CN106381277A

CN106381277A - 一种利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素b1的方法

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Publication number: CN106381277A
Application number: CN201610799968.4A
Authority: CN
Inventors: 刘晓璐; 许倩倩; 吕乐; 闫海; 丁涛; 尹春华; 张海洋
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2036-08-31
Also published as: CN106381277B

Abstract

本发明涉及一种利用地衣芽孢杆菌及其产生的酶去除黄曲霉毒素B1的方法。本发明通过发酵培养地衣芽孢杆菌BL010株获得的地衣芽孢杆菌BL010菌剂，以及通过超声波破碎地衣芽孢杆菌BL010细胞所获得的地衣芽孢杆菌BL010酶制剂均能够对生物材料中的AFB1进行高效降解。采用本发明的地衣芽孢杆菌BL010菌剂以及酶制剂可以达到快速、安全和高效生物降解去除生物材料中AFB1的目的。本发明方法对AFB1的降解条件温和，最适反应温度为30℃，不会对产品品质造成破坏。

Description

一种利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种利用地衣芽孢杆菌及其产生的酶去除黄曲霉毒素B1的方法。

背景技术

黄曲霉毒素具有强毒性、强致畸性和强致突变性，是危害最大的真菌毒素之一，不仅对粮食和饲料造成污染，而且严重危害人和动物的健康。在黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，简称：AFB1)最为常见，危害性也最强，已经给相关行业带来巨大的经济损失。国家质检总局规定食品中AFB1为必检项目，中国食品卫生标准规定了几种主要易受污染食物中的最大允许量标准：玉米、花生、花生油≤20μg/kg；食用油为≤10μg/kg；其他粮食、豆类、发酵食品为≤5μg/kg。

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物，其中包括多种衍生物，目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇，其中AFB1的致癌、致畸和致突变毒性最强。黄曲霉毒素的基本结构为二氢呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，分别与毒性和致癌性有关。黄曲霉毒素不仅抑制蛋白质的合成，而且干扰信息RNA和DNA的合成，导致动物全身性损害。黄曲霉毒素主要攻击靶位为肝脏，可导致肝炎、肝硬化、肝坏死和肝癌。

黄曲霉毒素可溶于多种极性有机溶剂如氯仿、甲醇和乙醇中，但难溶于水，在光、热和酸性条件下稳定，当温度达到280℃以上才发生裂解。由于黄曲霉毒素结构稳定，传统的物理化学方法很难将其高效去除。与物化方法相比，生物降解具有成本低、条件相对温和不会对产品品质造成破坏等优点，因此是一种高效去除黄曲霉毒素的方法。AFB1具有环状结构，属于难生物降解的化合物，目前对其进行生物降解的研究并不多见。伊朗学者MohsenFarzaneh等从开心果中筛选出了一株枯草芽孢杆菌，在35-40℃条件下24h内对开心果中AFB1的降解去除率高达95％，其粗酶的降解效率为78.4％。中国学者曹洪等从假蜜环菌多酶复合体中成功分离纯化出一种新的黄曲霉毒素降解酶，能够催化断裂二氢呋喃环。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够高效生物降解AFB1的细菌菌株，可以快速高效生物降解去除生物质材料中的AFB1。

本发明的目的之二是提供一种上述菌株的培养方法，利用此方法对上述菌株进行发酵培养，所获得的培养物具有较高的光密度和细胞菌落形成单位(CFU)。

本发明的目的之三是提供一种利用上述菌株有效去除黄曲霉毒素B1的方法。

一种地衣芽孢杆菌菌株，名称为地衣芽孢杆菌BL010株(Bacilluslicheniformis,Strain BL010)，保藏编号为：CGMCC NO.12898，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2016年8月24日。所述菌株的特征在于能够高效生物降解黄曲霉毒素B1(AFB1)。

一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，具体制备步骤为：

步骤A，提取地衣芽孢杆菌BL010株，保藏编号为：CGMCC NO.12898，菌株能够生物降解黄曲霉毒素B1；所述的地衣芽孢杆菌菌株的16S rDNA的同源性至少为90％的菌株；

步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵培养物；发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；

步骤C，对发酵培养物进行离心分离处理，获得地衣芽孢杆菌湿菌体，地衣芽孢杆菌湿菌体再经过重悬、细胞破碎处理和离心分离处理获得酶制剂。

步骤B所述发酵培养物的光密度(OD_680nm)≥40；所述发酵培养物的细胞菌落形成单位(CFU)≥100亿/mL，优选步骤A所述的地衣芽孢杆菌菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株。

进一步的所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

进一步的所述发酵培养基的pH值为6.5-8.0，优选发酵培养基的pH值为6.5-7.2。

一种利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，将制得的酶制剂与含有黄曲霉毒素B1的生物质材料混合后生物降解去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1；其中所述生物质材料包括饲料和粮食。

进一步的所述生物材料中黄曲霉毒素B1的含量为20μg/kg-20mg/kg；生物材料中水的质量含量为1％-20％，优选生物材料中水的质量含量为16.7％-20％。

进一步的所述生物降解的温度为20-35℃，基于生物质材料总重量计，所述菌剂的用量为0.1wt％-1wt％，酶制剂的用量为0.5v％-5v％。优选生物降解的温度为25-30℃；基于生物质材料总重量计，所述菌剂的用量为0.2wt％-0.5wt％；所述酶制剂的用量为0.5v％-2v％；所述酶制剂的蛋白浓度为400-500mg/L。

采用本发明的地衣芽孢杆菌BL010菌剂以及酶制剂可以达到快速、安全和高效生物降解去除生物材料中AFB1的目的。本发明方法对AFB1的降解条件温和，最适反应温度为30℃，不会对产品品质造成破坏。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1为地衣芽孢杆菌BL010基于16S rDNA的分子进化树。

图2为地衣芽孢杆菌BL010优化培养生长曲线。

图3为地衣芽孢杆菌BL010生物降解玉米中AFB1的动力学过程图。

图4为地衣芽孢杆菌BL010粗酶生物降解玉米中AFB1的动力学过程图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。

为寻求安全高效去除黄曲霉毒素B1的新途径，本发明人经过不懈的研究探索，终于从长期遭受黄曲霉毒素污染的玉米中成功筛选出了一株具备生物降解AFB1能力的微生物菌种，经分离鉴定为地衣芽孢杆菌BL010(Bacillus licheniformis strain BL010)，检测结果表明，该菌株对AFB1具有较高的生物降解能力；进一步研究发现，细胞破碎后获得的粗酶具备更高的生物降解AFB1活性，这些发现为进一步高效去除粮食和饲料中AFB1的应用奠定了良好基础。本发明正是基于上述发现作出的。

因此，本发明第一方面所涉及的地衣芽孢杆菌菌株能够高效、快速地生物降解黄曲霉毒素B1，其采用以下筛选培养基进行筛选和培养获得，该培养基的组成如下(1000mL去离子水中)：

本发明筛选用于生物降解AFB1的地衣芽孢杆菌菌株的方法包括以下步骤：

(1)按照上述培养基组成配制培养基，并采用氢氧化钠和盐酸溶液调整上述培养基的初始pH至7.0。在50ml三角瓶中加入0.5ml的200mg/L的AFB1乙醇标准原液，采用吹风机吹干乙醇后，加入5.0ml无机培养基配制成以AFB1为唯一有机碳源的筛选培养基。经高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。在液体培养基中加入1.5％(重量/体积)的琼脂，经过高温高压灭菌溶解后倒入到培养皿中冷却，可以制备出对应的固体培养基平板。

(2)称取10g污染了AFB1的玉米粉样品加入到100ml经灭菌的生理盐水中，充分震荡30min后静置2h。在超净工作台内取上清液100μL接种到筛选培养基中，在温度30℃、摇床转速200r/min下摇床培养3d后，取样100μL再重新接种于筛选培养基中培养。重复培养3次后，采用灭菌后的生理食盐水将培养物分别稀释到10^-3、10^-4和10^-5后，分别取100μL稀释液在对应的固体筛选培养基上均匀涂板，然后置于30℃下培养。3d后可以在固体培养基表面观察到长出的单克隆菌落，用接种针挑取单克隆菌落后重新接种到液体筛选培养基中培养3d，测定培养物中AFB1的浓度变化，经过多次重复，发明人成功筛选出了一株能够生物降解AFB1的真菌。

发明人经观察发现该菌株的单克隆菌落特征为乳白色、皱褶状，边缘不整齐；通过显微镜镜检(1000×)发现，该菌株的细胞个体形态为长杆状，具芽孢，细胞长2微米左右，宽0.8微米左右。经提取基因组DNA，通过PCR扩增和基于16s rDNA测序的分子鉴定，该菌株的分类地位为厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)，基于上述，该菌株被鉴定并命名为地衣芽孢杆菌BL010株(Bacilluslicheniformis strain BL010)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC)进行保藏，保藏编号：CGMCC NO.12898。

本发明第二方面所涉及的用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂为本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌BL010菌株的发酵培养物经离心分离处理后获得的湿菌体，所述发酵培养物的光密度(OD_680nm)≥40；所述发酵培养物的细胞菌落形成单位≥100亿CFU/ml。

本发明第三方面所涉及的用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂的制备方法，其包括：

步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得发酵培养物；

步骤C，对发酵培养物浓缩分离后再进行清洗分离处理，获得地衣芽孢杆菌湿菌体(即用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂)；

其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。

正如本领域技术人员所知，目前，国际上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)来进行细菌的分子鉴定，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的发酵菌株并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。图1显示了本发明的地衣芽孢杆菌BL010株基于16S rDNA的分子进化树。

因此，本发明中，发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌菌株(即地衣芽孢杆菌BL010株)的16S rDNA的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌菌株(即地衣芽孢杆菌BL010株)的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为如本发明第一方面所述的地衣芽孢杆菌菌株(即地衣芽孢杆菌BL010株)。即在不改变地衣芽孢杆菌菌株(即地衣芽孢杆菌BL010株)的16S rDNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的地衣芽孢杆菌BL010株，获得与本发明地衣芽孢杆菌BL010株16S rDNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似的生物降解黄曲霉毒素B1的功能的菌株。

上述步骤C中，对发酵培养物浓缩分离包括对发酵培养物进行离心分离处理，倒去上清液获得地衣芽孢杆菌粗湿菌体。

上述步骤C中，所述清洗分离处理包括用磷酸盐缓冲液(PBS，50mM，pH 7.0)将发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即地衣芽孢杆菌粗湿菌体)重悬清洗后，再进行离心分离处理获得地衣芽孢杆菌湿菌体。

在上述步骤C中，一般对发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即地衣芽孢杆菌粗湿菌体)进行至少1次清洗分离处理，优选对发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即地衣芽孢杆菌粗湿菌体)进行至少2次清洗分离处理，进一步优选对发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即地衣芽孢杆菌粗湿菌体)进行3次清洗分离处理。

本发明对上述步骤C中的离心分离的条件没有特别的限制，在本发明的一些实施例中，例如，可以在8000r/min条件下对带分离物离心处理10min。

根据本发明方法，所述发酵培养为菌种游离的摇床发酵培养，发酵菌种以种子液的形式接种到发酵培养基。所述种子液的接种量为0.1％-1％(v/v)；优选所述种子液的接种量为0.2％-0.5％(v/v)；进一步优选所述种子液的接种量为0.2％(v/v)。

在本发明的一些实施例中，在所述种子液中，菌种的菌落形成单位(CFU)为(10-30)×10⁸/mL。

根据本发明的一些实施方式，在上述制备方法中，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

为获得较高的地衣芽孢杆菌BL010株湿菌体的产率，本发明人对发酵培养基进行了优化研究，结果表明发酵培养基按照以下组成配制有利于发酵培养，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

在本发明的一些实施例中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始pH值，所述发酵培养基的pH值为6.5-8.0；优选所述发酵培养基的pH值为6.5-7.2；进一步优选所述发酵培养基的pH值为7.0。

根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂的制备方法还包括在步骤B之前种子培养的步骤A：挑取本发明所提供的地衣芽孢杆菌BL010株单克隆菌落接种到100ml发酵液体培养基中，在温度30℃、转速200r/min下摇床培养3d后，制得发酵菌种(种子液)。

在本发明的一些具体实施例中，制备用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂，包括以下步骤：

(1)制备发酵培养基，用500ml三角瓶装入配制好的液体发酵培养基100ml，瓶口用通空气膜封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。

(2)种子培养，挑取本发明所提供的地衣芽孢杆菌BL010株单克隆菌落接种到100ml三角瓶含10ml发酵液体培养基中，在温度30℃、转速200r/min下摇床培养3d后，制得发酵菌种(种子液)。

(3)发酵培养，将发酵菌种(种子液)转接到5瓶500ml三角瓶含100ml发酵用液体培养基，在步骤(1)相同的条件下培养3d，获得发酵培养物。

(4)清洗分离湿菌体，对发酵培养物浓缩分离后再进行清洗分离处理，获得地衣芽孢杆菌湿菌体(即用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂)。

在上述步骤(3)中经过48h的发酵培养，所获得的培养物的OD_680nm值可达到40以上，细胞菌落形成单位可以达到100亿/ml。

本发明第四方面所涉及的地衣芽孢杆菌酶制剂由本发明第一方面所述的菌株经发酵培养后产生，所述酶制剂能够降解黄曲霉毒素B1。

本发明第五方面所涉及的上述酶制剂的制备方法，其包括将本发明第二方面所述的菌剂或本发明第三方面所述的方法制得的菌剂进行重悬、细胞破碎处理和离心分离处理获得酶制剂。

在本发明的一些实施例中，采用磷酸盐缓冲液(PBS)(50mM，pH 7.0)对菌剂进行重悬。

根据本发明的一些事实方式，细胞破碎处理包括在冰浴条件下超声破碎细胞。在一些实施例中，所述超声破碎细胞的时间为50min。

本发明对上述制备酶制剂过程中的离心分离的条件没有特别的限制，在本发明的一些实施例中，例如，可以在15000r/min条件下对带分离物离心处理30min。

本发明第六方面所涉及的去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的方法，其包括：将本发明第二方面所述的菌剂或本发明第三方面所述的方法制得的菌剂或本发明第四方面所述的酶制剂或本发明第五方面所述的方法制得的酶制剂与含有黄曲霉毒素B1的生物质材料混合后，在密封条件下静置，生物降解去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1，其中所述生物质材料为饲料或粮食。

本发明中，所述饲料包括但不限于玉米、花生、小麦、大米和全价配合饲料等。

本发明中，所述粮食包括但不限于玉米、花生、小麦和大米等。

根据本发明方法，所述生物材料中黄曲霉毒素B1的含量为20μg/kg-20mg/kg，优选所述生物材料中黄曲霉毒素B1的含量为20mg/kg。

本发明中，所述生物材料中水的质量含量为1％-20％，优选所述生物材料中水的质量含量为16.7％-20％，进一步优选所述生物材料中水的质量含量为16.7％。

在本发明的一些实施例中，所述生物降解的温度为20-35℃，优选所述生物降解的温度为25-30℃，进一步优选所述生物降解的温度为30℃。

在本发明的另一些实施例中，所述菌剂的用量为0.1％-1％(菌剂湿重/生物材料重量)，优选所述菌剂的用量为0.2％-0.5％(菌剂湿重/生物材料重量)，进一步优选所述菌剂的用量为0.3％(菌剂湿重/生物材料重量)。

在本发明的又一些实施例中，所述酶制剂的用量为0.5％-5％(酶制剂体积/生物材料重量)，优选所述酶制剂的用量为0.5％-2％(酶制剂体积/生物材料重量)，进一步优选所述酶制剂的用量为2％(酶制剂体积/生物材料重量)。

本发明中，所述酶制剂的浓度为400-500mg/L，优选所述酶制剂的蛋白浓度为500mg/L。

发明用于培养基或发酵培养过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是指经0.45μ滤膜过滤获得的去离子水。

本发明中，所述离心分离处理，是指将待分离物装入离心管中，在一定转速下进行离心分离，然后将上清液与沉淀物分离的过程。

本发明中所述用语“地衣芽孢杆菌粗湿菌体”是指发酵培养物浓缩分离，亦即对发酵培养物进行离心分离处理获得地衣芽孢杆菌菌体。

本发明中所述用语“地衣芽孢杆菌粗菌体”是指发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即地衣芽孢杆菌粗湿菌体)经清洗分离处理后获得的地衣芽孢杆菌菌体，亦即用缓冲液将发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即地衣芽孢杆菌粗湿菌体)重悬清洗后，再进行离心分离处理获得地衣芽孢杆菌菌体。

如前所述，传统的物理化学法很难高效去除AFB1。本发明从长期污染了黄曲霉毒素的玉米中成功筛选出一株能够生物降解AFB1的真菌，该菌株为经过涂板筛选分离获得纯菌种，经16S rDNA分子鉴定并命名为地衣芽孢杆菌BL010株(Bacillus licheniformis,Strain BL010)，本发明中亦称为地衣芽孢杆菌BL010(Bacillus licheniformis BL010)。通过优化培养控制获得的超高细胞浓度地衣芽孢杆菌BL010发酵培养液再经离心分离处理获得的地衣芽孢杆菌BL010湿菌体(地衣芽孢杆菌BL010菌剂)，以及通过超声波破碎地衣芽孢杆菌BL010湿菌体细胞所获得的粗酶液(地衣芽孢杆菌BL010酶制剂)均能够对生物材料中的AFB1进行高效降解。本发明方法对AFB1的降解条件温和，最适反应温度为30℃，不会对产品品质造成破坏。采用本发明的地衣芽孢杆菌BL010菌剂以及酶制剂可以达到快速、安全和高效生物降解去除生物材料中AFB1的目的。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

本发明采用高效液相色谱测定样品中AFB1的含量，具体方法如下：

准确称取5mg AFB1标准品，溶解到装有10ml无水乙醇的20ml容量瓶中，配制成500mg/L AFB1标准原液。用无水乙醇稀释可获得5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/L的AFB1标准溶液，采用高效液相色谱(HPLC)法分别绘制AFB1浓度和出峰面积与峰高关系的线性关系的标准曲线，并基于此定量测定样品中AFB1的含量。

色普条件如下：

检测器：紫外检测器，检测波长为360nm；

色谱柱：Diamonsil C18 5μm(250×4.6mm)色谱柱；

流动相：超纯水:乙腈＝55:45(v/v)；

流速：1.0ml/min；

进样量：20μL。

以下实施例以玉米作为生物材料进行试验，玉米含水量和AFB1含量的调节方法如下：

称取100g经130℃烘干2小时的玉米粉，加入20ml超纯水并搅拌均匀后获得含水量16.7％的玉米粉。再添加2mg AFB1并充分混合均匀，得到AFB1含量为20mg/kg、含水量16.7％的玉米粉。

实施例1：制备用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂

(1)制备发酵培养基，用500ml三角瓶装入配制好的液体发酵培养基100ml，瓶口用封口膜封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。

所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

采用40％(重量)氢氧化钠和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始pH值至7.0。

(2)种子培养，挑取本发明所提供的地衣芽孢杆菌BL010株单克隆菌落接种到10ml发酵液体培养基中，在温度30℃、转速200r/min下摇床培养3d后，制得发酵菌种(种子液)。

(3)发酵培养，将发酵菌种(种子液)转接到5瓶100ml发酵用液体培养基，在步骤(1)相同的条件下培养3d，获得发酵培养物。

地衣芽孢杆菌BL010在初始pH 7.0和温度30℃时液体发酵培养生长曲线如图2所示。

经过48h的发酵培养，所获得的培养物的OD_680nm值达到40以上，细胞菌落形成单位达到100亿CFU/mL以上。

(4)清洗分离湿菌体，对发酵培养物浓缩分离后再进行清洗分离处理，获得地衣芽孢杆湿菌体(即地衣芽孢杆菌BL010湿菌体)。

取发酵培养得到的培养物500ml，在常温下8000r/min离心10min，去掉上清液，再用PBS缓冲液(50mM，pH 7.0)重悬，相同条件下离心去上清，重复两次后收集并获得地衣芽孢杆湿菌体(即地衣芽孢杆菌BL010湿菌体)。

实施例2：采用地衣芽孢杆菌BL010去除玉米中的黄曲霉毒素B1

称取50g初始AFB1含量为20mg/kg，含水量为16.7％的玉米粉，将0.1g实施例1中制得的湿菌体加入玉米粉中，充分混匀后放入密闭的塑料带中，在温度30℃静置培养。

在第0、2、4、6、8和10d分别取样4克，其中2g玉米粉置于50mL三角瓶中，加入10mL乙醇振荡提取1h，经0.22u无机滤膜过滤后，在60℃下氮气吹干至2ml用于HPLC测定AFB1浓度。另外2g样品采用130℃定时烘干法测定含水量，用于最终玉米中AFB1浓度的换算。

地衣芽孢杆菌BL010生物降解玉米中AFB1的动力学过程如图3所示。

从图3可以看出，利用发酵得到的地衣芽孢杆菌BL010菌体，经过浓缩清洗后，应用于受AFB1污染的的玉米粉，经过10d的生物降解，玉米粉中AFB1的浓度从初始的20mg/kg降解到2.0mg/kg，降解率达到90.0％。

实施例3：制备地衣芽孢杆菌BL010酶制剂

采用与实施例1相同的方法制备发酵培养物和湿菌体。

取发酵培养得到的菌液500ml，在常温下8000r/min离心10min，去掉上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)(50mM,pH 7.0)重悬，相同条件下离心去上清，重复两次后收集菌体，用50ml PBS缓冲液重悬，在冰浴条件下超声破碎细胞50min，再经过离心(15000r/min，30min)后取上清液得到地衣芽孢杆菌BL010粗酶液。

实施例4：采用地衣芽孢杆菌BL010酶制剂对玉米中黄曲霉毒素的降解

称取AFB1含量为20mg/kg，含水量为16.7％的50g玉米粉，加入1ml实施例3中制得的蛋白含量为500mg/L粗酶液作为地衣芽孢杆菌BL010酶制剂，充分混合均匀后放置于密闭的塑料袋中，在温度30℃下静置培养。分别在第0、6、12、18、24和36h各取样4克，其中2g玉米粉置于50mL三角瓶中，加入10mL乙醇振荡提取1h，经0.22u无机滤膜过滤后，在60℃下氮气吹干至2ml用于HPLC测定AFB1浓度。另外2g样品采用130℃定时烘干法测定含水量，用于最终玉米中AFB1浓度的换算。

图4显示了地衣芽孢杆菌BL010粗酶生物降解玉米中AFB1的动力学过程。

从图4可以看出，利用发酵得到的地衣芽孢杆菌BL010菌体，经过浓缩清洗后，对细胞进行破壁处理，得到粗酶液，应用于受AFB1污染的玉米粉，经过36h的生物降解，玉米粉中初始含量为20mg/kg的AFB1降解至0.76mg/kg，降解率达到96.2％。

从上述实施例可以看出，本发明采用微生物细胞和酶高效生物降解AFB1的生物技术，具有效率高和成本低等优点，通过发酵培养获得超高浓度的地衣芽孢杆菌BL010细胞，通过细胞破碎获得其粗酶液，可以直接应用于AFB1的生物降解去除。地衣芽孢杆菌BL010在10d时间内对玉米粉中AFB1的降解率达到90.0％，相应的粗酶在36h内对玉米粉中AFB1的降解率达到96.2％。同时，本发明方法对AFB1的降解条件温和，最适反应温度为30℃，不会对产品品质造成破坏。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，具体制备步骤为：

2.根据权利要求1所述一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤B所述发酵培养物的光密度(OD_680nm)≥40；所述发酵培养物的细胞菌落形成单位(CFU)≥100亿/mL。

3.一种用于去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1的菌剂，其特征在于：步骤A所述的地衣芽孢杆菌菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株。

4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：

所述发酵培养基的pH值为6.5-8.0。

5.根据权利要求4所述的一种地衣芽孢杆菌酶制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6.5-7.2。

6.一种利用权利要求1所述方法制备的地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于将制得的酶制剂与含有黄曲霉毒素B1的生物质材料混合后生物降解去除生物质材料中的黄曲霉毒素B1；其中所述生物质材料包括饲料和粮食。

7.根据权利要求6所述的利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于所述生物材料中黄曲霉毒素B1的含量为20μg/kg-20mg/kg；生物材料中水的质量含量为1％-20％。

8.根据权利要求7所述的利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于生物材料中水的质量含量为16.7％-20％。

9.根据权利要求8所述的利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于所述生物降解的温度为20-35℃，基于生物质材料总重量计，所述菌剂的用量为0.1wt％-1wt％，酶制剂的用量为0.5v％-5v％。

10.根据权利要求9所述的利用地衣芽孢杆菌酶制剂去除黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于所述生物降解的温度为25-30℃；基于生物质材料总重量计，所述菌剂的用量为0.2wt％-0.5wt％；所述酶制剂的用量为0.5v％-2v％；所述酶制剂的蛋白浓度为400-500mg/L。