CN106755216A - 一种提高纳他霉素产量的发酵方法 - Google Patents

一种提高纳他霉素产量的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高纳他霉素产量的发酵方法，以纳塔尔链霉菌为主要原料，依次经菌株活化、种子培养、发酵和纳他霉素的提取，得到所述纳他霉素；在纳塔尔链霉菌发酵开始前向发酵培养基中加入大孔吸附树脂，在纳塔尔链霉菌发酵12‑24h时在发酵液中添加大豆油作为氧载体，在纳塔尔链霉菌发酵24‑48h时以流加方式向发酵液中加入缬氨酸和苏氨酸。本发明提供的发酵方法纳他霉素产量可提高3‑4倍，达到4g/L左右，显著提高了纳他霉素的产量。

Description

一种提高纳他霉素产量的发酵方法
技术领域
本发明属于纳他霉素制备技术领域，具体涉及一种提高纳他霉素产量的发酵方法。
背景技术
纳他霉素是一种具有活性的多烯烃大环内酯类的抗真菌类抗生素，可由纳塔尔链霉菌经过发酵所得到的一种次级代谢产物，纳他霉素分子式为C33H47NO13，可含3分子结晶水，相对分子量665.725；如式1所示，其化学结构上含有氨基和羧基，因此纳他霉素属于两性物质，其分子构造上通常存在着两种典型构型：酮式结构和烯醇式结构，其中烯醇式结构居多，这就决定了它在许多溶剂中的溶解性较低。纳他霉素属于多烯烃大环内酯类化合物，内酯环上C3～C9部位是半缩醛结构四烯系统是全顺式的，含有由一个糖苷键连接的碳水化合物基团，这个基团即是氨基二脱氧甘露糖。纳他霉素是一种高效广谱的抗真菌类抗生素，抑菌机理主要是纳他霉素依靠其内酯环结构与真菌细胞膜上的甾醇化合物作用，通过形成抗生素-甾醇化合物，破坏真菌的细胞质膜的结构，能够有效抑制真菌生长，还能避免真菌毒素的产生。
纳他霉素作为新型、安全高效的的生物防腐剂和医用抗菌剂，满足食品安全发展的要求，将会在食品、药品等方面的到更加广泛的应用和研究。虽然由于价格、规模化生产工艺等方面的限制，目前还不能完全取代化学防腐剂，但随着科学技术的进步生和人们对食品安全意识的增强以及生活水平的逐步提高，纳他霉素将会有巨大的潜力和良好的市场前景。
目前，纳他霉素仍存在产量较低，产业化生产发展缓慢的问题，由此导致了其价格趋高不下，所以其主要应用于高端产品中，限制了纳他霉素的发展。正因为其产量低，所以导致了其价格相对较高，这严重限制了纳他霉素在我国的产业化应用。长期以来，大部分研究人员着手于从菌种选育和发酵工艺条件的优化等方面进行研究来提高纳他霉素的产量，但是现在面临的问题是仍未达到产业化的需求。因此，开拓出一条新的提高纳他霉素的产量的方法，对实际应用具有很大意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高纳他霉素产量的发酵方法，以纳塔尔链霉菌为主要原料，依次经菌株活化、种子培养、发酵和纳他霉素的提取，得到所述纳他霉素；具体的，纳塔尔链霉菌发酵开始前向发酵培养基中加入大孔吸附树脂；纳塔尔链霉菌发酵12-24h时在发酵液中添加大豆油，纳塔尔链霉菌发酵24-48h时以流加方式向发酵液中加入缬氨酸和苏氨酸；
其中，所述大孔吸附树脂的添加量为每升发酵培养基中添加80-100g的大孔吸附树脂，所述大豆油的添加量为每升发酵液中添加40-50mL的大豆油，所述缬氨酸的添加量为每升发酵液中添加0.5-0.7g的缬氨酸，所述苏氨酸的添加量为每升发酵液中添加0.2-0.5g的苏氨酸。
优选地，所述菌株活化的具体步骤为：以纳塔尔链霉菌为原料，将纳塔尔链霉菌培养于固体斜面培养基上，在26-30℃下培养3-9天，得到纳塔尔链霉菌斜面菌株，4℃以下保藏；
所述固体斜面培养基的配方为：每100mL蒸馏水中含有葡萄糖1-2g，琼脂1.5-2.0g，番茄浆1.5-2.5g，燕麦2-3g，琼脂1.5-2.0g，pH自然。
更优选地，所述种子培养的具体步骤为：将所述纳塔尔链霉菌斜面菌株接种于液体种子培养基中，26-30℃培养2-3天，得到纳塔尔链霉菌种子液；
所述液体种子培养基的配方为：每100mL蒸馏水中含有葡萄糖0.8-1g，胰蛋白胨0.2-0.5g，麦芽浸粉0.3-0.5g，氯化钠0.6-1g，pH为7.0-7.5。
更优选地，所述发酵的具体步骤为：将所述纳塔尔链霉菌种子液以2-10％的接种量接到发酵培养基中，得到发酵液，培养条件为26-30℃，转速160-200r/min，发酵3-7天，得到纳塔尔链霉菌发酵液；
在纳塔尔链霉菌发酵开始前，向发酵培养基中加入大孔吸附树脂；在发酵过程中，在纳塔尔链霉菌发酵12-24h时，往发酵液中添加大豆油；在纳塔尔链霉菌发酵24-48h时，往发酵液中以流加的方式添加缬氨酸和苏氨酸。
所述发酵培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖30-45g，酵母浸出粉1-3g，牛肉膏5-15g，蒸馏水1L，pH为7.0-7.5。
更优选地，所述纳他霉素的提取的具体步骤为：采用甲醇提取法，将甲醇与所述纳塔尔链霉菌发酵液以体积比为9-10：1的比例混合后，充分混合后离心，离心转速10000r/min，离心时间为10-20min，取上清液，将上清液用0.22um滤膜过滤，所得滤液即为所述纳他霉素溶液。
优选地，所述大孔吸附树脂为HPD450大孔树脂。
优选地，所述的纳塔尔链霉菌为纳塔尔链霉菌属中的任何菌株。
更优选地，所述纳塔尔链霉菌为纳塔尔链霉菌4.3526。
本发明提供的发酵方法通过对纳塔尔链霉菌发酵期间按一定比例添加一些物质，一种是氨基酸，氨基酸可作为碳源使用，也可以充当氮源利用，并且氨基酸的代谢产物，例如乙酰CoA，丙酰CoA等物质是大环内酯类抗生素合成的前体；第二种物质大豆油，纳塔尔链霉菌是好氧菌，大豆油作为氧载体，参与纳塔尔链霉菌的发酵；最后一种物质是大孔树脂，大孔树脂作为一种吸附剂提高纳他霉素的回收率，并可以降低发酵产物反馈抑制。该发酵方法使纳他霉素产量可提高3-4倍，达到4g/L左右，显著提高了纳他霉素的产量。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明以下实施例中所用到的相关试剂，若没有特殊说明，皆为市售商品，所涉及的制备方法，若没有特殊说明，皆为现有方法或制造厂商建议的条件。
一种提高纳他霉素产量的发酵方法，以纳塔尔链霉菌为主要原料，依次经菌株活化、种子培养、发酵和纳他霉素的提取，得到所述纳他霉素；具体的，发酵期间，纳塔尔链霉菌发酵12-24h时在发酵液中添加大豆油，纳塔尔链霉菌发酵24-48h时以流加方式向发酵液中加入缬氨酸和苏氨酸，纳塔尔链霉菌发酵开始前向发酵培养基中加入大孔吸附树脂；其中，缬氨酸的添加量为每升发酵液中添加0.5-0.7g的缬氨酸，苏氨酸的添加量为每升发酵液中添加0.2-0.5g的苏氨酸，大豆油的添加量为每升发酵液中添加40-50mL的大豆油，大孔吸附树脂的添加量为每升发酵液中添加80-100g的大孔吸附树脂。
以下就本发明的技术方案进行具体的举例说明，需要说明的是，以下实施例中所用的菌种纳塔尔链霉菌4.3526，购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
对比例1
一种纳他霉素产量的发酵方法，具体步骤如下：
(1)菌体活化培养
将纳塔尔链霉菌4.3526培养于固体斜面培养基上，在28℃下培养7天，可得到纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃下备用。此固体斜面培养基配方为：蒸馏水100mL，葡萄糖2g，琼脂2g，番茄浆2g，燕麦2g，pH值自然。
(2)摇瓶种子培养
将步骤(1)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株用接种环取2环接种于液体种子培养基中，在28℃，摇床转速为180r/min的条件下培养2天，得到纳塔尔链霉菌4.3526种子液，备用。以上纳塔尔链霉菌的种子培养基配方为：葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，氯化钠10g，麦芽浸粉5g，蒸馏水1L，pH为7.2。
(3)发酵
将步骤(2)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526种子液以6％的接种量接种到发酵培养基中，培养条件为28℃，摇床转速为180r/min，培养5天，得到纳塔尔链霉菌4.3526发酵液。以上纳塔尔链霉菌4.3526的发酵培养基配方为：葡萄糖45g，酵母浸出粉2g，牛肉膏10g，蒸馏水1L，pH为7.2。
(4)纳他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及离心的方法提取纳塔尔链霉菌发酵液中的纳他霉素。具体是：甲醇与发酵液以体积比9:1的比例混合后，摇床摇瓶2h后离心，离心转速10000r/min，10min，取上清液用0.22um滤膜过滤，得到滤液，最后用HPLC法测定滤液中的纳他霉素含量，产量为0.98g/L。
实施例1
一种提高纳他霉素产量的发酵方法，具体步骤如下：
(1)菌体活化培养
将纳塔尔链霉菌4.3526培养于固体斜面培养基上，在28℃下培养7天，可得到纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃下备用。此固体斜面培养基配方为：蒸馏水100mL，葡萄糖2g，琼脂2g，番茄浆2g，燕麦2g，pH值自然。
(2)摇瓶种子培养
将步骤(1)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株用接种环取2环接种于液体种子培养基中，在28℃，摇床转速为180r/min的条件下培养2天，得到纳塔尔链霉菌4.3526种子液，备用。以上纳塔尔链霉菌的种子培养基配方为：葡萄糖10g，胰蛋白胨5g，氯化钠10g，麦芽浸粉5g，蒸馏水1L，pH为7.2。
(3)发酵
将步骤(2)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526种子液以6％的接种量接种到发酵培养基中，培养条件为28℃，摇床转速为180r/min，培养5天，得到纳塔尔链霉菌4.3526发酵液。
在发酵开始前，每升发酵培养基中加入80g HPD450大孔树脂，之后进行发酵；在纳塔尔链霉菌4.3526发酵过程中，在发酵20h时，往发酵液中添加大豆油，大豆油的添加量为40mL/L(指的是每升发酵液中添加40mL的大豆油)；在发酵24h时，以流加的方式加入缬氨酸和苏氨酸，缬氨酸和苏氨酸的添加量均为0.5g/L(指的是每升发酵液中添加0.5g/L的缬氨酸和0.5g/L苏氨酸)。
以上纳塔尔链霉菌的发酵培养基配方为：葡萄糖45g，酵母浸出粉2g，牛肉膏10g，蒸馏水1L，pH为7.2。
(4)纳他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及离心的方法提取纳塔尔链霉菌发酵液中的纳他霉素。具体是：甲醇与发酵液以体积比9:1的比例混合后，摇床摇瓶2h后离心，离心转速10000r/min，10min，取上清液用0.22um滤膜过滤，得到滤液，最后用HPLC法测定滤液中的纳他霉素含量，产量为3.32g/L，与对比例1相比，纳他霉素的产量提高了338.8％。
实施例2
一种提高纳他霉素产量的发酵方法，具体步骤如下：
(1)菌体活化培养
将纳塔尔链霉菌4.3526培养于固体斜面培养基上，在30℃下培养3天，可得到纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株，保藏于4℃以下备用。此固体斜面培养基配方为：蒸馏水100mL，葡萄糖1g，琼脂1.5g，番茄浆1.5g，燕麦2.5g，pH值自然。
(2)摇瓶种子培养
将步骤(1)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株用接种环取2环接种于液体种子培养基中，在30℃，摇床转速为180r/min的条件下培养2.5天，得到纳塔尔链霉菌4.3526种子液，备用。以上纳塔尔链霉菌4.3526的液体种子培养基配方为：葡萄糖8g，胰蛋白胨2g，氯化钠6g，麦芽浸粉3g，蒸馏水1L，pH为7.5。
(3)发酵
将步骤(2)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526种子液以8％的接种量接种到发酵培养基中，培养条件为30℃，摇床转速为160r/min，培养3天，得到纳塔尔链霉菌4.3526发酵液。
在发酵开始前，每升发酵培养基中加入85g HPD450大孔吸附树脂，之后进行发酵；在纳塔尔链霉菌4.3526发酵过程中，在发酵12h时，往发酵液中添加大豆油，大豆油的添加量为45mL/L(指的是每升发酵液中添加45mL的大豆油)；在发酵24h时，以流加的方式加入缬氨酸和苏氨酸，缬氨酸和苏氨酸的添加量分别为0.6g/L和0.4g/L(指的是每升发酵液中添加0.6g/L的缬氨酸和0.4g/L苏氨酸)。
以上纳塔尔链霉菌的发酵培养基配方为：葡萄糖30g，酵母浸出粉1g，牛肉膏5g，蒸馏水1L，pH为7.5。
(4)纳他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及离心的方法提取纳塔尔链霉菌发酵液中的纳他霉素。具体是：甲醇与发酵液以体积比10:1的比例混合后，摇床摇瓶2h后离心，离心转速10000r/min，15min，取上清液用0.22um滤膜过滤，得到滤液，最后用HPLC法测定滤液中的纳他霉素含量，产量为3.2g/L，与对比例1相比，纳他霉素的产量提高了326.5％。
实施例3
一种提高纳他霉素产量的发酵方法，具体步骤如下：
(1)菌体活化培养
将纳塔尔链霉菌4.3526培养于固体斜面培养基上，在26℃下培养9天，可得到纳塔尔链霉菌4.35264.3526斜面菌株，保藏于4℃下备用。此固体斜面培养基配方为：蒸馏水100mL，葡萄糖1.5g，琼脂1.5g，番茄浆2.5g，燕麦3g，pH值自然。
(2)摇瓶种子培养
将步骤(1)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526斜面菌株用接种环取2环接种于液体种子培养基中，在26℃，摇床转速为180r/min的条件下培养3天，得到纳塔尔链霉菌4.3526种子液，备用。以上纳塔尔链霉菌的种子培养基配方为：葡萄糖9g，胰蛋白胨4g，氯化钠8g，麦芽浸粉4g，蒸馏水1L，pH为7.0。
(3)发酵
将步骤(2)中所得到的纳塔尔链霉菌4.3526种子液以10％的接种量接种到发酵培养基中，培养条件为26℃，摇床转速为200r/min，培养7天，得到纳塔尔链霉菌4.3526发酵液。
在发酵开始前，每升发酵培养基中加入100g HPD450大孔树脂，之后进行发酵；在纳塔尔链霉菌4.3526发酵过程中，在发酵24h时，往发酵液中添加大豆油，大豆油的添加量为50mL/L(指的是每升发酵液中添加50mL的大豆油)；在发酵48h时，以流加的方式加入缬氨酸和苏氨酸，缬氨酸和苏氨酸的添加量分别为0.7g/L和0.2g/L(指的是每升发酵液中添加0.7g/L的缬氨酸和0.2g/L苏氨酸)。
以上纳塔尔链霉菌的发酵培养基配方为：葡萄糖40g，酵母浸出粉3g，牛肉膏15g，蒸馏水1L，pH为7.0。
(4)纳他霉素的提取
采用甲醇提取的方法，以及离心的方法提取纳塔尔链霉菌发酵液中的纳他霉素。具体是：甲醇与发酵液以体积比9：1的比例混合后，摇床摇瓶2h后离心，离心转速10000r/min，20min，取上清液用0.22um滤膜过滤，得到滤液，最后用HPLC法测定滤液中的纳他霉素含量，产量为3.95g/L，与对比例1相比，纳他霉素的产量提高了403.1％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种提高纳他霉素产量的发酵方法，以纳塔尔链霉菌为主要原料，依次经菌株活化、种子培养、发酵和纳他霉素的提取，得到所述纳他霉素；其特征在于：纳塔尔链霉菌发酵开始前向发酵培养基中加入大孔吸附树脂；纳塔尔链霉菌发酵12-24h时向发酵液中添加大豆油，纳塔尔链霉菌发酵24-48h时以流加方式向发酵液中加入缬氨酸和苏氨酸；
其中，所述大孔吸附树脂的添加量为每升发酵培养基中添加80-100g的大孔吸附树脂，所述大豆油的添加量为每升发酵液中添加40-50mL的大豆油，所述缬氨酸的添加量为每升发酵液中添加0.5-0.7g的缬氨酸，所述苏氨酸的添加量为每升发酵液中添加0.2-0.5g的苏氨酸。
2.根据权利要求1所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述菌株活化的具体步骤为：以纳塔尔链霉菌为原料，将纳塔尔链霉菌培养于固体斜面培养基上，在26-30℃下培养3-9天，得到纳塔尔链霉菌斜面菌株，4℃以下保藏；
所述固体斜面培养基的配方为：每100mL蒸馏水中含有葡萄糖1-2g，番茄浆1.5-2.5g，燕麦2-3g，琼脂1.5-2.0g，pH自然。
3.根据权利要求2所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述种子培养的具体步骤为：将所述纳塔尔链霉菌斜面菌株接种于液体种子培养基中，26-30℃培养2-3天，得到纳塔尔链霉菌种子液；
所述液体种子培养基的配方为：每100mL蒸馏水中含有葡萄糖0.8-1g，胰蛋白胨0.2-0.5g，麦芽浸粉0.3-0.5g，氯化钠0.6-1g，pH为7.0-7.5。
4.根据权利要求3所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述发酵的具体步骤为：将所述纳塔尔链霉菌种子液以2-10％的接种量接到发酵培养基中，得到发酵液，培养条件为26-30℃，转速160-200r/min，发酵3-7天，得到纳塔尔链霉菌发酵液；
在纳塔尔链霉菌发酵开始前，向发酵培养基中加入大孔吸附树脂；在发酵过程中，在纳塔尔链霉菌发酵12-24h时，往发酵液中添加大豆油；在纳塔尔链霉菌发酵24-48h时，往发酵液中以流加的方式添加缬氨酸和苏氨酸；
所述发酵培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖30-45g，酵母浸出粉1-3g，牛肉膏5-15g，pH为7.0-7.5。
5.根据权利要求4所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述纳他霉素的提取的具体步骤为：采用甲醇提取法，将甲醇与所述纳塔尔链霉菌发酵液以体积比为9-10：1的比例混合后，充分混合后离心，离心转速10000r/min，离心时间为10-20min，取上清液，将上清液用0.22um滤膜过滤，所得滤液即为所述纳他霉素溶液。
6.根据权利要求1所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为HPD450大孔树脂。
7.根据权利要求1所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述的纳塔尔链霉菌为纳塔尔链霉菌属中的任何菌株。
8.根据权利要求7所述的提高纳他霉素产量的发酵方法，其特征在于，所述纳塔尔链霉菌为纳塔尔链霉菌4.3526。
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