐补料中，所述宁夏枸杞嫩叶相对于所述发酵罐补料的质量分数分别为9.38％、18.75％和28.13％，所述发酵罐补料中宁夏枸杞嫩叶的总添加量相对于所述发酵培养基的质量分数分别为0.9％、1.8％和2.7％。并采用上述检测方法，利用高效液相色谱测发酵单位，结果见图2。
图2所示，发酵罐补料中的宁夏枸杞嫩叶的总添加量相对于所述发酵培养基的质量分数为1.8％，且培养120h时，平阳霉素的产量最高，可达37.5μg/mL，而对照组120h时的发酵单位为13.4μg/mL，其较效果实施例2中对照组的产量提高179.9％，符合生产需求。

Claims (14)

1.一种用于生产平阳霉素的发酵培养基，其包括以下组分：氮源、碳源、无机盐、微量元素和水；其中，所述氮源为玉米浆、冷榨黄豆饼粉、榴花酵母粉以及植物药，所述碳源为葡萄糖和α-淀粉酶液化淀粉，所述无机盐为NaNO3和KH2PO4，所述微量元素为ZnSO4·7H2O和CuSO4·5H2O，所述发酵培养基的pH为6.0-7.0；所述氮源占所述发酵培养基的质量分数为3.55％-9.25％；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种；所述植物药占所述发酵培养基的质量分数为0.1％-1.5％。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述氮源占所述发酵培养基的质量分数为4.55％-7.05％；
和/或，所述冷榨黄豆饼粉占所述发酵培养基的质量分数为2.5％-4.5％；
和/或，所述植物药占所述发酵培养基的质量分数为0.2％-0.9％；
和/或，所述无机盐占所述发酵培养基的质量分数为0.05％-0.45％；
和/或，所述微量元素占所述发酵培养基的质量分数为0.005％-0.09％；
和/或，所述发酵培养基还包括铵盐；
和/或，所述发酵培养基的pH为6.5。
3.如权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于，所述氮源占所述发酵培养基的质量分数为4.65％、4.85％、5.35％或5.95％；
所述冷榨黄豆饼粉占所述发酵培养基的质量分数为3.5％；
所述植物药占所述发酵培养基的质量分数为0.3％、0.4％或者0.5％。
4.如权利要求2或3所述的发酵培养基，其特征在于，所述玉米浆占所述发酵培养基的质量分数为0.75％-1.75％；
和/或，所述榴花酵母粉占所述发酵培养基的质量分数为0.2％-1.5％；
和/或，所述葡萄糖占所述发酵培养基的质量分数为0.5％-1.5％；
和/或，所述α-淀粉酶液化淀粉占所述发酵培养基的质量分数为4％-7％；
和/或，所述NaNO3占所述发酵培养基的质量分数为0.1％-0.3％；
和/或，所述KH2PO4占所述发酵培养基的质量分数为0.05％-0.15％；
和/或，所述ZnSO4·7H2O占所述发酵培养基的质量分数为0.025％-0.075％；
和/或，所述CuSO4·5H2O占所述发酵培养基的质量分数为0.005％-0.015％；
和/或，所述铵盐为硝酸铵；
和/或，所述铵盐占所述发酵培养基的质量分数为0.02％-0.08％。
5.如权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述α-淀粉酶液化淀粉占所述发酵培养基的质量分数为6％；
所述NaNO3占所述发酵培养基的质量分数为0.2％；
所述KH2PO4占所述发酵培养基的质量分数为0.1％；
所述ZnSO4·7H2O占所述发酵培养基的质量分数为0.05％；
所述CuSO4·5H2O占所述发酵培养基的质量分数为0.01％；
所述铵盐占所述发酵培养基的质量分数为0.05％。
6.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基包括以下组分：植物药0.9％、玉米浆0.75％、冷榨黄豆饼粉3.5％、榴花酵母粉0.2％、葡萄糖0.5％、α-淀粉酶液化淀粉6％、NaNO3 0.2％、KH2PO4 0.1％、ZnSO4·7H2O 0.05％和CuSO4·5H2O 0.01％，余量为水，上述百分比为各组分占所述发酵培养基的质量分数；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种；所述发酵培养基的pH为6.5。
7.一种生产平阳霉素的摇瓶发酵方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)将轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensis n.sp)的种子液接种于如权利要求1-6任一项所述的发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得到发酵液1；
(2)从所述发酵液1中分离出所述平阳霉素。
8.如权利要求7所述的摇瓶发酵方法，其特征在于，所述的轮枝链霉菌平阳变种的编号为CPCC 200554。
9.一种生产平阳霉素的罐发酵方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)将轮枝链霉菌平阳变种(Streptomyces pingyangensis n.sp)的种子液接种于如权利要求1-6任一项所述的发酵培养基中进行罐发酵培养，在所述罐发酵培养的第24h时开始添加发酵罐补料，所述发酵罐补料的添加周期为10h-12h，所述发酵罐补料的添加次数为6-12次，所述发酵罐补料的每次添加量相对于所述发酵培养基的质量分数为1％-1.6％，得发酵液2；
(2)从所述发酵液2中分离出所述平阳霉素。
10.如权利要求9所述的罐发酵方法，其特征在于，所述的轮枝链霉菌平阳变种的编号为CPCC 200554；
和/或，所述发酵罐补料，其包括以下组分：植物药9％-30％、玉米浆3.5％-10％、冷榨黄豆饼粉2％-5％、榴花酵母粉1％-3％、KH2PO4 0.05％-0.15％、ZnSO4·7H2O 0.025％-0.075％、CuSO4·5H2O 0.005％-0.015％和NaNO3 0.1％-0.3％，余量为水，上述百分比为各组分相对于所述发酵罐补料的质量分数；所述植物药为宁夏枸杞、宁夏枸杞嫩叶和薏米中的一种或几种；
和/或，所述发酵罐补料的pH为6.0-7.0。
11.如权利要求10所述的罐发酵方法，其特征在于，所述发酵罐补料的pH为6.5。
12.如权利要求10或11所述的罐发酵方法，其特征在于，所述发酵罐补料中，所述植物药占所述发酵罐补料的质量分数为9.38％-28.13％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述玉米浆占所述发酵罐补料的质量分数为7％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述冷榨黄豆饼粉占所述发酵罐补料的质量分数为3.5％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述榴花酵母粉占所述发酵罐补料的质量分数为2.1％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述KH2PO4占所述发酵罐补料的质量分数为0.1％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述ZnSO4·7H2O占所述发酵罐补料的质量分数为0.05％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述CuSO4·5H2O占所述发酵罐补料的质量分数为0.01％；
和/或，所述发酵罐补料中，所述NaNO3占所述发酵罐补料的质量分数为0.2％。
13.如权利要求12所述的罐发酵方法，其特征在于，所述植物药占所述发酵罐补料的质量分数为18.75％。
14.如权利要求9所述的罐发酵方法，其特征在于，所述发酵罐补料包括：宁夏枸杞嫩叶18.75％、玉米浆7％、冷榨黄豆饼粉3.5％、榴花酵母粉2.1％、KH2PO4 0.1％、ZnSO4·7H2O0.05％、CuSO4.5H2O 0.01％和NaNO3 0.2％，余量为水，上述百分比为各组分相对于所述发酵罐补料的质量分数。
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