CN105969670B - 一种桑黄菌株及其选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种桑黄菌株，以及该桑黄菌株的选育方法：原生质体的制备与诱变；诱变菌株的筛选；诱变菌株的鉴定。本发明选育得到的桑黄菌株摇瓶生物量达到17.92g/L，比原始出发菌株提高9.51％。黄酮产量达到0.47g/L，多糖产量达到3.57g/L分别比原始出发菌株提高52.16％和67.95％。生物产量及代谢活性物产量也显著高于亲本菌株SH1，且清除自由基的能力有显著提高。

Description

一种桑黄菌株及其选育方法
技术领域
本发明属于生物技术和微生物诱变育种领域，具体涉及一种桑黄菌株及其选育方法。
背景技术
桑黄是一种大型珍稀药用真菌，属真菌界、担子菌门、伞菌纲、锈革孔菌科。桑黄具有抑制肿瘤、抗衰老、抗氧化以及增强细胞免疫能力等生理功能，其主要的活性物质为桑黄多糖和小分子的黄酮类物质。随着社会经济发展水平的提高，国内外市场对桑黄的需求量急剧增加，而野生桑黄资源极其有限，采用液体发酵技术大规模生产桑黄菌丝体是满足国内外市场需求的有效途径，而发酵获得的桑黄菌丝体的产量及其活性的高低在很大程度上取决于桑黄菌种的优劣。
与其它食用菌相比，桑黄菌株极易发生衰退，从而使其产量及菌株活性降低。桑黄菌株多糖和黄酮产量降低，则无法满足市场的需求。
ARTP(常温常压等离子)诱变技术使用等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用ARTP能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株。
目前尚未见到有关采用ARTP技术诱变桑黄菌株的任何报道。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种桑黄菌株，该菌株的保藏号为：CGMCC No.12242，其分类命名：桑黄，拉丁文学名：Phellinus igniarius，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月21日。
本发明还提供了上述桑黄菌株的选育方法，该方法包括如下步骤：
(1)原生质体的制备与诱变：
将SH1菌种接种于PDB液体培养基上，静置培养6～8d，获得菌丝体；
菌丝体用1％溶壁酶和0.25％崩溃酶30℃酶解2.5～3h，获得原生质体；
原生质体稀释至106个/mL，涂于载片上，置于氦气处理源下，进行ARTP诱变处理；(2)诱变菌株的筛选：
诱变处理的菌液，放入0.6mol/L的甘露醇缓冲液中，震荡混匀，然后涂抹于再生培养基上生长8～10d；
挑取再生菌株于新的平板之上，通过生长速度、生长状态、摇瓶生物量、连续传代观测实验，选取生长速度快、生物量高、遗传稳定的菌株；
然后通过测定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶筛选出抗氧化能力强的菌株；
(3)诱变菌株的鉴定
通过拮抗实验、DNA随机引物扩增、醇提物HPLC指纹图谱分析检测，鉴定诱变菌株是有别于SH1菌株的新菌株。
本发明具有以下优点：
本发明通过ARTP技术诱变得到的桑黄菌株，通过菌丝生长速度、摇瓶生物量、超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶酶活对诱变菌株进行筛选，获得新的优良变异菌株。得到的桑黄新菌株的生物量及代谢活性物产量均有大幅度上升。黄酮产量提升52.16％，多糖产量提升67.95％。
附图说明
图1ARTP致死率曲线
图2RAPD引物序列
图3RAPD扩增图谱
其中M为Marker，CK为出发菌株SH1，bp为碱基对
图4菌株HPLC分析
具体实施方式
为了对本发明有更深入的了解，现结合具体的应用实例对本发明做进一步的说明：
亲本菌株桑黄SH1菌株来源于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心，编号为：3249。
本实验所使用培养基配方：
固体培养基：取桑树枝20g加入蒸馏水1L，煮沸1h，过滤取上清液加入PDA(马 铃薯葡萄糖琼脂培养基购于BD公司)粉末39g，121℃灭菌20min备用。
液体培养基：取桑树枝20g加入蒸馏水1L，煮沸1h，过滤取上清液加入PDB(马铃薯葡萄糖肉汤培养基购于BD公司)粉末24g，121℃灭菌20min备用。
原生质体再生培养基：取桑树枝20g加入蒸馏水1L，煮沸1h，过滤取上清液加入PDA粉末39g，甘露醇109.2g，121℃灭菌20min倒平板备用。
实施例1：原生质体的制备与诱变
(1)菌株的活化及培养将斜面菌种SH1转接到PDA平板中，26℃培养箱中培养8～10d。挑取平板菌丝于匀浆器中，加入少量液体培养基，匀浆打碎，接种于100mL液体培养基中，26℃恒温，静置培养10d，期间每天轻微震荡菌丝2～3次。
(2)原生质体的制备过滤收集静置培养菌丝，无菌水冲洗1～2次，无菌吸水纸将菌丝表面水分吸干。按照每0.3g菌丝加入1mL酶液(0.12g溶壁酶(购于广东省微生物研究所)、0.03g崩溃酶(购于Sigma)溶于12mL 0.6mol/L的甘露醇溶液中，经0.2μm细菌过滤器过滤除菌)，30℃，80r/min，酶解3h。用G-3砂芯漏斗过滤，将收集的滤液在4℃、3000r/min条件下离心10min，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤2～3次，得到纯化的原生质体。
(3)原生质体诱变按上述方法制备原生质体，通过血球计数板计数将原生质体稀释至1×106个/mL，取20μL原生质体均匀涂于载片上，至于氦气处理源下，处理距离2mm、功率为120W、气流量为8SLM、处理时间10s、20s、30s、40s、50s。计算其在不同处理时间下的致死率曲线。其结果见图1。图1显示，随着处理时间的增加，致死率不断提高，在50s处达到100％。在20s～30s时菌株的诱变致死率在50％～70％内，为最适诱变剂量。
实施例2：诱变菌株的筛选
(1)诱变菌株的初筛取诱变之后菌液100μL均匀涂布于再生培养基上，26℃培养箱中培养7～10d后，诱变菌株再生出来，挑取菌落较大，菌丝密集的诱变菌株，用直径0.6cm打孔器定量接种于新的PDA平板之上，培养10d后，统计菌丝生长速度。以30株未诱变原生质体再生菌株平均生长速度为对照，选取菌丝生长速度大于出发菌株的诱 变诱变菌株，进行传代实验。每代测其菌丝生长速度，传代5次，选取菌丝生长速度快，遗传稳定的优秀菌株10株。
(2)诱变菌株的复筛取上述步骤中筛出的10株优秀菌株，用直径0.6cm的打孔器定量接种5～6块于100mL液体培养基内，培养10～12d，菌丝体清洗过滤冻干，测其摇瓶生物量。选取生物量增长大于5％的菌株共5株如下表1。
表1 5株诱变菌株的生物量值
Figure BDA0001009509520000041
测上述5株菌株菌丝体胞内超氧化物歧化酶(SOD)和酸性磷酸酶酶活(ACP)。SOD酶活按照NBT法测定，ACP酶活使用对硝基酚法测定。
比较菌株SOD和ACP酶活，与菌丝生长速度一起代入生物量模型：
BYield＝2.68BPDA+0.052BSOD+0.399BACP-0.894
按菌丝模拟产量大小排序，结果如下表所示2，A67>A41>A1>A54>SH1。选取最优菌株为A67。
表2 5株诱变菌株的模拟产量
Figure BDA0001009509520000042
实施例3：诱变菌株的鉴定及产量测定
(1)菌株诱变鉴定
拮抗实验：拮抗实验是一种可以快速鉴定菌株之间遗传差异的方法，不仅可以用来 确定不同种菌株之间的关系，也可以用来鉴定同种的菌株是否产生了变异。结果显示，诱变菌株A67与原始出发菌株SH1产生了明显的拮抗现象，从菌丝形态方面证实了菌株的遗传物质发生了改变。
RAPD随机引物扩增：
采用CTAB法提取诱变菌株和出发菌株的DNA，从52条RAPD引物中筛选出12条重复性较好，可以反映菌株之间差异的引物(引物序列具体见图2)。
RAPD-PCR扩增体系：
Figure BDA0001009509520000051
RAPD-PCR扩增条件：
Figure BDA0001009509520000052
具体条带差异见图3。图3中可以明显看出诱变菌株A67与出发菌株SH1在S44、S39、S35、S15几条引物下的电泳条带具有较为显著的差异，出现了多条条带的增添和消失，电泳结果在分子水平证实了突变菌株A67与出发菌株SH1的遗传物质发生了显著地改变。
菌丝体醇提物HPLC分析：取A67菌丝体2g，加入80％乙醇40mL，超声提取2h，10000r/min离心取上清液，离心浓缩得到其醇提物。取醇提物样品10mg，溶于1mL甲醇中，10000r/min离心10min，过0.22μm有机膜，上清上样。使用反相C18色谱柱，流动相由A，B两部分组成，A相：超纯水(+0.1％冰醋酸)，B相：乙腈，流速： 1mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μL。按下列表3中的程序进行洗脱：
表3HPLC洗脱程序
Figure BDA0001009509520000061
结果如图4所示，诱变菌株A67与出发菌株SH1的液相图谱发生了较大差异。与SH1菌株的图谱相比，A67菌株产生多个新峰，说明与出发菌株相比，A67产生了新的次级代谢产物。除此，从峰的高低、峰面积可以看出A67菌株次级代谢物的产量与出发菌株相比也有较大程度的提升。此结果从代谢产物方面验证了A67菌株是优于出发菌株的新菌株。
(2)出发菌株与A67菌株产量及活性测定
胞内多糖含量测定：胞内多糖含量测定采用总糖减还原糖的方法测定，胞内总糖含量采用苯酚-硫酸法测定；胞内还原糖采用DNS法测定。
黄酮含量测定：分别取桑黄菌株冻干菌丝体1g加入到25ml容量瓶中，80％乙醇定容至刻度，超声提取2-3h，醇提物1000r/min离心10min，取上清备用。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法，测定黄酮类化合物含量，每个样品做3次重复。
测定结果见如下表4。
表4多糖和黄酮测量结果
Figure BDA0001009509520000062
清除自由基能力测定
通过化学发光法测定诱变菌株与原始菌株菌丝体的醇提物，对超氧阴离子和过氧化 氢的清除作用。IC50值表示清除50％自由基时，样品浓度的大小。IC50值与清除自由的能力负正相关，即IC50值越小，其清除自由基的能力越强。结果见如下表5，表明：诱变菌株A67的醇提物对过氧化氢和超氧阴离子的清除作用都要优于出发菌株，诱变菌株相比分别提升40.17％和29.45％。
表5清除自由基能力测定结果
Figure BDA0001009509520000071
综合上述实施例结果表明，经ARTP技术诱变后得到的新菌株A67经多种鉴定方法综合认定明显有别于亲本菌株SH1，其多糖和黄酮产量明显增高，生物产量及代谢活性物产量也显著高于亲本菌株SH1，且清除自由基的能力有显著提高。

Claims (1)

1.一种桑黄菌株，其特征在于，所述桑黄菌的保藏编号为CGMCC No.12242。
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