CN100402659C - 利用抗反馈发酵制备抗生素的方法 - Google Patents
利用抗反馈发酵制备抗生素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100402659C CN100402659C CNB2004100393933A CN200410039393A CN100402659C CN 100402659 C CN100402659 C CN 100402659C CN B2004100393933 A CNB2004100393933 A CN B2004100393933A CN 200410039393 A CN200410039393 A CN 200410039393A CN 100402659 C CN100402659 C CN 100402659C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- resin
- gentamicin
- feedback inhibition
- volume
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及抗反馈抑制发酵方法，该方法包括在生物发酵过程中，加入有效量的可吸附发酵末端产物的树脂。本发明更尤其提供了抗生素的制备方法，该方法包括在分泌所述抗生素的微生物的发酵过程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗生素产生量下降的反馈抑制。
Description
技术领域
本发明涉及抗反馈抑制发酵方法，本发明更尤其涉及利用抗反馈抑制发酵来生产抗生素的方法。所述方法解决了发酵生产过程中的反馈抑制作用，即通过排除反馈抑制使发酵末端产物得到更多地累积。
背景技术
生命体不断地从外界吸收营养物质，然后进行一系列的分解与合成反应(即总称的代谢作用)，以获得建造自身的物质和能量。代谢过程中几乎所有的生化反应都是通过酶的催化而实现。激活作用常见于分解代谢途径中前体对参与后面反应的酶进行激活，促使它们反应速度加快。抑制作用常见于合成代谢的末端产物对合成反应的关键酶进行反馈抑制，以减慢或中止生物合成。在工业发酵中，生物合成代谢的末端产物往往正是所生产的产品。如果该末端产物对其合成过程中的关键酶有抑制作用，那么反馈抑制就会成了限制产量的一个重要因素。
抗生素产业是发酵工业的一大组成部分。但是反馈抑制机理一般不被人们所重视。其原因是抗生素被分泌在细胞体外，而无法和其合成过程中的关键酶接触，因为那些酶皆存在于细胞内。从空间上说抗生素体作为末端产物在细胞外累积不易对细胞内的生物合成造成化学性的反馈抑制。那么从广义上反馈抑制如物理性反馈抑制是否影响抗生素的生产，发明人为此进行了深入的研究，结果出人意料地发现，抗反馈抑制能够显著提高抗生素的产量，基于该发现，完成了本发明。
本发明的概述
因此，本发明的目的是提供抗反馈抑制发酵方法，该方法包括在生物发酵过程中，加入有效量的可吸附发酵末端产物的树脂。
本发明更尤其提供了抗生素的制备方法，该方法包括在分泌所述抗生素的微生物的发酵过程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗生素产生量下降的反馈抑制。
有效量例如是0.05-20％(树脂体积/发酵体积)，优选0.1-5％(树脂体积/发酵体积)，更优选约1-3％(树脂体积/发酵体积)。该量可以分一次或多次添加。
所述生物包括所有可发酵的微生物，例如青霉菌，绛红小单孢菌，头孢菌，链霉菌，链丝菌，枯草杆菌，小单孢菌，地中海拟无枝酸菌等。
所述发酵末端产物例如包括抗感染的青霉素，红霉素，头孢菌素，庆大霉素，万古霉素，链霉素，氯霉素，卡那霉素，林可霉素，利福霉素等，以及抗肿瘤的正定霉素，争光霉素等。
所述发酵过程包括在发酵的初期和/或中期和/或后期。
所述树脂是抗反馈抑制载体，它是能够吸附目的抗生素或生物制品的树脂。吸附树脂包括强酸性阳离子树脂(如带磺酸基的苯乙烯阳离子树脂)，弱酸性阳离子树脂(如羧酸型弱酸性树脂)，强碱性阴离子树脂(如带有季铵基团的酚醛树脂)，弱碱性阴离子树脂(如环氧型树脂)。这些树脂是已知的，并且可以从市场上购买到。
例如，聚苯乙烯阳离子吸附树商品有Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1，732树脂等。
强酸性阳离子树脂如苯乙烯阳离子交换树脂可用于庆大霉素，卡那霉素，新霉素，万古霉素等，弱酸性阳离子交换树脂如羧酸型树脂可用于链霉素、利福霉素等。强碱性阴离子交换树脂例如可用于头霉素，弱碱性阴离子树脂如环氧型树脂例如可用于头孢菌素C。
特定抗生素选择何种树脂一般根据其酸碱性及强弱来决定，这对本领域的技术人员来说是容易决定的。但是所用树脂必须是物理和化学性安定的，并不对发酵本身产生负面作用。
吸附树脂可以分一次或多次(例如2-10次，优选3-5次)在发酵的初期和/或中期和/或后期添加。每次的添加量可以是任选的。添加的具体时间取决于具体的微生物，发酵条件(温度、pH、总发酵时间等)等因素。例如和优选在总发酵时间进行到2/10-4/10时，添加吸附树脂总量的1/4-1/2，在总发酵时间进行到4/10-6/10时，添加吸附树脂总量的另外1/4-1/2，在总反应时间进行到6/10-8/10时，添加吸附树脂总量的最后1/4-1/2。
本发明的方法适用于所有微生物分泌的生物活性物质的制备。
为了简便起见，以下以庆大霉素为例来说明本发明的具体实施方式，应该指出的是，其它抗生素的生产可以类似地进行。
庆大霉素是一个控制感染的有效药物，尤其对绿脓杆菌，肠道杆菌和金葡菌感染的疗效显著。庆大霉素是由绛红小单孢菌生产的抗生素。它是一个多组分的氨基苷类抗生素，带有很强的正电荷。本发明中发现了庆大霉素和绛红小单孢菌的结合速度极快并形成物理性的反馈抑制。本发明首次展示对该种反馈抑制的解决办法。
本发明的目的在于提高庆大霉素的产量，具体地讲是通过采用新的发酵工艺排除物理性反馈抑制提高庆大霉素的发酵单位。
本发明目的通过如下措施来实现：
1、庆大霉素效价测量
测量庆大霉素的生物效价的标准茵种为短小芽孢杆菌。将已知效价的庆大霉素标准溶液和被检品溶液，在短小芽孢杆菌生长的培养基上进行对照培养，产生透明的抑菌圈。比较标品和被检品抑菌圈的大小，利用两剂量法计算，求出庆大霉素抗菌效价。
2、反馈抑制的表现
(1)庆大霉素的生产累积量和发酵时间的关系
本发明中使用的菌种是绛红小单孢菌(Micromonosporapurpurea菌株NRRL2953)ATCC15835，该菌保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)。将绛红小单孢菌在如下的培养基中生长：玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH 7.2。培养温度35℃。从24小时后没隔12小时取发酵液测量庆大霉素的发酵单位，全部发酵时间为90小时。
图1显示庆大霉素的发酵单位和时间的对数成直线关系，即随着发酵时间的延续，庆大霉素的积累速度在减小。该结果说明庆大霉素的生产随着发酵时间的增加而受到抑制。
(2)庆大霉素的反馈抑制
为了分析是否是庆大霉素本身抑制了庆大霉素的生产速度，在发酵途中(24小时)向培养液中添加庆大霉素(最终浓度750单位/毫升)，观测庆大霉素的生产速度是否有变化。结果展示添加组的庆大霉素积累和无添加组形成非平行关系(图1)。
以上结果明确地说明在庆大霉素发酵过程中存在生产抑制现象，而这种抑制是来源于庆大霉素本身，即庆大霉素的反馈抑制。
3、抗反馈抑制发酵
综合上述结果，庆大霉素在绛红小单孢菌周围的积累，对绛红小单孢菌形成了一个不利于向体外分泌新合成的庆大霉素的物理性环境。
针对这一物理性质的反馈抑制，采取了物理方法加以排除。抗反馈抑制发酵如下。绛红小单孢菌的培养基组成可以为：玉米粉5-15克/升，淀粉10-50克/升，酵母粉或黄豆粉25-40克/升，硝酸钾0.01-0.45克/升，碳酸钙2.5-7.5克/升，硫酸铵0.1-3.5克/升，蛋白胨3.5-7.5克/升，氯化钴5-50毫克/升，pH6.8-7.6。培养温度35-37℃。在发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入0.05-5％(树脂体积/发酵体积)可吸附庆大霉素的苯乙烯阳离子交换树脂(商品名Dowex-50)。在不同的树脂加入量中，0.5％(树脂体积/发酵体积)的效果为佳，如图2所示，增加了20％左右的发酵效率。同类树脂，商品名Amberlite，DiaionSK-1和732树脂发挥了同样的效果。
4、庆大霉素的纯化
常规的庆大霉素纯化方式是向发酵液中加入硫酸使pH降为1.5进行酸化处理，溶解绛红小单孢菌以便释放出庆大霉素。在1小时后用氢氧化钠中和到pH6.8，加入1.5％(树脂体积/发酵体积)苯乙烯阳离子交换树脂吸附庆大霉素，然后过滤分离出树脂。因本发明在庆大霉素发酵过程中，已经使树脂(商品名Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1和732树脂)和庆大霉素结合，不需用硫酸对发酵液进行pH 1.5的强酸化处理，在庆大霉素的纯化过程中节省了大量的酸和碱，有利于环保和降低成本。本发明可直接从发酵液中过滤分离出吸附了庆大霉素的树脂，或者只需加入少量的硫酸调节pH为3.5至7.0使发酵液的粘度降低以利于过滤分离树脂。得到的树脂经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。
本发明之抗反馈抑制发酵法可以在其他抗生素或分泌型生物制品的制造中应用。其改变处为添加能够吸附目的抗生素或生物制品的树脂。但是所用树脂必须是物理和化学性安定的，不对发酵本身产生负面作用。
附图说明
图1：庆大霉素在发酵中的反馈抑制表现
图中X轴为发酵时间(小时)，以对数形式表示；Y轴为庆大霉素发酵效价(单位/毫升)。
“□”表示常规的庆大霉素发酵；“○”表示在24小时添加庆大霉素(750单位/毫升)后出现的严重反馈抑制发酵情景。
图2：抗反馈抑制发酵
图中X轴为发酵时间(小时)，以对数形式表示；Y轴为庆大霉素发酵效价(单位/毫升)。
“□”表示常规的庆大霉素发酵；“○”表示添加树脂(Dowex-50)后的抗反馈抑制发酵。添加时间为24，48和72小时，添加量每次0.5％(体积/体积)。
具体实施方式
下面列举实施例，对本发明进一步说明，应该清楚的是，这些实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围。
实施例1
庆大霉素抑制发酵。培养基含有玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。发酵体积10升。在24小时加入750万单位庆大霉素，继续发酵66小时。
实施例2
物理性抗反馈抑制发酵。绛红小单孢菌的培养基组成为：玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。发酵体积10升。当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入5毫升的苯乙烯阳离子交换树脂(商品名Dowex-50)。全部发酵时间为90小时，结果如图2所示。
实施例3
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例2，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名Dowex-50)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例4
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例2，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入500毫升的树脂(商品名Dowex-50)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例5
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例2，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名Amberlite)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例6
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例3，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名DiaionSK-1)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例7
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例3，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名732树脂)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例8
庆大霉素的纯化。向实施例1-7的培养液中加入硫酸使pH降为4.5，过滤分离出树脂。得到的吸附了庆大霉素的树脂经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。
实施例9
庆大霉素的纯化。同实施例8，不同之处是不向发酵后的培养液中加入硫酸，并保持培养液在中性附近(pH6.5-7.5)，过滤分离出树脂。
比较例1
庆大霉素常规发酵。培养基含有玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。发酵体积10升。发酵时间90小时。
比较例2
庆大霉素的常规纯化。向比较例1的培养液中加入硫酸使pH降为1.5，1小时后加氢氧化钠中和到pH6.8并加入150毫升的732树脂。4小时后过滤分离出树脂。得到的吸附了庆大霉素的树脂经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。结果如图2所示，比本发明实施例的发酵效率低大约20％。
实施例10
头霉素C的抗反馈抑制发酵。链丝菌NRRL3802的培养基包括：燕麦粉20g/L，番茄酱20g/L，水，种子接种量5体积％。发酵时间为72小时。培养温度25℃。总发酵体积为10L。在发酵进行到20、40和60小时时分别添加5ml强阴离子酚醛树脂。吸附了头霉素C的树脂用5％氯化钠洗脱。
比较例3
与实施例10类似地进行，只是不添加酚醛树脂。
结果表明，实施例10的产量比比较例3高15％。
实施例11
在含碳源、氮源和硫源的培养基中培养顶孢头孢菌，分两组进行，一组在发酵过程中添加基于发酵体积的1％的环氧型弱阴离子交换树脂，另一组不添加。结果在发酵过程中添加了树脂的头孢菌素C产量比不添加的头孢菌素C产量高18％。
实施例12
利福霉素的抗反馈抑制发酵。发酵培养Amycolatopsismediterranei。培养基包括：葡萄糖10％，黄豆饼粉1.0％，蛋白胨1.0％，鱼粉0.5％，KNO30.8％，KH2PO40.015％，氯化钴1ug/ml，CaCO30.5％。发酵温度28℃，发酵时间140小时。在发酵进行到30、60、90和120小时时，分别添加基于发酵体积的0.3体积％的羧酸型阳离子交换树脂。吸附了利福霉素的树脂用95∶5甲醇-水解吸。
比较例4
与实施例12类似地进行，只是在发酵过程中不添加树脂。结果实施例12比比较例4产量提高23％。
Claims (4)
1.利用抗反馈发酵来制备庆大霉素的方法，该方法包括在分泌所述庆大霉素的降红小单孢菌的发酵过程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的阳离子树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗生素产生量下降的反馈抑制。
2.根据权利要求1的方法，其中有效量是树脂体积/发酵体积为0.1-5％。
3.根据权利要求1的方法，其中有效量是树脂体积/发酵体积为1-3％。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的方法，其特征在于直接从发酵液中过滤分离出吸附了庆大霉素的树脂，或者只需加入少量的硫酸调节pH为3.5至7.0使发酵液的粘度降低以利于过滤分离树脂，因此在纯化庆大霉素时不需用硫酸对发酵液进行强酸化处理。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100393933A CN100402659C (zh) | 2004-02-17 | 2004-02-17 | 利用抗反馈发酵制备抗生素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100393933A CN100402659C (zh) | 2004-02-17 | 2004-02-17 | 利用抗反馈发酵制备抗生素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1560262A CN1560262A (zh) | 2005-01-05 |
| CN100402659C true CN100402659C (zh) | 2008-07-16 |
Family
ID=34441298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100393933A Expired - Fee Related CN100402659C (zh) | 2004-02-17 | 2004-02-17 | 利用抗反馈发酵制备抗生素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100402659C (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102363759B (zh) * | 2011-10-27 | 2012-10-17 | 福州大学 | 一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用 |
| CN106755216B (zh) * | 2016-11-30 | 2021-05-28 | 河南科技大学 | 一种提高纳他霉素产量的发酵方法 |
| CN111961699A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-11-20 | 黑龙江格林赫思生物科技有限公司 | 一种绛红小单孢菌短周期发酵生产低杂质庆大霉素的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5786185A (en) * | 1991-09-13 | 1998-07-28 | Reilly Industries, Inc. | Process for producing and recovering lactic acid |
| CN1358864A (zh) * | 2001-12-10 | 2002-07-17 | 李剑锋 | 一种螺旋霉素发酵用添加剂 |
| CN1415763A (zh) * | 2002-09-23 | 2003-05-07 | 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 | 脱除木质纤维水解物中微生物生长抑制物的方法 |
| CN1415758A (zh) * | 2001-10-30 | 2003-05-07 | 上海医药工业研究院 | 盐酸万古霉素原料生产工艺 |
-
2004
- 2004-02-17 CN CNB2004100393933A patent/CN100402659C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5786185A (en) * | 1991-09-13 | 1998-07-28 | Reilly Industries, Inc. | Process for producing and recovering lactic acid |
| CN1415758A (zh) * | 2001-10-30 | 2003-05-07 | 上海医药工业研究院 | 盐酸万古霉素原料生产工艺 |
| CN1358864A (zh) * | 2001-12-10 | 2002-07-17 | 李剑锋 | 一种螺旋霉素发酵用添加剂 |
| CN1415763A (zh) * | 2002-09-23 | 2003-05-07 | 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 | 脱除木质纤维水解物中微生物生长抑制物的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 对乳酸发酵中反馈抑制消除方法的探讨. 常秀莲.食品与发酵工业，第24卷第4期. 1998 |
| 对乳酸发酵中反馈抑制消除方法的探讨. 常秀莲.食品与发酵工业，第24卷第4期. 1998 * |
| 抗生素产生菌对其自身产物的耐受性机制的研究. 江洁，姜彦，刘德宗.高师理科学刊，第20卷第3期. 2000 |
| 抗生素产生菌对其自身产物的耐受性机制的研究. 江洁，姜彦，刘德宗.高师理科学刊，第20卷第3期. 2000 * |
| 酒精发酵中代谢终产物抑制消除方法进展. 梁刚.酿酒科技，第2期. 1999 |
| 酒精发酵中代谢终产物抑制消除方法进展. 梁刚.酿酒科技，第2期. 1999 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1560262A (zh) | 2005-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101225405A (zh) | 一种微生物絮凝剂的生产方法及使用方法 | |
| CN111304129B (zh) | 一种绛红小单孢菌突变型菌株、制备方法以及在硫酸庆大霉素制备中的应用 | |
| CN106986433B (zh) | 一种去除抗生素制药废水中抗生素的预处理方法及抗生素制药废水处理方法 | |
| US20240083777A1 (en) | Preparation method and application of clay/tannic acid/metal ion composite material for efficient adsorption of antibiotics | |
| CN103087126A (zh) | 一种中生菌素原药的制备方法 | |
| CN107434305A (zh) | 一种富缺陷碳载体固定微生物的净水剂及其制备方法 | |
| CN1204260C (zh) | 一种微生物微氧发酵生产1,3－丙二醇的方法 | |
| CN102757951A (zh) | 一种海洋双菌共固定化体系的构建和造纸废水处理的方法 | |
| CN107285480A (zh) | 基于生物酶的高效净水剂 | |
| CN100402659C (zh) | 利用抗反馈发酵制备抗生素的方法 | |
| CN100595271C (zh) | 一种用于生产细菌纤维素的培养基碳源的制备方法 | |
| CN104071902B (zh) | 一种处理生活污水的方法 | |
| CN102774955A (zh) | 一种生物净化景观水的方法 | |
| WO2017076972A1 (de) | Blähglasgranulat mit spurenelementen, insbesondere als aufwuchsträger zur gezielten nährstoffversorgung von mikroorganismen | |
| CN100393869C (zh) | 稀土元素在好氧颗粒污泥培养以及控制污泥膨胀中的应用 | |
| CN101629148B (zh) | 一种微生物重金属沉淀剂及其制备方法 | |
| CN1105688C (zh) | 碱法造纸黑液木质素生物酸析法 | |
| CN109897869A (zh) | 一种高糖废水培养的以榕树叶为碳源载体的生物活性炭 | |
| CN105506041A (zh) | 一种发酵生产去甲万古霉素的方法 | |
| CN108128996B (zh) | 一种处理柠檬酸污泥的复合微生物菌液及生物沥浸处理方法 | |
| CN1217002C (zh) | 酶催化生产腺苷甲硫氨酸的方法 | |
| CN101892163B (zh) | 一种沙门柏干酪青霉及其应用 | |
| CN1876830A (zh) | 以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株筛选方法 | |
| CN103626304B (zh) | 一种用冬虫夏草发酵菌丝体处理含Cr(Ⅵ)废水的方法 | |
| CN114751520A (zh) | 一种利用真菌微藻共生系统处理氨糖加工废水的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080716 Termination date: 20150217 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |