CN108624510B - 蛹虫草单交配型菌株2461及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛹虫草单交配型菌株2461及其应用。本发明公开的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13683；在富营养培养基中培养蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461，得到蛹虫草菌丝；富营养培养基为由麦麸、土豆、葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁制备得到的培养基。实验证明，本发明的蛹虫草2461菌丝生长速度快，生物量高，可以用于生产蛹虫草菌丝。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，蛹虫草单交配型菌株2461及其应用。
背景技术
蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Fr.,]是一种重要的食药用真菌，得到广泛的重视，迄今已有大量的研究报道，并已实现产业化人工栽培。它以其特殊的营养价值和明显的药用价值如虫草酸、虫草素、虫草多糖而受到人们的关注。然而，蛹虫草菌种退化已成为影响行业发展的核心技术问题，目前急需新的蛹虫草菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高蛹虫草菌丝的产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株蛹虫草菌株。
本发明所提供的蛹虫草菌株为蛹虫草(Cordyceps militaris)2461，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13683。
为解决上述技术问题，本发明还提供了蛹虫草菌丝的制备方法。
本发明所提供的蛹虫草菌丝的制备方法，包括：培养所述蛹虫草菌株2461，得到蛹虫草菌丝。
上述方法中，所述培养所述蛹虫草菌株2461可在富营养培养基中进行；所述富营养培养基为由麦麸、土豆、葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁制备得到的培养基。
上述方法中，所述富营养培养基可按照包括如下步骤的方法得到：将麦麸和土豆在水中煮沸后添加葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁得到所述富营养培养基。
上述方法中，所述富营养培养基中，麦麸和土豆的量分别可为50g/L和200g/L；
所述富营养培养基中葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁的浓度分别可为20g/L、5g/L、1g/L、0.5g/L和0.5g/L。
上述方法中，所述培养所述蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461可在液体培养基或固体培养基中进行；所述液体培养基为由土豆和葡萄糖制备得到的培养基；所述固体培养基为将所述液体培养基固化得到的培养基。
上述方法中，所述液体培养基可按照包括如下步骤的方法得到：将土豆在水中煮沸后添加葡萄糖得到所述液体培养基。
上述方法中，所述液体培养基中，土豆的用量可为200g/L；
所述液体培养基中葡萄糖的浓度可为20g/L。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂
本发明所提供的菌剂的活性成分为所述蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461在制备蛹虫草菌丝中的应用。
所述蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461为单交配型菌株。
实验证明，本发明的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461菌丝生长速度快，生物量高：
1、蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461仅经过一天的迟滞期后，菌丝便迅速生长，第7天菌丝产量达到高峰期；蛹虫草菌株2456的迟滞期为两天，第8天菌丝产量达到高峰期；蛹虫草菌株1018其迟滞期也是1天，第7天菌丝量达到高峰期；
2、在富营养液体培养基中培养7天，蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461菌丝产量为蛹虫草菌株2456的1.6倍，为蛹虫草菌株1018的1.3倍，为蛹虫草菌株2451的2.0倍，为蛹虫草菌株2446的1.8倍，为蛹虫草菌株2498的2.1倍。
表明，本发明的蛹虫草(Cordyceps militaris)2461可以用于生产蛹虫草菌丝。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：蛹虫草(Cordyceps militaris)
生物材料的菌株编号：2461
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2017年2月20日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13683
附图说明
图1为蛹虫草单交配型菌株2461和蛹虫草单交配型菌株2456在固体培养基平板上的拮抗试验图。其中，左图为平板正面照片；右图为平板背面照片。
图2为蛹虫草单交配型菌株2461在25℃黑暗培养15天的菌落照片。
图3为各蛹虫草菌株的菌丝产量曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的富营养液体培养基为富营养培养基，富营养培养基的配制方法如下：将50.0g麦麸于1000mL水中煮沸10分钟，然后加入切成小块的去皮土豆共200.0g再煮沸30min，得到液体1；将液体1用纱布过滤，取滤液；向滤液中加入20.0g葡萄糖、5.0g鱼蛋白胨(国药集团化学试剂有限公司)、1.0g酵母提取物(OXOID公司)、0.5g磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁，用水定容至1000mL，121℃湿热灭菌30min。
下述实施例中的液体培养基的配制方法如下：将切成小块的去皮土豆共200.0g于1000mL水中煮沸20min，得到液体2；将液体2用纱布过滤，取滤液；向滤液中加入20.0g葡萄糖，用水定容至1000mL，121℃湿热灭菌30min。下述实施例中的固体培养基为向液体培养基中加入琼脂得到的培养基。
下述实施例中用到的培养皿均相同，直径均为90mm。
实施例1、蛹虫草(Cordyceps militaris)单交配型菌株2461的分离及鉴定
本发明提供了一株蛹虫草(Cordyceps militaris)单交配型菌株2461(以下简称菌株2461)，菌株2461是由蛹虫草(Cordyceps militaris)出发菌株1018(以下简称菌株1018)经过单孢分离而得到。蛹虫草(Cordyceps militaris)单交配型菌株2461，已于2017年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.13683。
蛹虫草(Cordyceps militaris)单交配型菌株2461的生物学特性：
1、形态学特性：菌株2461在PDA平板上菌落呈雪白色，菌丝洁白、浓密，菌落表面不凸起，边缘有散射状绒毛菌丝。平板背面呈淡黄色。显微观察其菌丝无色，光滑，纤细，直径约为1.5-3.0μm。产孢细胞单生或簇生于营养菌丝主干或其次级分枝上。分生孢子单细胞，呈椭圆形和近圆形两种形态。椭圆形孢子直径(3.0-5.0)μm×(1.5-2.5)μm(长径×短径)，近圆形孢子直径2.5-4.0μm。
2、分子生物学特性：按照文献[Jiang,Y.&Yao,Y.-J.(2006)ITS sequenceanalysis and ascomatal development of Pseudogymnoascus roseus.Mycotaxon.94:55–73.]的方法，将菌株2461经培养、基因组DNA提取、PCR扩增核糖体DNA内转录间隔区(ITS)并测序，其ITS序列如序列表中的序列1所示。将序列1同虫草属的序列数据库进行比对，发现菌株2461属于蛹虫草无性型。按照文献[汪虹&鲍大鹏(2010)交配型基因作为分子标记鉴定蛹虫草退化菌株的核相初步研究.食用菌学报，17(4)：1–4.]的方法，将菌株2461经培养、基因组DNA提取、PCR扩增MAT1-1-1(交配型Ⅰ型)和MAT1-2-1(交配型Ⅱ型)片段并电泳与测序，发现菌株2461的PCR产物只有MAT1-2-1单一条带(其序列为序列表中序列2)，不含MAT1-1-1的片段。因此，菌株2461为蛹虫草单交配型Ⅱ型菌株。
3、菌株2461与蛹虫草单交配型菌株2456拮抗试验
将菌株2461与蛹虫草单交配型菌株2456分别接种至同一个固体培养基的两个对立位置进行拮抗试验，待二者菌丝生长到接触时，观察两个菌落交界处的形态。结果如图1所示，无论是从平板正面观察还是从背面观察，均可见靠近平板中央处有明显拮抗线，表明蛹虫草单交配型菌株2461与蛹虫草单交配型菌株2456不亲和。其中，蛹虫草单交配型菌株2456也是由菌株1018经过单孢分离而得到
实施例2、蛹虫草(Cordyceps militaris)单交配型菌株2461的菌丝产量情况
在从菌株1018分离得到菌株2461过程中共得到了上百个菌株，从中选择出产量较高的蛹虫草单交配型菌株2456(Ⅰ型)(以下简称菌株2456)、蛹虫草菌株2451(Ⅰ型)(以下简称菌株2451)、蛹虫草菌株2509(Ⅰ型)(以下简称菌株2509)、蛹虫草菌株2446(Ⅱ型)(以下简称菌株2446)和蛹虫草菌株2498(Ⅱ型)(以下简称菌株2498)以及蛹虫草单交配型Ⅱ型菌株2461(菌株2461，CGMCC No.13683)检测菌丝产量，利用实施例1的菌株1018作为对照。
一、菌种液的制备
将各蛹虫草菌株接种于固体培养基上，25℃培养10天，获得蛹虫草菌种。用灭菌后的打孔器挑取直径约为5毫米的菌块，接种于液体培养基中，液体培养基装于500ml三角瓶，液体培养基的体积为100ml(为三角瓶容积的1/5)，然后在25℃，转速150rpm，24小时黑暗条件下进行震荡培养3天，得到菌种液，各蛹虫草菌株菌种液的浓度无显著差异。
二、菌丝产量曲线测定
该步骤所用菌株为：菌株1018、菌株2456和菌株2461。
将步骤一获得的各菌株的菌种液均按10％(v/v)的比例接种到装有45ml液体培养基的250ml三角瓶中(最终装液量约为三角瓶容积的1/5)，置于25℃，转速150rpm，24小时黑暗条件下进行震荡培养，得到发酵液。然后每天取3瓶，观察三角瓶中菌丝形态变化过程并收集菌丝，测定菌丝干重，绘制菌丝干重变化曲线(即菌丝产量曲线)。
观察发现，所有菌株的培养液中先是出现少量细丝状、分散的弱菌丝，同时在三角瓶壁缘形成一圈薄菌丝；而后，菌丝段生长加速，由分散的丝状逐渐纠缠聚集为菌丝球，培养液逐渐变浑浊，黏度加大，颜色加深。菌丝产量见表1，菌丝产量曲线见图3。
表1、各蛹虫草菌株菌丝产量随时间的变化(g/L)
| 时间 | 菌株2461 | 菌株2456 | 菌株1018 |
| 第0天 | 0.58±0.08 | 0.60±0.08 | 0.58±0.10 |
| 第1天 | 1.08±0.31 | 0.81±0.12 | 0.96±0.43 |
| 第2天 | 3.69±0.38 | 1.02±0.38 | 3.09±0.18 |
| 第3天 | 7.51±0.32 | 2.52±0.45 | 6.63±0.43 |
| 第4天 | 9.64±0.41 | 5.01±0.32 | 8.70±0.60 |
| 第5天 | 11.89±0.55 | 6.86±0.42 | 9.90±0.45 |
| 第6天 | 12.82±0.63 | 8.22±0.28 | 10.92±0.25 |
| 第7天 | 13.52±0.40 | 9.05±0.35 | 11.45±0.24 |
| 第8天 | 13.26±0.31 | 9.59±0.28 | 10.99±0.36 |
| 第9天 | 12.94±0.55 | 9.25±0.29 | 10.55±0.20 |
| 第10天 | 12.45±0.22 | 8.63±0.35 | 9.83±0.29 |
结果表明，菌株2461仅经过一天的迟滞期后，菌丝便迅速生长，第7天菌丝产量达到高峰期，随后菌体开始缓慢自溶；菌株2456的迟滞期为两天，第8天菌丝产量达到高峰期；菌株1018其迟滞期也是1天，第7天菌丝量达到高峰期。在产量高峰期时，菌株2461的菌丝产量均显著高于出发菌株及菌株2456的菌丝产量，在产量高峰期时，菌株2461的菌丝产量为菌株2456的1.41倍，为菌株1018的1.18倍。菌株2461比蛹虫草出发菌株1018和菌株2456均具有更快的生长速度与更高的菌丝产量。
三、菌丝产量检测
该步骤所用菌株为：菌株1018、菌株2451、菌株2456、菌株2509、菌株2446、菌株2461和菌株2498。
将步骤一获得的各菌株的菌种液均按10％(v/v)的比例接种到装有90ml富营养液体培养基的500ml三角瓶中(最终装液量约为三角瓶的1/5)，置于25℃，转速150rpm，24小时黑暗条件下进行震荡培养7天，得到发酵液，收集菌丝测定干重(即菌丝产量)。每个菌株均设置三个重复。
结果表明：菌株2461在富营养液体培养基中培养7天得到的菌丝平均产量可达22.4g/L，菌株2456在富营养液体培养基上培养7天得到的菌丝平均产量为13.8g/L，菌株1018在富营养液体培养基上培养7天得到的菌丝平均产量为17.2g/L。在富营养液体培养基中培养7天，菌株2461菌丝产量为菌株2456的1.6倍，为菌株1018的1.3倍，为菌株2451的2.0倍，为菌株2446的1.8倍，为菌株2498的2.1倍。
其中，该实施例中菌丝的收集及干重测量的具体操作如下：将发酵液于10000g离心10min，收集菌体，将菌体用蒸馏水洗涤数次，直至上清液透明无色，将菌丝体用液氮冷冻，再置于冷冻干燥机中冷干48小时至恒重，电子天平称重。
<110> 中国科学院微生物研究所、中国科学院大学
<120> 蛹虫草单交配型菌株2461及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> 蛹虫草（Cordyceps militaris）
<400> 1
ggggaacgcg ggagggtctt aacgagtttt ccaactccca accctttgtg aacataccta 60
tcgttgcttc ggcggactcg cccagcgcct ggacgcgggc ctgggcggcg gccgtcgggg 120
gccccaaaca ctgtatctac cagtttttct gaatccgccg caaggcaaaa caaatgaatc 180
aaaactttca acaacggatc tcttggctct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 240
taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc 300
gccagcattc tggcgggcat gcctgttcga gcgtcatttc aaccctcgac gtcccctggg 360
ggatgtcggc gttggggacc ggcagcacac cgccgccccc gaaatgaagt ggcggcccgt 420
ccgcggcgac ctctgcgtag tactccaact cgcaccggga acccgacgtg gccacgccgt 480
aaaacgccca actctgaacg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc 540
atatcaaaaa gcgggaagaa aacccc 566
<210> 2
<211> 797
<212> DNA
<213> 蛹虫草（Cordyceps militaris）
<400> 2
ggattgatct agctttggga tgccgtcagc gtcggcatca acccatttgt gaaagttctc 60
agtatcgacg gtctcatcta ccgttccttg actgtgaaaa caaaaagatc tttggctgaa 120
aatttcgtgt aagggcacat ccatggcgac atttgggcgg cgcgctaact ttcccaagca 180
aacacgtaca agaaccagtc atgtattgtc gcgatggttc tggcccagac agatacttcc 240
ttggaaatcc acgacatttg atgtccggca ctggcatcat tctagctgcc gcggaagtag 300
agcctatttg gtttgaacaa ccaggcttga agtaccaaaa ggcgaccatg tgtcagtcgt 360
cgcttccacg caaacacatc aagatcccga ggccacccaa tgcgtatatt ctataccgca 420
gagaccgaca tacgcttgtc aagaaaagcg agccacattt gtcgaacaat gaagtttgta 480
agagcaactg tacgccccct aaagataaag ttactgacca ttcatagcgc aagtgcttgg 540
taaagcttgg aatgcagaac ctccagaggt gcgacaacgc tacaaggaaa tgtcggagag 600
gatcaagaag gctctcctcg aacggcatcc ccaatatcaa tatcaacctc gcaaaccctc 660
tgagcggaag cgacgccgca agcgcactca ggataccgaa tctcaaagca gtgagactac 720
gtcggcaacg ccagacagca ccattatgac aggaagcgag ctttcaatga gcccgaccca 780
atctctggta aaaaccc 797
Claims (2)
1.蛹虫草菌丝的制备方法，包括：培养蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461，得到蛹虫草菌丝；
所述蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13683；
所述培蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株2461在富营养培养基中进行；所述富营养培养基为由麦麸、土豆、葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁制备得到的培养基；
所述富营养培养基中，麦麸和土豆的用量分别为50g/L和200g/L；
所述富营养培养基中葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁的浓度分别为20g/L、5g/L、1g/L、0.5g/L和0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述富营养培养基按照包括如下步骤的方法得到：将麦麸和土豆在水中煮沸后添加葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾和硫酸镁得到所述富营养培养基。
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| 冬虫夏草、蛹虫草菌丝隔膜和细胞核荧光染色;胡晓棣等;《菌物学报》;20160922;第35卷(第9期);参见全文 * |
| 冬虫夏草和蛹虫草的细胞学研究;胡晓棣;《中国科学院大学硕士学位论文》;20160531;参见摘要，1.2.4药用价值与经济价值，2.1 菌株来源，2.3.1 菌株培养试剂，2.4.1 菌株的分离与鉴定，2.4.4蛹虫草单孢菌株的人工栽培实验 * |
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