CN105219658A - 一种快速高效筛选他克莫司高产菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
发明提供了一种基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：(1)取他克莫司产生菌孢子悬液涂布于固体培养基上，于25-30℃下培养9-12天；(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板的板孔中，于25-30℃下培养并离心处理；(3)培养至8-32h，向96孔板的每个板孔中添加0.5％-1.5％的油；(4)培养至36-54h，测定脂肪酶活性确认筛选结果。在发酵过程中，向培养基中添加油，他克莫司产生菌代谢油时脂肪酶活力发生变化，以脂肪酶活力为指标，筛选出酶活力高的菌株，可大大减轻工作量，提高筛选效率，并且操作程序简单，方法稳定，重现性好。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的方法。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus)又名FK506，日本藤泽制药公司于1984年从土壤放线菌中提取的一种新型的免疫抑制剂，是一种23元大环内酯聚酮类免疫抑制剂，分子式C44H69NO12，结构式如下所示：
他克莫司与其他免疫抑制剂如雷帕霉素和环孢霉素等对预防器官移植中所出现的排斥反应具有很好的效果，其临床效果比环孢霉素强100倍，因而能够大大降低临床使用剂量，而且毒副作用比环孢霉素低。他克莫司还广泛应用于特应性皮炎、银屑病、红斑狼疮、白癜风、扁平苔藓等自身免疫疾病。
自他克莫司发现以来，国内外对他克莫司进行了基础和临床研究，于1994被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。然而他克莫司市场大部分被欧美国家占领。目前国内研究他克莫司主要围绕自然筛选，原始菌株诱变，优化发酵培养基及培养条件，但筛选高产菌株耗时比较久。因此，开发一种新型的能够高效、快速、准确筛选他克莫司高产菌株的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于公开一种快速筛选他克莫司高产菌株的方法，用以克服现有技术中的筛选方法所存在的他克莫司高产菌株少以及筛选时间久的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：
步骤(1)取他克莫司产生菌孢子悬液涂布于固体培养基上，于25-30℃下培养9-12天；
步骤(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板的板孔中，于25-30℃下培养，所述96孔板固定于离心机中进行离心处理，所述离心机的转速为200-300r/min；
步骤(3)培养至8-32h，向96孔板的每个板孔中添加0.5％-1.5％的油，直至形成平整的油膜；
步骤(4)培养至36-54h，测定脂肪酶活性，根据脂肪酶活性数据判断不同板孔中他克莫司产量，确认筛选结果。
在一些实施例中，步骤(1)中的固体培养基组分(g/L)为：麦芽汁粉10-20，酵母膏粉3-8，葡萄糖5-15，琼脂18-22，pH6.0-8.0。
在一些实施例中，步骤(2)中的发酵培养基组分(g/L)具体为：
玉米淀粉45-55，酵母粉5-15，玉米浆5-15，K2HPO41-5，KH2PO41-5，CaCO31-5，pH6.0-8.0。
在一些实施例中，步骤(2)中的发酵培养基添加量为0.1-0.2mL。
在一些实施例中，步骤(3)中的油选自玉米油、大豆油或者花生油。
在一些实施例中，步骤(4)中的测定脂肪酶活性具体为采用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在发酵过程中，向培养基中添加油，他克莫司产生菌代谢油时脂肪酶活力发生变化，以脂肪酶活力为指标，筛选出酶活力高的菌株，从而得到他克莫司高产菌株，因此能够大大减轻工作量，提高筛选效率，并且操作程序简单，方法稳定，重现性好。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
该基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：步骤(1)取他克莫司产生菌孢子悬液涂布于固体培养基上，于25-30℃下培养9-12天；步骤(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板的板孔中，于25-30℃下培养，所述96孔板固定于离心机中进行离心处理，所述离心机的转速为200-300r/min；步骤(3)培养至8-32h，向96孔板的每个板孔中添加0.5％-1.5％的油，直至形成平整的油膜；步骤(4)培养至36-54h，测定脂肪酶活性，根据脂肪酶活性数据判断不同板孔中他克莫司产量，确认筛选结果。
使用本专利中的筛选方法，检测出他克莫司高产菌株结果只需要2-3天，通过脂肪酶活力的高低来判断他克莫司菌株产量的高低；而现有技术中的他克莫司菌株的筛选方法，通过摇瓶培养，需要7天，且使用高效液相色谱进行检测，检测时间长。
实施例一：
步骤(1)取他克莫司产生菌孢子悬液，涂布于固体培养基上，25℃下培养9天；
步骤(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板的板孔中，96孔板每个板孔中发酵培养基的添加量为0.1mL，并将该96孔板固定于离心机中进行离心处理，离心机的转速为200r/min，并于25℃下培养；
步骤(3)培养至8h，向孔板中添加相当于发酵培养基体积的1％的玉米油，直至形成平整的油膜；
步骤(4)培养至36h，使用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性，根据脂肪酶活力大小判断不同孔板中他克莫司产量，初步确认筛选结果。
在本实施例中，该固体培养基组分(g/L)：麦芽汁粉10，酵母膏粉3，葡萄糖5，琼脂18，pH6.0；发酵培养基组分(g/L)：玉米淀粉45，酵母粉5，玉米浆5，K2HPO41，KH2PO41，CaCO31，pH6.00。
在本实施例中，采用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性所得到的脂肪酶活力数据参下表1所示。
表1：实施例一中对96孔板采用pNPP分光光度法法测定的脂肪酶活力数据
实施例二：
步骤(1)取他克莫司产生菌孢子悬液，涂布于固体培养基上，30℃下培养12天；
步骤(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板中，96孔板每个板孔中发酵培养基的添加量为0.2mL，并将该96孔板固定于离心机中进行离心处理，离心机的转速为300r/min，并于30℃下培养；
步骤(3)培养至32h，向孔板中添加相当于发酵培养基体积的3％的大豆油，直至形成平整的油膜；
步骤(4)培养至54h，使用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性，根据脂肪酶活力大小判断不同孔板中他克莫司产量，初步确认筛选结果。
在本实施例中，固体培养基组分(g/L)：麦芽汁粉20，酵母膏粉8，葡萄糖15，琼脂22，pH8.0；发酵培养基组分(g/L)：玉米淀粉55，酵母粉15，玉米浆15，K2HPO45，KH2PO45，CaCO35，pH8.0。
在本实施例中，采用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性所得到的脂肪酶活力数据参下表2所示。
表2：实施例二中对96孔板采用pNPP分光光度法法测定的脂肪酶活力数据
实施例三：
步骤(1)取他克莫司产生菌孢子悬液，涂布于固体培养基上，28℃下培养10天；
步骤(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板中，96孔板每个板孔中发酵培养基的添加量为0.15mL，并将该96孔板固定于离心机中进行离心处理，离心机的转速为230r/min，并于28℃下培养；
步骤(3)培养至12h，向孔板中添加相当于发酵培养基体积的2％的花生油，直至形成平整的油膜；
步骤(4)培养至48h，使用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性，根据脂肪酶活力大小判断不同孔板中他克莫司产量，初步确认筛选结果。
在本实施例中，固体培养基组分(g/L)：麦芽汁粉15，酵母膏粉5，葡萄糖10，琼脂20，pH7.0；发酵培养基组分(g/L)：玉米淀粉50，酵母粉10，玉米浆10，K2HPO43，KH2PO43，CaCO32，pH7.0。
在本实施例中，采用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性所得到的脂肪酶活力数据参下表3所示。
表3：实施例三中对96孔板采用pNPP分光光度法法测定的脂肪酶活力数据
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：
步骤(1)取他克莫司产生菌孢子悬液涂布于固体培养基上，于25-30℃下培养9-12天；
步骤(2)在固体培养基上逐个挑取单菌落，分别接种至装有发酵培养基的96孔板的板孔中，于25-30℃下培养，所述96孔板固定于离心机中进行离心处理，所述离心机的转速为200-300r/min；
步骤(3)培养至8-32h，向96孔板的每个板孔中添加0.5％-1.5％的油，直至形成平整的油膜；
步骤(4)培养至36-54h，测定脂肪酶活性，根据脂肪酶活性数据判断不同板孔中他克莫司产量，确认筛选结果。
2.根据权利要求1所述的基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中的固体培养基组分(g/L)为：麦芽汁粉10-20，酵母膏粉3-8，葡萄糖5-15，琼脂18-22，pH6.0-8.0。
3.根据权利要求1所述的基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中的发酵培养基组分(g/L)具体为：
玉米淀粉45-55，酵母粉5-15，玉米浆5-15，K2HPO41-5，KH2PO41-5，CaCO31-5，pH6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中的发酵培养基添加量为0.1-0.2mL。
5.根据权利要求1所述的基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中的油选自玉米油、大豆油或者花生油。
6.根据权利要求1所述的基于96孔板高通量筛选他克莫司高产菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中的测定脂肪酶活性具体为采用pNPP分光光度法法测定脂肪酶活性。
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