CN103695496A - 发酵生产他克莫司的方法 - Google Patents

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本发明提供一种发酵生产他克莫司的方法，属于生物医药领域。本发明提供的发酵生产他克莫司的方法中，对菌种活化的斜面培养基组份、液体培养基组份、种子液接种量、发酵培养基组份等参数进行优化，维持链霉菌的生长活性和发酵活性，提高他克莫司的生产量；在发酵过程中，向发酵培养基中添加哌啶酸，并对其添加时间和添加量等添加方式进行优化，减少了产物的反馈抑制，同时增加了终产物他克莫司的产量，使他克莫司的终产量达到385μg/mL。

Description

发酵生产他克莫司的方法
 
技术领域
    本发明属于生物医药领域，具体涉及一种发酵生产他克莫司的方法。
背景技术
近十多年来，我国器官移植发展迅速，已跃居亚洲首位，世界第二。用于器官移植后减少排异反应的免疫抑制剂类药物也呈现快速的增长，普遍用于预防抑制排斥的免疫抑制剂是环孢菌素，但是其使用常常伴随着副作用。开发新型免疫抑制剂变得尤为需要，目前一种新型的免疫抑制剂他克莫司使用正日渐广泛。
他克莫司(Tacrolimus) 又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984 年从土壤放线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制特性。其预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。他克莫司能减少肝肾移植受体的急、慢性排斥反应。用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢素治疗者低，尤其是该药品有较强的亲肝性，对肝移植的功效比环孢素高100 倍，因而大大降低了临床使用剂量，可降低原治疗费用1/3 ～1/2。FK-506 和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。
目前有关他克莫司生产方法的报道不多，主要有美国专利US.4,894,366，US.4929611，US5,116,756，US5,264,355，US.5,496,727 和US5,624,842。这些专利报道了用不同的链霉菌株生产他克莫司，产量不是很高，US5,116,756 专利中提到的streptomycessp.MA6858 和US5,624,842 中提到的streptomyces tsukubaensis 的他克莫司生产菌株，生产他克莫司的产量都很低，其发酵液中他克莫司的浓度最高只有37.8mg/L，导致工业化生产以后产品的成本很高，给患者造成沉重的负担。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种利用CN1876822公开了的链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288进行发酵生产他克莫司的方法，采用如下技术方案：
一种发酵生产他克莫司的方法，包括以下内容：
a. 制备链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288的种子液：将保藏的链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288菌株接种在斜面培养基上，30℃培养50h，然后接种于液体培养基中，在30℃的摇床中培养50h，即得所述的链霉菌种子液；
b. 接种：将步骤a中得到的种子液接种发酵培养基中，接种量为1%；
c. 发酵培养：将步骤b中得到的接种后的培养基进行发酵培养，发酵培养温度为28～30℃；
d. 补加哌啶酸：当发酵培养120h以后，于每升发酵液中以0.1～1ml//h的流速往发酵罐中补料流加1.0%的哌啶酸溶液；
e. 发酵结束并分离：当发酵培养140～192h以后，结束发酵，将得到的发酵液进行提取分离，即得所述的他克莫司。
优选地，步骤a中所述的斜面培养基包括以下重量百分比的组份：葡萄糖10%，麦芽粉20%，酵母粉5%，氯化钠1.5%，琼脂15%，余量为去离子水。
优选地，步骤a中所述的液体培养基包括以下重量百分比的组份：葡萄糖10%，玉米粉20%，酵母粉5%，可溶性淀粉20%，甘油15%，碳酸钙2%，余量为去离子水。
优选地，步骤a中所述的摇床的转速为100~300rpm。
优选地，步骤b中所述的发酵培养基包括以下重量百分比的组份：酵母粉1.5%，可溶性淀粉40%，玉米浆30%，甘油20%，磷酸氢二钾1.5%，碳酸钙2%，余量为去离子水。
优选地，步骤c中所述的发酵培养的转速为150~200rpm。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供的发酵生产他克莫司的方法中，对菌种活化的斜面培养基组份、液体培养基组份、种子液接种量、发酵培养基组份等参数进行优化，维持链霉菌的生长活性和发酵活性，提高他克莫司的生产量；在发酵过程中，向发酵培养基中添加哌啶酸，并对其添加时间和添加量等添加方式进行优化，减少了产物的反馈抑制，同时增加了终产物他克莫司的产量，使他克莫司的终产量达到385μg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
制备斜面培养基：称取葡萄糖10g，麦芽粉20g，酵母粉5g，氯化钠1.5g，琼脂15g，用去离子水定容至1L，在0.1MPa下灭菌30min，即得。
制备液体培养基：称取葡萄糖10g，玉米粉20g，酵母粉5g，可溶性淀粉20g，甘油15g，碳酸钙2g，用去离子水定容至1L，在0.1MPa下灭菌30min，即得。
制备发酵培养基：称取酵母粉1.5g，可溶性淀粉40g，玉米浆30g，甘油20g，磷酸氢二钾1.5g，碳酸钙2g，用去离子水定容至1L，在0.1MPa下灭菌30min，即得。
实施例2
利用实施例1中提供的各种培养基进行下面的发酵生产他克莫司的方法，包括以下内容：
a. 制备链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288的种子液：将保藏的链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288菌株接种在斜面培养基上，30℃培养50h，然后接种于液体培养基中，在30℃的摇床中培养50h（摇床的转速为100~300rpm），即得所述的链霉菌种子液；
b. 接种：将步骤a中得到的种子液接种发酵培养基中，接种量为1%；
c. 发酵培养：将步骤b中得到的接种后的培养基进行发酵培养，发酵培养温度为28～30℃，发酵培养的转速为150~200rpm；
d. 补加哌啶酸：当发酵培养120h以后，于每升发酵液中以0.1～1ml//h的流速往发酵罐中补料流加1.0%的哌啶酸溶液；
e. 发酵结束并分离：当发酵培养140～192h以后，结束发酵，将得到的发酵液中他克莫司的浓度高达385μg/mL，然后将发酵液进行提取分离，即得所述的他克莫司。

Claims (6)

1.一种发酵生产他克莫司的方法，包括以下内容：
制备链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288的种子液：将保藏的链霉菌(Streptomyces sp1908)CGMCC No.1288菌株接种在斜面培养基上，30℃培养50h，然后接种于液体培养基中，在30℃的摇床中培养50h，即得所述的链霉菌种子液；
接种：将步骤a中得到的种子液接种发酵培养基中，接种量为1%；
发酵培养：将步骤b中得到的接种后的培养基进行发酵培养，发酵培养温度为28～30℃；
补加哌啶酸：当发酵培养120h以后，于每升发酵液中以0.1～1ml//h的流速往发酵罐中补料流加1.0%的哌啶酸溶液；
e. 发酵结束并分离：当发酵培养140～192h以后，结束发酵，将得到的发酵液进行提取分离，即得所述的他克莫司。
2.根据权利要求1所述的发酵生产他克莫司的方法，其特征在于步骤a中所述的斜面培养基包括以下重量百分比的组份：葡萄糖10%，麦芽粉20%，酵母粉5%，氯化钠1.5%，琼脂15%，余量为去离子水。
3.根据权利要求1所述的发酵生产他克莫司的方法，其特征在于步骤a中所述的液体培养基包括以下重量百分比的组份：葡萄糖10%，玉米粉20%，酵母粉5%，可溶性淀粉20%，甘油15%，碳酸钙2%，余量为去离子水。
4.根据权利要求1所述的发酵生产他克莫司的方法，其特征在于步骤a中所述的摇床的转速为100~300rpm。
5.根据权利要求1所述的发酵生产他克莫司的方法，其特征在于步骤b中所述的发酵培养基包括以下重量百分比的组份：酵母粉1.5%，可溶性淀粉40%，玉米浆30%，甘油20%，磷酸氢二钾1.5%，碳酸钙2%，余量为去离子水。
6.根据权利要求1所述的发酵生产他克莫司的方法，其特征在于步骤c中所述的发酵培养的转速为150~200rpm。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219658A (zh) * 2015-10-29 2016-01-06 无锡福祈制药有限公司 一种快速高效筛选他克莫司高产菌株的方法
CN106755168A (zh) * 2016-11-28 2017-05-31 无锡福祈制药有限公司 一种发酵生产他克莫司发酵的方法
CN108220359A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 天津大学 利用化学触发剂提升fk506产量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1876822A (zh) * 2005-06-06 2006-12-13 上海市农药研究所 他克莫司的产生菌株及生产方法
EP2272963A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-12 LEK Pharmaceuticals d.d. Process for Preparation of Tacrolimus
CN103060248A (zh) * 2011-10-19 2013-04-24 中国科学院上海有机化学研究所 一种构建基因工程fk506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1876822A (zh) * 2005-06-06 2006-12-13 上海市农药研究所 他克莫司的产生菌株及生产方法
EP2272963A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-12 LEK Pharmaceuticals d.d. Process for Preparation of Tacrolimus
CN103060248A (zh) * 2011-10-19 2013-04-24 中国科学院上海有机化学研究所 一种构建基因工程fk506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JADWIGA TURLO ET AL: "Enhancement of tacrolimus productivity in Streptomyces tsukubaensis by the use of novel precursors for biosynthesis", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219658A (zh) * 2015-10-29 2016-01-06 无锡福祈制药有限公司 一种快速高效筛选他克莫司高产菌株的方法
CN106755168A (zh) * 2016-11-28 2017-05-31 无锡福祈制药有限公司 一种发酵生产他克莫司发酵的方法
CN108220359A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 天津大学 利用化学触发剂提升fk506产量的方法
CN108220359B (zh) * 2018-01-29 2021-12-21 天津大学 利用化学触发剂提升fk506产量的方法

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