CN1560262A - 抗反馈抑制发酵方法及其在生产抗生素中的应用 - Google Patents
抗反馈抑制发酵方法及其在生产抗生素中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗反馈抑制发酵方法，该方法包括在生物发酵过程中，加入有效量的可吸附发酵末端产物的树脂。本发明更尤其提供了抗生素的制备方法，该方法包括在分泌所述抗生素的微生物的发酵过程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗生素产生量下降的反馈抑制。
Description
技术领域
本发明涉及抗反馈抑制发酵方法，本发明更尤其涉及利用抗反馈抑制发酵来生产抗生素的方法。所述方法解决了发酵生产过程中的反馈抑制作用，即通过排除反馈抑制使发酵末端产物得到更多地累积。
背景技术
生命体不断地从外界吸收营养物质，然后进行一系列的分解与合成反应(即总称的代谢作用)，以获得建造自身的物质和能量。代谢过程中几乎所有的生化反应都是通过酶的催化而实现。激活作用常见于分解代谢途径中前体对参与后面反应的酶进行激活，促使它们反应速度加快。抑制作用常见于合成代谢的末端产物对合成反应的关键酶进行反馈抑制，以减慢或中止生物合成。在工业发酵中，生物合成代谢的末端产物往往正是所生产的产品。如果该末端产物对其合成过程中的关键酶有抑制作用，那么反馈抑制就会成了限制产量的一个重要因素。
抗生素产业是发酵工业的一大组成部分。但是反馈抑制机理一般不被人们所重视。其原因是抗生素被分泌在细胞体外，而无法和其合成过程中的关键酶接触，因为那些酶皆存在于细胞内。从空间上说抗生素体作为末端产物在细胞外累积不易对细胞内的生物合成造成化学性的反馈抑制。那么从广义上反馈抑制如物理性反馈抑制是否影响抗生素的生产，发明人为此进行了深入的研究，结果出人意料地发现，抗反馈抑制能够显著提高抗生素的产量，基于该发现，完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的目的是提供抗反馈抑制发酵方法，该方法包括在生物发酵过程中，加入有效量的可吸附发酵末端产物的树脂。
本发明更尤其提供了抗生素的制备方法，该方法包括在分泌所述抗生素的微生物的发酵过程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗生素产生量下降的反馈抑制。
有效量例如是0.05-20％(树脂体积/发酵体积)，优选0.1-5％(树脂体积/发酵体积)，更优选约1-3％(树脂体积/发酵体积)。该量可以分一次或多次添加。
所述生物包括所有可发酵的微生物，例如青霉菌，绛红小单孢菌，头孢菌，链霉菌，链丝菌，枯草杆菌，小单孢菌，地中海拟无枝酸菌等。
所述发酵末端产物例如包括抗感染的青霉素，红霉素，头孢菌素，庆大霉素，万古霉素，链霉素，氯霉素，卡那霉素，林可霉素，利福霉素等，以及抗肿瘤的正定霉素，争光霉素等。
所述发酵过程包括在发酵的初期和/或中期和/或后期。
所述树脂是抗反馈抑制载体，它是能够吸附目的抗生素或生物制品的树脂。吸附树脂包括强酸性阳离子树脂(如带磺酸基的苯乙烯阳离子树脂)，弱酸性阳离子树脂(如羧酸型弱酸性树脂)，强碱性阴离子树脂(如带有季铵基团的酚醛树脂)，弱碱性阴离子树脂(如环氧型树脂)。这些树脂是已知的，并且可以从市场上购买到。
例如，聚苯乙烯阳离子吸附树商品有Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1，732树脂等。
强酸性阳离子树脂如苯乙烯阳离子交换树脂可用于庆大霉素，卡那霉素，新霉素，万古霉素等，弱酸性阳离子交换树脂如羧酸型树脂可用于链霉素、利福霉素等。强碱性阴离子交换树脂例如可用于头霉素，弱碱性阴离子树脂如环氧型树脂例如可用于头孢菌素C。
特定抗生素选择何种树脂一般根据其酸碱性及强弱来决定，这对本领域的技术人员来说是容易决定的。但是所用树脂必须是物理和化学性安定的，并不对发酵本身产生负面作用。
吸附树脂可以分一次或多次(例如2-10次，优选3-5次)在发酵的初期和/或中期和/或后期添加。每次的添加量可以是任选的。添加的具体时间取决于具体的微生物，发酵条件(温度、pH、总发酵时间等)等因素。例如和优选在总发酵时间进行到2/10-4/10时，添加吸附树脂总量的1/4-1/2，在总发酵时间进行到4/10-6/10时，添加吸附树脂总量的另外1/4-1/2，在总反应时间进行到6/10-8/10时，添加吸附树脂总量的最后1/4-1/2。
本发明的方法适用于所有微生物分泌的生物活性物质的制备。
为了简便起见，以下以庆大霉素为例来说明本发明的具体实施方式，应该指出的是，其它抗生素的生产可以类似地进行。
庆大霉素是一个控制感染的有效药物，尤其对绿脓杆菌，肠道杆菌和金葡菌感染的疗效显著。庆大霉素是由绛红小单孢菌生产的抗生素。它是一个多组分的氨基苷类抗生素，带有很强的正电荷。本发明中发现了庆大霉素和绛红小单孢菌的结合速度极快并形成物理性的反馈抑制。本发明首次展示对该种反馈抑制的解决办法。
本发明的目的在于提高庆大霉素的产量，具体地讲是通过采用新的发酵工艺排除物理性反馈抑制提高庆大霉素的发酵单位。
本发明目的通过如下措施来实现：
1、庆大霉素效价测量
测量庆大霉素的生物效价的标准菌种为短小芽孢杆菌。将已知效价的庆大霉素标准溶液和被检品溶液，在短小芽孢杆菌生长的培养基上进行对照培养，产生透明的抑菌圈。比较标品和被检品抑菌圈的大小，利用两剂量法计算，求出庆大霉素抗菌效价。
2、反馈抑制的表现
(1)庆大霉素的生产累积量和发酵时间的关系
本发明中使用的菌种是绛红小单孢菌(Micromonosporapurpurea菌株NRRL2953)ATCC15835，该菌保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)。将绛红小单孢菌在如下的培养基中生长：玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。从24小时后没隔12小时取发酵液测量庆大霉素的发酵单位，全部发酵时间为90小时。
图1显示庆大霉素的发酵单位和时间的对数成直线关系，即随着发酵时间的延续，庆大霉素的积累速度在减小。该结果说明庆大霉素的生产随着发酵时间的增加而受到抑制。
(2)庆大霉素的反馈抑制
为了分析是否是庆大霉素本身抑制了庆大霉素的生产速度，在发酵途中(24小时)向培养液中添加庆大霉素(最终浓度750单位/毫升)，观测庆大霉素的生产速度是否有变化。结果展示添加组的庆大霉素积累和无添加组形成非平行关系(图1)。
以上结果明确地说明在庆大霉素发酵过程中存在生产抑制现象，而这种抑制是来源于庆大霉素本身，即庆大霉素的反馈抑制。
3、抗反馈抑制发酵
综合上述结果，庆大霉素在绛红小单孢菌周围的积累，对绛红小单孢菌形成了一个不利于向体外分泌新合成的庆大霉素的物理性环境。
针对这一物理性质的反馈抑制，采取了物理方法加以排除。抗反馈抑制发酵如下。绛红小单孢菌的培养基组成可以为：玉米粉5-15克/升，淀粉10-50克/升，酵母粉或黄豆粉25-40克/升，硝酸钾0.01-0.45克/升，碳酸钙2.5-7.5克/升，硫酸铵0.1-3.5克/升，蛋白胨3.5-7.5克/升，氯化钴5-50毫克/升，pH6.8-7.6。培养温度35-37℃。在发酵进行到24，36，72小时的时候，分别加入0.05-5％(树脂体积/发酵体积)可吸附庆大霉素的苯乙烯阳离子交换树脂(商品名Dowex-50)。在不同的树脂加入量中，0.5％(树脂体积/发酵体积)的效果为佳，如图2所示，增加了20％左右的发酵效率。同类树脂，商品名Amberlite，DiaionSK-1和732树脂发挥了同样的效果。
4、庆大霉素的纯化
常规的庆大霉素纯化方式是向发酵液中加入硫酸使pH降为.5进行酸化处理，溶解绛红小单孢菌以便释放出庆大霉素。在1小时后用氢氧化钠中和到pH6，8，加入1.5％(树脂体积/发酵体积)苯乙烯阳离子交换树脂吸附庆大霉素，然后过滤分离出树脂。因本发明在庆大霉素发酵过程中，已经使树脂(商品名Dowex-50，Amberlite，DiaionSK-1和732树脂)和庆大霉素结合，不需用硫酸对发酵液进行pH1.5的强酸化处理，在庆大霉素的纯化过程中节省了大量的酸和碱，有利于环保和降低成本。本发明可直接从发酵液中过滤分离出吸附了庆大霉素的树脂，或者只需加入少量的硫酸调节pH为3.5至7.0使发酵液的粘度降低以利于过滤分离树脂。得到的树脂经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。
本发明之抗反馈抑制发酵法可以在其他抗生素或分泌型生物制品的制造中应用。其改变处为添加能够吸附目的抗生素或生物制品的树脂。但是所用树脂必须是物理和化学性安定的，不对发酵本身产生负面作用。
附图说明
图1：庆大霉素在发酵中的反馈抑制表现
图中X轴为发酵时间(小时)，以对数形式表示；Y轴为庆大霉素发酵效价(单位/毫升)。
“□”表示常规的庆大霉素发酵；“○”表示在24小时添加庆大霉素(750单位/毫升)后出现的严重反馈抑制发酵情景。
图2：抗反馈抑制发酵
图中X轴为发酵时间(小时)，以对数形式表示；Y轴为庆大霉素发酵效价(单位/毫升)。
“□”表示常规的庆大霉素发酵；“○”表示添加树脂(Dowex-50)后的抗反馈抑制发酵。添加时间为24，48和72小时，添加量每次0.5％(体积/体积)。
具体实施方式
下面列举实施例，对本发明进一步说明，应该清楚的是，这些实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围。
实施例1
庆大霉素抑制发酵。培养基含有玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。发酵体积10升。在24小时加入750万单位庆大霉素，继续发酵66小时。
实施例2
物理性抗反馈抑制发酵。绛红小单孢菌的培养基组成为：玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。发酵体积10升。当发酵进行到24，36，72小时的时候，分别加入5毫升的苯乙烯阳离子交换树脂(商品名Dowex-50)。全部发酵时间为90小时，结果如图2所示。
实施例3
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例2，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名Dowex-50)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例4
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例2，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入500毫升的树脂(商品名Dowex-50)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例5
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例2，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名Amberlite)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例6
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例3，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名DiaionSK-1)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例7
物理性抗反馈抑制发酵。同实施例3，不同之处是当发酵进行到24，36，72小时的时侯，分别加入50毫升的树脂(商品名732树脂)。获得了与实施例2类似的结果。
实施例8
庆大霉素的纯化。向实施例1-7的培养液中加入硫酸使pH降为4.5，过滤分离出树脂。得到的吸附了庆大霉素的树脂经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。
实施例9
庆大霉素的纯化。同实施例8，不同之处是不向发酵后的培养液中加入硫酸，并保持培养液在中性附近(pH6.5-7.5)，过滤分离出树脂。
比较例1
庆大霉素常规发酵。培养基含有玉米粉11克/升，淀粉25克/升，豆饼粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升，pH7.2。培养温度35℃。发酵体积10升。发酵时间90小时。
比较例2
庆大霉素的常规纯化。向比较例1的培养液中加入硫酸使pH降为1.5，1小时后加氢氧化钠中和到pH6.8并加入150毫升的732树脂。4小时后过滤分离出树脂。得到的吸附了庆大霉素的树脂经氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。结果如图2所示，比本发明实施例的发酵效率低大约20％。
实施例10
头霉素C的抗反馈抑制发酵。链丝菌NRRL3802的培养基包括：燕麦粉20g/L，番茄酱20g/L，水，种子接种量5体积％。发酵时间为72小时。培养温度25℃。总发酵体积为10L。在发酵进行到20、40和60小时时分别添加5ml强阴离子酚醛树脂。吸附了头霉素C的树脂用5％氯化钠洗脱。
比较例3
与实施例10类似地进行，只是不添加酚醛树脂。
结果表明，实施例10的产量比比较例3高15％。
实施例11
在含碳源、氮源和硫源的培养基中培养顶孢头孢菌，分两组进行，一组在发酵过程中添加基于发酵体积的1％的环氧型弱阴离子交换树脂，另一组不添加。结果在发酵过程中添加了树脂的头孢菌素C产量比不添加的头孢菌素C产量高18％。
实施例12
利福霉素的抗反馈抑制发酵。发酵培养Amycolatopsismediterranei。培养基包括：葡萄糖10％，黄豆饼粉1.0％，蛋白胨1.0％，鱼粉0.5％，KNO30.8％，KH2PO40.015％，氯化钴1ug/ml，CaCO30.5％。发酵温度28℃，发酵时间140小时。在发酵进行到30、60、90和120小时时，分别添加基于发酵体积的0.3体积％的羧酸型阳离子交换树脂。吸附了利福霉素的树脂用95∶5甲醇-水解吸。
比较例4
与实施例12类似地进行，只是在发酵过程中不添加树脂。结果实施例12比比较例4产量提高23％。
Claims (10)
1、抗反馈抑制发酵方法，该方法包括在生物发酵过程中，加入有效量的可吸附发酵末端产物的树脂。
2、利用抗反馈发酵来制备抗生素的方法，该方法包括在分泌所述抗生素的微生物的发酵过程中，添加有效量的可吸附所述抗生素的树脂，使得消除由所述抗生素的积累引起的导致抗生素产生量下降的反馈抑制。
3、根据权利要求2的方法，其中有效量是0.05-20％(树脂体积/发酵体积)，优选0.1-5％(树脂体积/发酵体积)，更优选约1-3％(树脂体积/发酵体积)。
4、根据权利要求2的方法，所述微生物为青霉菌，绛红小单孢菌，头孢菌，链霉菌，链丝菌，枯草杆菌，小单孢菌，或地中海拟无枝酸菌。
5、根据权利要求2的方法，其中所述抗生素为抗感染的青霉素，红霉素，头孢菌素，庆大霉素，万古霉素，链霉素，氯霉素，卡那霉素，林可霉素或利福霉素，或抗肿瘤的正定霉素或争光霉素。
6、根据权利要求2的方法，所述发酵过程包括在发酵的初期和/或中期和/或后期。
7、根据权利要求2的方法，其中所述树脂包括强酸性阳离子树脂(如带磺酸基的苯乙烯阳离子树脂)，弱酸性阳离子树脂(如羧酸型弱酸性树脂)，强碱性阴离子树脂(如酚醛树脂)，或弱碱性阴离子树脂(如环氧型树脂)。
8、根据权利要求2的方法，其中所述树脂可以分一次或多次(例如2-10次，优选3-5次)在发酵的初期和/或中期和/或后期添加，每次的添加量可以是任选的。
9、根据权利要求2的方法，其中在总发酵时间进行到2/10-4/10时，添加吸附树脂总量的1/4-1/2，在总发酵时间进行到4/10-6/10时，添加吸附树脂总量的另外1/4-1/2，在总反应时间进行到6/10-8/10时，添加吸附树脂总量的最后1/4-1/2。
10、庆大霉素发酵生产方法，该方法特征在于在发酵过程中加入阳离子交换树脂，使阳离子交换树脂和已分泌的庆大霉素结合，从而消除已产生的庆大霉素引起的反馈抑制，以及特征在于直接从发酵液中过滤分离出吸附了庆大霉素的树脂，或者只需加入少量的硫酸调节pH为3.5至7.0使发酵液的粘度降低以利于过滤分离树脂，因此在纯化庆大霉素时不需用硫酸对发酵液进行强酸化处理。
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