CN105296357A - 一种通过补料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过补充培养基原料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法。本发明所提供的方法，包括如下步骤：将冬虫夏草菌进行液体发酵，待培养体系中碳源和氮源的含量均下降至初始浓度的50％-60％时，向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源，继续培养，以得到产量提高的冬虫夏草菌丝体。实验证明，该方法具有操作简便、生长速度快、周期短、产率高(18天可到17.5g/L)等优点。采用本发明所述方法所得的冬虫夏草菌丝体可更大地满足市场对冬虫夏草的需求，缓解了市场需求对自然资源的压力。基于上述优点，本发明可产生较好的社会及经济效益，市场前景广阔。

Description

一种通过补料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法

技术领域

本发明涉及一种通过补充培养基原料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法。

背景技术

冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora(≡Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)]是我国著名的传统中药，属于子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、蛇形虫草科(Ophiocordycipitaceae)。有关冬虫夏草的记录历史悠久。“冬虫夏草”最早出现在1694年成书的《本草备要》中，其药用功效被记载为“甘平，保肺益肾，止血化痰，已劳咳。”在《本草从新》(1757)中也明确记载“冬虫夏草味甘平，入肺、肾二经，保肺益肾，补精髓、止血化痰，已劳咳，治膈症皆良。”在《中华人民共和国药典》(2000年版)中则被解释为：“冬虫夏草味甘，平。归肺、肾经；功能为补肺益肾，止血化痰。用于久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛。”现代研究结果证明冬虫夏草具有祛痰平喘、免疫调节、保肝护肾、抗肿瘤等多种药理作用。但是冬虫夏草是青藏高原特有的菌物，因寄主特异性、地理分布局限性导致其天然产量非常有限，加之长期采挖过度、其赖以生存的生态环境遭到破坏，这种珍贵药材的分布范围和发生数量已经出现明显的萎缩趋势。由于良好的治疗与保健效果，目前国内外市场对冬虫夏草需求量激增。这一供需矛盾进一步刺激其价格昂贵，并继续上涨。目前已有研究表明通过人工发酵得到的冬虫夏草与天然虫草的功效相似，因此，通过发酵生产冬虫夏草菌粉以代替天然冬虫夏草，也成为缓解自然资源压力，调节供需平衡、创造经济价值的很有潜力的途径。

DNA分子研究结果表明，目前市面上很多称为“冬虫夏草菌丝体”的发酵产品与天然冬虫夏草没有联系，因此其培养基和培养条件不能应用于真正的冬虫夏草菌种；而用冬虫夏草菌种进行发酵生产，仍存在发酵周期长、产率低、成本高的问题。关于冬虫夏草菌种液体发酵技术有待优化，关于其培养方式仍有很大的改进空间。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过补充培养基原料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法。

本发明所提供的通过补充培养基原料提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法，为：在将冬虫夏草菌进行液体发酵的过程中，向培养体系中补充碳源和氮源，从而得到产量提高的冬虫夏草菌丝体。

该方法具体可包括如下步骤：将冬虫夏草菌进行液体发酵，待培养体系中碳源和氮源的含量均下降至初始浓度的50％-60％(如55％-58％)时，向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源(即所述补充培养基原料)，继续培养，从而得到产量提高的冬虫夏草菌丝体。

在本发明中，所述碳源为单糖，具体如葡萄糖；所述氮源为复合氮源，具体为鱼蛋白胨和酵母提取物。

在本发明中，上述方法中的所述氮源的含量具体是以氨基氮含量计的。

在本发明中，所述“待培养体系中碳源和氮源的含量均下降至初始浓度的50％-60％(如55％-58％)”时，具体为：所述培养体系中所述碳源的含量下降至初始浓度的58％，同时所述培养体系中所述氮源的含量(以氨基氮含量计)下降至初始浓度的55％时。

在所述方法中，所述将冬虫夏草菌进行液体发酵的培养基为半合成培养基；所述半合成培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：葡萄糖30.0-50.0g/L，鱼蛋白胨5.0-10.0g/L，酵母提取物1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾1.0-1g/L，硫酸镁0.5-1.0g/L。

在本发明的一个实施例中，所述半合成培养基的溶剂为水，溶质及其浓度具体如下：葡萄糖50.0g/L，鱼蛋白胨10.0g/L，酵母提取物3.0g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L。

在所述方法中，所述将冬虫夏草菌进行液体发酵，具体为：将所述冬虫夏草菌的种子液按照1：(7-11)，如1:9，的体积比(种子液：培养基)接入到所述半合成培养基中，进行液体发酵。

进一步，向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源的时间具体为将所述冬虫夏草菌的种子液接入到所述半合成培养基中进行液体发酵的第5-10天(如第9天)。

在所述方法中，向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源具体为：向每50mL初始培养体系中补充8-12mL(如10.2mL)液体；所述8-12mL(如10.2mL)液体中含有0.8-1.6g(如1.6g或0.8g)作为碳源的所述葡萄糖、0.35-0.7g(如0.7g或0.35g)作为氮源的所述鱼蛋白胨和0.105-0.21g(如0.21g或0.105g)作为氮源的所述酵母提取物，余量为水。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述8-12mL液体具体为10.2mL液体；所述10.2mL液体具体为如下(a)-(d)中任一：(a)1.6mL浓度为500g/L的葡萄糖水溶液、7.0mL含有100g/L鱼蛋白胨和30g/L酵母提取物的混合物水溶液，以及1.6mL水；(b)1.6mL浓度为500g/L的葡萄糖水溶液、3.5mL含有100g/L鱼蛋白胨和30g/L酵母提取物的混合物水溶液，以及5.1mL水；(c)3.2mL浓度为500g/L的葡萄糖水溶液、3.5mL含有100g/L鱼蛋白胨和30g/L酵母提取物的混合物水溶液，以及3.5mL水；(d)3.2mL浓度为500g/L的葡萄糖水溶液，以及7.0mL含有100g/L鱼蛋白胨和30g/L酵母提取物的混合物水溶液。

在上述方法中，所述培养具体为15-18℃(如18℃)、100-150rpm(如100rpm)、黑暗条件下振荡培养。

在上述方法中，所述培养的时间具体为6-9天(如9天)。

在上述方法中，所述冬虫夏草菌的种子液具体是按照包括如下步骤的方法制备得到：

(a1)将所述冬虫夏草菌原始菌种接种于含有固体菌种培养基的平板中，15-18℃(如15℃)黑暗培养90-120天(如90天)，获得冬虫夏草菌菌种；

其中，所述冬虫夏草菌原始菌种在所述固体菌种培养基斜面上，4℃黑暗保存，接种时由接种针挑取表面积约为1平方厘米的菌丝体转接入所述固体菌种培养基中。

(a2)将所述冬虫夏草菌菌种用水制成菌悬液，将所述菌悬液接种于液体菌种培养基中，15-18℃(如18℃)、100-150rpm(如100rpm)、黑暗条件下振荡培养12-16天(如14天)，得到冬虫夏草菌第一菌种液；

其中，水的用量为10ml；将所述菌悬液接种于液体菌种培养基中为将所述菌悬液按照1:(2-6)，如1:4，的体积比接种于液体菌种培养基中。

(a3)将所述冬虫夏草菌第一菌种液按照1：(7-11)，如1:9的体积比接种于所述液体菌种培养基中，15-18℃(如18℃)、100-150rpm(如100rpm)、黑暗条件下振荡培养12-16天(如14天)，得到冬虫夏草菌第二菌种液；所述冬虫夏草菌第二菌种液即为所述冬虫夏草菌的种子液。

进一步，每升所述固体菌种培养基的组成如下：30.0-50.0g(如50.0g)麦麸、200.0g土豆、10.0-20.0g(如20.0g)葡萄糖、3.0-5.0g(如5.0g)鱼蛋白胨、1.0-2.0g(如1.0g)酵母提取物、20.0g琼脂，余量为水。

每升所述液体菌种培养基的组成如下：30.0-50.0g(如50.0g)麦麸，200.0g土豆，10.0-20.0g(如20.0g)葡萄糖，3.0-5.0g(如5.0g)鱼蛋白胨，1.0-2.0g(如1.0g)酵母提取物，余量为水。

在本发明中，所述冬虫夏草菌具体为冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis)1621CGMCCNO.6445。该菌种已于2012年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

本发明提供了一种在冬虫夏草液体发酵过程中补充碳源和氮源以提高菌丝体产量的方法。实验证明，该方法具有操作简便、生长速度快、周期短、产率高(18天可到17.5g/L)等优点。采用本发明所述方法所得的冬虫夏草菌丝体可更大地满足市场对冬虫夏草的需求，缓解了市场需求对自然资源的压力。基于上述优点，本发明可产生较好的社会及经济效益，市场前景广阔。

保藏说明

建议分类命名：冬虫夏草菌

拉丁名：(Ophiocordycepssinensis)

参椐的生物材料(株)：1621

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年9月4日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.6445

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的冬虫夏草菌为冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis)1621CGMCCNO.6445。冬虫夏草菌(Ophiocordycepssinensis)1621CGMCCNO.6445，是分离自青海果洛州的一株野生冬虫夏草上，该菌种已于2012年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

下述实施例中用于制备固体培养基平板的培养皿均相同，直径为9.0cm。用于液体种子液培养和液体补料培养实验的培养瓶均相同，为250mL三角瓶，使用封口膜隔离。

下述实施例中的培养基如下：

每1L固体菌种培养基由如下物质制成：50.0g麦麸，200.0g土豆，20.0g葡萄糖，5.0g鱼蛋白胨，1.0g酵母提取物，20.0g琼脂，用水定容至1000mL。

每1L液体菌种培养基由如下物质制成：50.0g麦麸，200.0g土豆，20.0g葡萄糖，5.0g鱼蛋白胨，1.0g酵母提取物，用水定容至1000mL。

每1L半合成培养基由如下物质组成：50.0g葡萄糖，10.0g鱼蛋白胨，3.0g酵母提取物，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，用水定容至1000mL。

上述培养基pH自然即可。

液体菌种培养基和固体菌种培养基的配制方法如下：将麦麸煮沸10分钟，加入切成小块的去皮土豆再煮沸半小时，然后用纱布过滤，在滤液中，按上述配方加入其他成分，用水定容至1000mL，121℃湿热灭菌半小时得到培养基。

上述半合成培养基的配制方法如下：将葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、无机盐等共同溶解后，8磅灭菌后半小时后得到培养基。

下述实施例中作为补料的碳源溶液和氮源溶液如下：

碳源溶液为浓度为500g/L的葡萄糖水溶液，经8磅灭菌后备用；氮源溶液为含有100g/L的鱼蛋白胨和30g/L的酵母提取物的混合物水溶液，经8磅灭菌后备用。

下述实施例中碳源(葡萄糖)含量使用山东省科学院生物研究所SBA-40型生物传感分析仪测定；氮源(鱼蛋白胨和酵母提取物混合物)含量使用常规甲醛测定法进行氨基氮含量测定。测定结果均取至少三次重复的平均值。

下述实施例中所用的葡萄糖为北京现代东方精细化学品有限公司产品，其产品目录号为HG/T3475-1999；鱼蛋白胨为北京双旋微生物培养基制品厂产品，其产品目录号为02-40；酵母提取物为Oxide公司(英国)产品，其产品目录号为12852-02。

下述实施例中菌丝体的产率的计算为常规方法，即发酵液中菌丝体干重/全发酵产物体积(单位：g/L)。其中，菌丝体干重称量按照常规方法进行，即收集全发酵产物，在8000g条件下离心15min，弃去上清，使用10mL蒸馏水洗涤3遍后，在60℃条件下烘干至衡重，称取重量即得菌丝体干重。

实施例1、冬虫夏草菌丝体的生产

一、冬虫夏草菌种子液的制备

1、冬虫夏草菌母种平板的获得

将冬虫夏草菌原始菌种(所述冬虫夏草菌原始菌种在所述固体菌种培养基斜面上，4℃黑暗保存)用接种针从斜面上挑取表面积约为1平方厘米的菌丝体(可附带下部的培养基)接入含有固体菌种培养基的平板中，15℃黑暗培养90天得到母种平板。

2、液体一级种子液的获得

用5mL移液枪分两次吸取10mL蒸馏水洗涤、刮取步骤1所得的母种平板上的菌落，吸取该菌液混合液进入含有40mL液体菌种培养基的250mL三角瓶中。黑暗、18℃、100rpm培养14d后，得到液体一级种子液。

3、液体二级种子液的获得

用5mL移液枪吸取5mL步骤2所得的液体一级种子液进入含有45mL液体菌种培养基的250mL三角瓶中，黑暗、18℃、100rpm培养14d，得到液体二级种子液，即为实验用冬虫夏草菌种子液。

二、冬虫夏草菌液体培养基原料补充实验

无菌条件下吸取5mL上述步骤一获得的冬虫夏草菌种子液进入含有45mL半合成培养基的250mL摇瓶中，18℃、100rpm、黑暗条件下振荡培养。经测定，培养体系中作为碳源的葡萄糖初始浓度为41g/L，作为氮源的鱼蛋白胨和酵母提取物初始总氨基氮浓度为0.60g/L。

在培养的第9d，培养体系中碳源的含量为24g/L(为培养初始浓度为41g/L的58％)，且氮源的含量低于0.33g/L(为培养初始浓度为0.60g/L的55％)，一次性补充碳源溶液1.6mL，氮源溶液7.0mL和无菌蒸馏水1.6mL。在如上条件下继续震荡培养9d，至总培养时间的第18d时收获菌丝体，计算菌丝体的产率(实验组)。同时设置了在培养的第9d时补充10.2mL无菌蒸馏水的对照组。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示，从表中可以看出，液体发酵过程中补充了碳源和氮源的实验组，其冬虫夏草菌的菌丝体的产率为17.50g/L，显著高于对照组的12.25g/L(P<0.05)。

表1实验组和对照组三次重复实验的菌丝体产率结果(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					实验组	17.66	17.75	17.08	17.50±0.36
对照组	12.60	12.07	12.10	12.25±0.30

实施例2、冬虫夏草菌丝体的生产

一、冬虫夏草菌种子液的制备

同实施例1。

二、冬虫夏草菌液体补料实验

无菌条件下吸取5mL上述步骤一获得的冬虫夏草菌种子液进入含有45mL半合成培养基的250mL摇瓶中，18℃、100rpm、黑暗条件下振荡培养。在培养的第9d，培养体系中碳源的含量为24g/L(该实验值为培养初始浓度41g/L的58％)，且氮源的含量为0.33g/L(该实验值为培养初始浓度0.60g/L的55％)，一次性补充碳源溶液1.6mL，氮源溶液3.5mL和无菌蒸馏水5.1mL。在如上条件下继续震荡培养9d，至总培养时间为18d时收获菌丝体，计算菌丝体的产率(实验组)。同时设置了在培养的第9d时补充10.2mL无菌蒸馏水的对照组。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表2所示，从表中可以看出，液体发酵过程中补充了碳源和氮源的实验组，其冬虫夏草菌的菌丝体的产率为16.56g/L，显著高于对照组的12.25g/L(P<0.05)。

表2实验组和对照组三次重复实验的菌丝体产率结果(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					实验组	16.25	16.89	16.55	16.56±0.32
对照组	12.60	12.07	12.10	12.25±0.30

实施例3、冬虫夏草菌丝体的生产

一、冬虫夏草菌种子液的制备

同实施例1。

二、冬虫夏草菌液体补料实验

无菌条件下吸取5mL上述步骤一获得的冬虫夏草菌种子液进入含有45mL半合成培养基的250mL摇瓶中，18℃、100rpm、黑暗条件下振荡培养。在培养的第9d,培养体系中碳源的含量为24g/L(该实验值为培养初始浓度41g/L的58％)，且氮源的含量为0.33g/L(该实验值为培养初始浓度0.60g/L的55％)，一次性补充碳源溶液3.2mL，氮源溶液3.5mL和无菌蒸馏水3.5mL。在如上条件下继续震荡培养9d，至总培养时间为18d时收获菌丝体，计算菌丝体的产率(实验组)。同时设置了在培养的第9d时补充10.2mL无菌蒸馏水的对照组。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表3所示，从表中可以看出，液体发酵过程中补充了碳源和氮源的实验组，其冬虫夏草菌的菌丝体的产率为15.60g/L，显著高于对照组的12.25g/L(P<0.05)。

表3实验组和对照组三次重复实验的菌丝体产率结果(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					实验组	15.77	15.44	15.61	15.60±0.17
对照组	12.60	12.07	12.10	12.25±0.30

实施例4、冬虫夏草菌丝体的生产

一、冬虫夏草菌种子液的制备

同实施例1。

二、冬虫夏草菌液体补料实验

无菌条件下吸取5mL上述步骤一获得的冬虫夏草菌种子液进入含有45mL半合成培养基的250mL摇瓶中，18℃、100rpm、黑暗条件下振荡培养。在培养的第9d,培养体系中碳源的含量低于24g/L(该实验值为培养初始浓度41g/L的58％)，且氮源的含量低于0.33g/L(该实验值为培养初始浓度0.60g/L的55％)，一次性补充碳源溶液3.2mL，氮源溶液7.0mL。在如上条件下继续震荡培养9d，至总培养时间为18d时收获菌丝体，计算菌丝体的产率(实验组)。同时设置了在培养的第9d时补充10.2mL无菌蒸馏水的对照组。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如表4所示，从表中可以看出，液体发酵过程中补充了碳源和氮源的实验组，其冬虫夏草菌的菌丝体的产率为16.34g/L，显著高于对照组的12.25g/L(P<0.05)。

表4实验组和对照组三次重复实验的菌丝体产率结果(单位：g/L)

	重复1	重复2	重复3	平均值±标准差
					实验组	15.57	16.61	16.83	16.34±0.67
对照组	12.60	12.07	12.10	12.25±0.30

Claims (10)

1.一种提高冬虫夏草菌液体发酵菌丝体产量的方法，为：在将冬虫夏草菌进行液体发酵的过程中，向培养体系中补充碳源和氮源，从而得到产量提高的冬虫夏草菌丝体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将所述冬虫夏草菌进行液体发酵，待所述培养体系中所述碳源和所述氮源的含量均下降至初始浓度的50％-60％时，向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源，继续培养，从而得到产量提高的冬虫夏草菌丝体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述碳源为单糖；所述氮源为复合氮源；所述复合氮源具体为鱼蛋白胨和酵母提取物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述将冬虫夏草菌进行液体发酵的培养基为半合成培养基；所述半合成培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：葡萄糖30.0-50.0g/L，鱼蛋白胨5.0-10.0g/L，酵母提取物1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾1.0-1g/L，硫酸镁0.5-1.0g/L。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述将冬虫夏草菌进行液体发酵，为：将所述冬虫夏草菌的种子液按照1:(7-11)的体积比接入到所述半合成培养基中，进行液体发酵。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源的时间为将所述冬虫夏草菌的种子液接入到所述半合成培养基中进行液体发酵的第5-10天。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：向所述培养体系中补充所述碳源和所述氮源为：向每50mL初始培养体系中补充8-12mL液体；所述8-12mL液体中含有0.8-1.6g作为碳源的所述葡萄糖、0.35-0.7g作为氮源的所述鱼蛋白胨和0.105-0.21g作为氮源的所述酵母提取物，余量为水。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述培养为15-18℃、100-150rpm、黑暗条件下振荡培养；和/或

所述培养的时间为6-9天。

9.据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述冬虫夏草菌的种子液按照包括如下步骤的方法制备得到：

(a1)将所述冬虫夏草菌的原始菌种接种于固体菌种培养基上，15-18℃黑暗培养90-120天，获得冬虫夏草菌菌种；

(a2)将所述冬虫夏草菌菌种用水制成菌悬液，将所述菌悬液接种于液体菌种培养基中，15-18℃、100-120rpm、黑暗条件下振荡培养12-16天，得到冬虫夏草菌第一菌种液；

(a3)将所述冬虫夏草菌第一菌种液按照1:(7-11)的体积比接种于所述液体菌种培养基中，15-18℃、100-150rpm、黑暗条件下振荡培养12-16天，得到冬虫夏草菌第二菌种液；所述冬虫夏草菌第二菌种液即为所述冬虫夏草菌的种子液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：每升所述固体菌种培养基的组成如下：30.0-50.0g麦麸、200.0g土豆、10.0-20.0g葡萄糖、3.0-5.0g鱼蛋白胨、1.0-2.0g酵母提取物、20.0g琼脂，余量为水；或

每升所述液体菌种培养基的组成如下：30.0-50.0g麦麸，200.0g土豆，10.0-20.0g葡萄糖，3.0-5.0g鱼蛋白胨，1.0-2.0g酵母提取物，余量为水。