CN108085354A - 一种发酵生产fr901379的培养基及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵生产FR901379的培养基及其方法。所述培养基包含按以下质量份计的120~160份果糖、10~20份玉米蛋白粉、5~10份干酪素、5~10份酵母蛋白胨、1~3份硫酸镁、0.5~1份磷酸氢二钾、2~4份碳酸钙以及0.5~1份消泡剂。本发明还提供在所述培养基中培养菌株Coleophoma empetri，获得FR901379的方法。采用本发明的发酵培养基及其方法生产FR901379，可以显著降低发酵液粘稠度，改善发酵过程中的溶氧状况，同时促进菌体次级代谢，显著提高FR901379的产量。

Description

一种发酵生产FR901379的培养基及其方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种生产棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净的中间体FR901379的发酵培养基以及方法。
背景技术
棘白菌素类是近年来新上市的一种抗真菌药物，能抑制真菌细胞壁的β-1,3-D-葡萄糖合成酶，由于哺乳动物细胞缺乏β-1,3-D-葡萄糖合成酶，故该类化合物对真菌细胞具有高度的特异性，能迅速杀灭真菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。目前已上市的此类药物有：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。
FR901379是菌株Coleophoma empetri的发酵产物。通过对FR901379进行一系列结构修饰改造可得到棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净（Micafungin）。
米卡芬净（Micafungin）由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为Fungusrd，2005年3月通过美国FDA认证，目前被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒细胞减少症的预防治疗。
FR901379
米卡芬净
USP5502033、EP0431350A1公布了使用Coleophoma empetri F-11899发酵生产FR901379的过程，发酵培养基包含基本的碳氮源、无机盐，单位100mg/L。
CN201010571797.2公开了一种使用Coleophoma empetri F-11899发酵生产FR901379的培养基，优化了碳源和有机氮源，单位提高到300~400mg/L。但现行的发酵生产FR901379的技术中，仍然存在由于发酵液中丝状菌的生长特性，发酵液黏度过高，氧传递效果较差，溶氧偏低，从而抑制了菌体次级代谢，导致FR901379发酵单位偏低的问题。
发明人经过广泛而深入的研究，优化了发酵生产FR901379的培养基及其方法。采用本发明的发酵培养基及其方法生产FR901379，可以显著降低发酵液粘稠度，改善发酵过程中的溶氧状况，同时促进菌体次级代谢，FR901379的产量较高，单位达到2.8~3.5g/L。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产FR901379的培养基及其方法，旨在提高FR901379单位产量。
本发明使用的菌株来源为Coleophoma empetri F-11899。
本发明是这样实现的，一种用于菌株Coleophoma empetri发酵生产FR901379的培养基，包含按以下质量份计各组分：
果糖 120~160份
玉米蛋白粉 10~20份
干酪素 5~10份
酵母蛋白胨 5~10份
硫酸镁 1~3份
磷酸氢二钾 0.5~1份
碳酸钙 2~4份
消泡剂 0.5~1份
优选地，包含按以下质量份计各组分：
果糖 140份
玉米蛋白粉 15份
干酪素 7.5份
酵母蛋白胨 7.5份
硫酸镁 2份
磷酸氢二钾 0.75份
碳酸钙 3份
消泡剂 1份
本发明还进一步提供了一种发酵生产FR901379的方法，发酵所用培养基为上述培养基，包含在发酵过程中补加按以下质量份计各组分：
果糖 80~120份
双氧水 0.5~1.5份
所述的在发酵过程中补加按以下质量份计的80~120份果糖、0.5~1.5份双氧水，其特征在于，在发酵72至96小时间开始补加，补加时间为48至72小时；补加方式为连续型，控制补加量，持续不间断的补加。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所述的发酵过程中，首先将Coleophoma empetri菌种在种子培养基中培养。所述的种子培养基可以使用本领域常规使用的液体培养基, 优选所述种子培养基包含葡萄糖10g/L、可溶性淀粉30g/L、棉籽饼粉20g/L、干粉玉米浆5g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙3g/L、消泡剂1g/L。
配制适量的种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至24-26℃，按种子培养基体积比0.5~1%的接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后24-26℃培养48h。
发酵过程中通过HPLC检测FR901379发酵单位，色谱条件如下：
测定柱：C18柱，4.6mm×250mm×5um
柱温：40℃
流动相为乙腈:0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液=50:50（V/V），采用等度洗脱，流速为1.0mL/min
检测器为DAD或VWD，测定波长210nm；溶样溶剂为甲醇，进样浓度为500ug/mL，进样量为20uL，运行时间为30min。
FR901379主峰的保留时间tＲ=13.28min，理论塔板数N=6979。
用外标法测定其浓度或含量。
实施例1
将培养好的种子以3%比例转入30L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：果糖130、玉米蛋白粉17、干酪素8、酵母蛋白胨8、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.75、碳酸钙3、消泡剂1，其余为水。
发酵过程中温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速150rpm，过程中调控转速150~600rpm之间使溶氧不低于20%。
将果糖配制成500g/L水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵90h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，138h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(L)比为果糖80、双氧水0.5。发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3.2g/L。
实施例2
将培养好的种子以3%比例转入300L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：果糖140、玉米蛋白粉15、干酪素7.5、酵母蛋白胨9、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.8、碳酸钙3、消泡剂1，其余为水。
发酵过程中温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速80rpm，过程中调控转速80~250rpm之间使溶氧不低于20%。
将果糖配制成500g/L水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵80h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，152h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(L)比为果糖120、双氧水1.3。发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3g/L。
实施例3
将培养好的种子以2.5%比例转入3000L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：果糖150、玉米蛋白粉20、干酪素7.5、酵母蛋白胨5、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.6、碳酸钙3、消泡剂0.7，其余为水。
发酵过程中温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速60rpm，过程中调控转速60~200rpm之间使溶氧不低于20%。
将果糖配制成500g/L水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵76h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，136h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(L)比为果糖100、双氧水1.2。发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3.3g/L。
实施例4
将培养好的种子以2%比例转入12000L的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比为：果糖140、玉米蛋白粉10、干酪素6、酵母蛋白胨7、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.5、碳酸钙3、消泡剂0.5，其余为水。
发酵过程中温度24-26℃，通气量1VVM，初始转速50rpm，过程中调控转速50~180rpm之间使溶氧不低于20%。
将果糖配制成500g/L水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵72h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，144h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(L)比为果糖120、双氧水1.5。发酵周期为8天，测定FR901379放罐浓度为3.4g/L。

Claims (6)

1.一种发酵生产FR901379的培养基，其特征在于，所述培养基包含按以下质量份计各组分：
。
2.如权利要求1所述的发酵生产FR901379的培养基，其特征在于，所述培养基包含按以下质量份计各组分：
。
3.一种用于菌株Coleophoma empetri发酵生产FR901379的培养基，其特征在于，所述培养基为权利要求1和2任一项所述的培养基。
4.一种用权利要求1~2任一项所述的培养基获得FR901379的方法，包含在发酵过程中补加按以下质量份计各组分：
其中，发酵培养菌株为Coleophoma empetri。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，在发酵过程中补加按以下质量份计的80~120份果糖、0.5~1.5份双氧水，其特征在于，在发酵72至96小时间开始补加，补加时间为48至72小时。
6.如权利要求4所述方法，其特征在于，在发酵过程中补加按以下质量份计的80~120份果糖、0.5~1.5份双氧水，其特征在于，补加方式为连续型，控制补加量，持续不间断的补加。
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