CN107354182B - 一种灰毛豆内生真菌发酵制备(r)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法 - Google Patents

一种灰毛豆内生真菌发酵制备(r)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法 Download PDF

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Abstract

一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)‑4‑苄基‑2‑噁唑烷酮化合物的方法，是以保藏号为CCTCC NO：M 2017408的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)TPL04作为发酵菌株获得发酵液，将发酵液分离纯化得到化学合成中常用的多用途的不对称合成手性助剂(R)‑4‑苄基‑2‑噁唑烷酮化合物。本方法所得目标化合物纯度高、产率可观，并且分离纯化过程简单、所用试剂填料经济，为(R)‑4‑苄基‑2‑噁唑烷酮的生产制备开创了新途径，并提供了菌种来源。

Description

一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合 物的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的制备方法，具体涉及一种从灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法。
背景技术
4-苄基-2-噁唑烷酮，根据分子中3位手性碳构型的不同分为：(R)-型、(S)-型两个异构体，其中(S)-4-苄基-2-噁唑烷酮的旋光值为负值，而(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮对应的旋光值为正值。该化合物的两种异构体都是重要的手性辅剂，在不对称合成中有广泛的应用；同时也是重要的医药中间体，可用于合成HIV蛋白酶抑制剂等。如穆博帅等(2017)以(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮为手性助剂，不对称合成制备具有光学活性的2-甲氧基-4-氟苯基-1,5-苯并硫氮杂卓类化合物；Brimble等(1998)以(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮为手性助剂实现环戊二烯的Diels-Alder不对称加成反应。
中国专利200510029672.6公开了一种4-取代手性恶唑垸酮类化合物的制备方法，介绍了有关4-苄基-2-噁唑烷酮的化学合成，均是从天然的L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸出发，先还原成氨基醇，再关环合成。在以上合成方法中，所用的还原剂(LiAlH4,NaBH4/I2,NaBH4/H2SO4,LiBH4/Me3SiCl,BH3·Me2S)有一定毒性、强腐蚀性，且具有价格昂贵、步骤复杂或反应时间较长等问题。
另外，2014年裴晓丽等从灰毛豆植物叶片中也分离报道了(S)-4-苄基-2-噁唑烷酮，是首次发现该化合物的(S)-构型以植物次生代谢产物形式存在于自然界，但该报道没有涉及(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮。
截至目前，通过化学合成或从灰毛豆叶片中分离，是获得4-苄基-2-噁唑烷酮已知的所有途径，而本发明所涉的一种通过对真菌发酵，从发酵产物中制备目标产物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的方法，与现有化学合成途径相比具有能耗小、避免使用毒性、腐蚀性试剂等优势，绿色环保；与从植物材料中分离纯化途径相比，其不受植物材料的生长期漫长、材料收集有限性的影响，可大规模室内发酵获取，可控性强等诸多优势。基于此，本发明筛选获得一株产自植物灰毛豆叶片的内生真菌淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)TPL04，通过发酵可制备化合物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，该发明为重要手性助剂(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的制备开创了菌种来源和方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种操作简便的以灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，该方法步骤如下：
A、以保藏号为CCTCC NO：M 2017408的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)TPL04作为发酵菌株，制备该菌株的发酵液；
B、于该发酵液中加入萃取溶剂，按体积比1:1利用萃取溶剂萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，得浸膏；
C、将浸膏上硅胶柱进行层析，以石油醚和丙酮的混合液作为洗脱剂，按石油醚：丙酮的体积比为9:1、8:2、7:3进行梯度洗脱，收集石油醚：丙酮的体积比为7:3的梯度洗脱下来的流份；将此流份再 上葡聚糖凝胶柱进行层析，以纯甲醇进行洗脱，收集并合并紫外和碘氧化均能显色的组份；将该组分进一步用YMC-ODS C18液相色谱柱进行纯化，即得白色固体状化合物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮。
上述步骤B中的萃取溶剂选用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或正丁醇。
上述提及的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉TPL04(Purpureocillium lilacinumstrain)TPL04，已于2017年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2017408。
本发明的菌株TPL04在PDA培养基上可生长，27±1℃恒温培养，菌落初为白色，后期变为淡紫色或酒红色，菌丝呈卷毛状，形成毡状的菌落；PDA平板背面通常为米白色，具有明显轮纹。电子显微镜形态特征：分生孢子梗呈指头状；分生孢子单孢串生，呈向两侧张开的链状，或缠绕在一起，呈纺锤形至椭圆形，孢子壁微粗糙至光滑；菌丝有隔且表面粗糙。
提取该菌株TPL04的总DNA，以通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，获得的扩增基因序列产物经电泳检测后将目的片段送往生工测序，将所得序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行同源性比对分析，利用MEGA 5软件构建系统发育树，结果显示菌株与Purpureocillium lilacinum strain M3927KC157754.1聚在一枝上，序列相似性为99％，确定该菌株为淡紫拟青霉菌。
将斜面保藏的本发明的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌TPL04转接至PDA平板上进行活化，15～30℃培养1～30天，再接种5％～10％至PDB液体培养基中于15～28℃进行摇瓶发酵培养1～30天，过滤，取滤液，即得发酵液，其中，摇瓶转速为100～300r/min。
如此，本方法操作简便、条件可控性强、绿色环保；且使用的分离填料硅胶、ODS C-18、葡聚糖凝胶等都可以重复使用，成本低，污染小。本方法为重要手性助剂(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的制备开创了菌种来源和方法。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌TPL04菌株的制备
取湖南农业大学校园内的灰毛豆叶片，用无菌水将灰毛豆叶片冲洗干净进行叶片组织消毒，剪成0.5cm×0.5cm的小块；将叶片小块在超净台内进行表面消毒：体积分数75％的酒精漂洗3‐5min→1g/L升汞漂洗30s‐1min→无菌水冲洗5次；将消毒后的组织材料接种于已倒好的PDA平板培养基上，每皿3～4块，放置于28±1℃避光培养3～7天。待组织材料外沿切口处长出菌丝(菌落)，采用尖端菌丝挑取法，将菌丝转移至纯化PDA培养基平板上，直到获得单一菌株。
实施例2从本发明菌株TPL04的发酵液中分离纯化目标产物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮
1.制备
将本发明菌株TPL04转接至PDA平板上进行活化，26℃培养6天后接种8％至装有200mLPDB液体培养基的500mL摇瓶中(摇瓶转速为200r/min)，于26℃发酵培养10天，将培养液用四层纱布过滤，取滤液，即得发酵液。将滤液(发酵液)以等体积的乙酸乙酯萃取3遍，浓缩乙酸乙酯萃取液，得浸膏。
将浸膏(10g)进行硅胶柱层析分离，用石油醚/丙酮作为洗脱剂，按石油醚：丙酮的体积比为9:1、8:2、7:3的混合液进行梯度洗脱， 收集石油醚：丙酮的体积比为7:3梯度洗脱下来的第14～32流份(每份50ml)合并成一个组份；将此组份上葡聚糖凝胶柱进行层析，以纯甲醇进行洗脱，收集能让紫外和碘氧化均能显色的第27～32流份(每份8ml)，合并成一个组份；将此物质用半制备高效液相色谱仪分离纯化(液相条件：分离柱型号YMC-ODS C18(10×25cm)、洗脱剂50％甲醇-水、流速3ml/min、保留时间11min、检测波长256nm)，得到白色粉末状固体17mg，光学纯度≥99％。
2.(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮的结构鉴定
上述白色粉末状固体，分子式C10H11NO2，核磁共振数据如下：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ7.30(2H,m),7.22(3H,m),4.36(1H,m),4.10～4.15(2H,m),2.80～2.88(2H,m)；13CNMR(150MHz,CD3OD)δ160.8,136.3,129.0,128.3,126.5,69.3,53.5,40.5；其1HNMR和13CNMR数据、熔点87～88℃、及旋光值(c＝0.2,CH3OH)均与标准品(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮((R)-4-Benzyl-2-oxazolidinone，购自SIGMA)数据一致，所以进一步鉴定为(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮，其化学结构如下图所示。

Claims (3)

1.一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，其特征在于，该方法步骤如下：
A、以保藏号为CCTCC NO：M 2017408的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)TPL04作为发酵菌株，制备该菌株的发酵液；
其中，该发酵液是将斜面保藏的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌TPL04进行活化，再接种至PDB液体培养基中进行摇瓶发酵培养，过滤，取滤液得到；发酵培养条件为：接种量5％～10％、摇瓶转速100～300r/min，温度15～28℃、时间1～30天；
B、按体积比1:1采用萃取溶剂萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，得浸膏；
C、将浸膏上硅胶柱进行层析，以石油醚/丙酮作为洗脱剂，按体积比9:1、8:2、7:3进行梯度洗脱，收集石油醚：丙酮的体积比为7:3的梯度洗脱下来的流份；将此流份再上葡聚糖凝胶柱进行层析，以纯甲醇进行洗脱，收集并合并紫外和碘氧化均能显色的组份；将该组分进一步用高效液相色谱进行纯化，即得白色固体状化合物(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮。
2.如权利要求1所述的一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，其特征在于，所述步骤B中的萃取溶剂选用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮或正丁醇。
3.如权利要求1所述的一种灰毛豆内生真菌发酵制备(R)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法，其特征在于，所述步骤A中斜面保藏的灰毛豆内生真菌淡紫拟青霉菌TPL04活化时的培养基为PDA平板，活化条件为15～30℃培养1～30天。
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淡紫拟青霉菌（Paecilomyces lilacinus（Thom.）Samson Str.NH-PL-03）生物学特性与次生代谢物质生物效应研究;李芳;《福建农林大学博士学位论文》;20061231;100-104 *
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