CN105925492B - 一种生物降解脱氧雪腐镰刀烯醇的方法 - Google Patents

一种生物降解脱氧雪腐镰刀烯醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物降解脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，属于微生物技术领域和食品安全技术领域。本发明的降解脱氧雪腐镰刀烯醇的微生物是从太湖湖底泥中经梯度稀释分离、筛选得到的，经鉴定为青霉JS2(Penicillium sp.JS2)，在培养基中，DON的初始浓度为2mg/L，pH 6.0，经32‑35℃培养96h，DON的降解率为62％。该菌种降解呕吐毒素的稳定性很好，在培养基中，传代培养5代，DON的降解率均在60％以上。

Description

一种生物降解脱氧雪腐镰刀烯醇的方法
技术领域
本发明涉及一种生物降解脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，属于微生物技术领域和食品安全技术领域。
背景技术
真菌毒素对食品尤其是对粮食的危害极大，真菌可在粮食作物田间生长、收获后及储藏过程中对毒素的生物合成及代谢。呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是由镰刀菌属等产生的次生代谢产物，它对粮谷类的污染非常普遍，家畜食用了DON污染的饲料会引起拒食，呕吐，生长延迟，生殖紊乱等症状；而人类误食了DON污染的粮食会引起免疫抑制，贫血，头痛，呕吐，厌食和腹痛等症状。
呕吐毒素的性质非常稳定，耐热、耐压，在弱酸中部不分解，一般的方法很难破坏其化学结构。目前，呕吐毒素降解的方法有物理法、化学法和生物法，但是由于成本、环境污染、原料营养成分破坏等原因，推广起来不易。因此，寻找一种安全快速有效的方法来降解污染粮食中的呕吐毒素是十分必要的。
微生物降解呕吐毒素有以下优点：专一、有效且条件温和：不会引入有害化学物质，对谷物及饲料营养价值的损失少，没有环境污染而受到广大关注。真菌毒素微生物防治方法作为一种常用方法，具有安全、高效、经济、应用性强、环境友好型等优势，成为近年来备受推崇的防治方法。
目前，生物降解呕吐毒素包括一些黑曲霉、枯草芽孢杆菌、米曲霉米根霉及一些肠道厌氧微生物，虽然已有报道一些青霉菌可以降解呕吐毒素，但是存在降解效率低的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株能降解呕吐毒素的菌株及与其适合的有效发酵培养条件。
本发明的菌株为青霉JS2，已于2015年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015237。
本发明的青霉JS2，在液体发酵培养基中，DON浓度为2mg/L，pH为6.0，经32℃培养96h，传代5次，青霉JS2对DON的降解率均在60％以上。
所述的能降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的青霉菌JS2，是从太湖湖底泥中以DON毒素为唯一碳源分离筛选出来，其保藏条件如下：从生长良好的固态平板培养基上接取3环降解菌到摇瓶培养基中，32℃摇床(120rpm)培养96h，取0.65mL移入含有0.3mL无菌甘油的甘油管中，放入-70℃超低温冰箱保存。
所述固态平板培养基为(w/v)：DON毒素0.2mg，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，(NH4)2SO4 0.3g，CaCl2·2H2O 0.2g，琼脂2.0g，蒸馏水100mL，pH自然。121℃灭菌20min，灭菌后加入DON毒素。
本发明还提供一种所述能降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的培养方法，是将青霉菌JS2接入液体发酵培养基，pH 6.0，培养温度32-35℃，摇床转速120rpm/min，摇床培养96h。
所述液体发酵培养基为(w/v)：DON毒素2mg/L，KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.1％，(NH4)2SO4 0.3-0.4％，CaCl2·2H2O 0.2％，琼脂2.0％，蒸馏水100mL，pH自然。121℃灭菌20min，灭菌后加入DON毒素。
将能降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的青霉菌JS2菌发酵后的发酵液，5000rpm离心10min后上清液为粗酶液，经高效液相色谱(HPLC)检测结果显示DON经粗酶降解，降解效果明显，降解率达60％以上。
本发明还提供了一种降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的方法，是利用青霉JS2发酵得到的粗酶液降解DON。
生物材料保藏：
青霉JS2，分类学命名为青霉JS2Penicillium sp.JS2，已于2015年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015237，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明的有益效果：
本发明自太湖湖底泥中筛选出一株能降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的青霉JS2(Penicillium sp.JS2)，该菌株可产生酶能降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，该菌种降解呕吐毒素的稳定性很好，传代培养5代，在培养基中，DON的初始浓度为2mg/L，pH 6.0，经32-35℃培养96h，DON的降解率均在60％以上。
具体实施方式
毒素检测方法：
25ml发酵液过滤后取5ml再通过DON免疫亲和柱净化，然后将净化液3ml以氮气吹干，用1ml流动相甲醇：水(8：2)复溶，然后用UPLC进行检测。
实施例1：降解呕吐毒素菌株的筛选方法
采取的一定量的太湖湖底泥，放入装有100mL无菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振荡，稀释不同浓度梯度，将不同浓度梯度稀释好的样品分别涂布到以DON毒素为唯一碳源的pH值为6.0的固体培养基平板上，32℃培养72h。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。
鉴定主要通过：1)菌落特征观察：在含有DON毒素的固体培养基平板上，用肉眼直接观察，在菌落周围有淀粉降解透明圈的菌株。2)个体形态观察：用光学显微镜观察，挑起有变形菌形态的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。
以3％接种量取-70℃甘油管保藏液接种于发酵培养基中，32℃，120rpm摇瓶培养。取32℃摇床培养的96h的发酵液，5000rpm，4℃离心10min。离心结束后，取上清液，过滤后用HPLC方法测定降解率。
所述发酵培养基为(w/v)：DON毒素0.2mg，KH2PO40.5％，MgSO4·7H2O 0.1％，(NH4)2SO4 0.4％，CaCl2·2H2O 0.2％，琼脂2.0％，蒸馏水100mL，pH自然。121℃灭菌20min，灭菌后加入DON毒素。
通过利用HPLC法对降解菌的降解率进行测定，筛选出一株可高效降解DON毒素的菌株(降解率为67％)，通过16S rDNA鉴定，序列分析可知该菌株为青霉菌JS2(Penicilliumsp.JS2)，于2015年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015237。
实施例2：青霉菌JS2(Penicillium sp.JS2)产酶最适反应pH的测定
采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，配置不同梯度pH缓冲液(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，)的方法测定降解酶最适反应pH。分别将粗酶液与不同pH的缓冲液在试管中混合，在35℃水浴锅内保温24h。该降解酶的最适反应pH为6.0，在该pH条件下可以高效降解DON。在pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5下的降解率分别是50％，64％，66％，62％，55％，47％。
粗酶液制备方法：取32℃摇床培养的96h的发酵液，5000rpm、4℃离心10min。离心结束后，取上清液，过滤备用。
降解体系：粗酶液添加量为1ml，将粗酶液与不同pH的缓冲液在试管中混合，加入DON毒素的量为2mg/L，反应时间为30分钟。
实施例3：青霉菌JS2(Penicillium sp.JS2)产酶最适反应温度的测定
采用不同梯度温度(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃)的方法测定降解酶最适反应温度，25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下的降解率分别49％，57％，65％，52％，46％，39％。分别将粗酶液放置在不同温度条件下进行反应，在水浴锅内保温24h，该降解酶的最适反应温度为35℃，在该温度条件下可以高效降解DON。
粗酶液制备方法：取32℃摇床培养的96h的发酵液，5000rpm、4℃离心10min。离心结束后，取上清液，过滤备用。
降解体系：粗酶液添加量为1ml，加入DON毒素的量为2mg/L，反应时间为30分钟。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇的青霉JS2，于2015年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015237。
2.权利要求1所述的青霉JS2在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是用于降解粮食中的降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
4.一种发酵培养权利要求1所述青霉JS2的方法，其特征在于，所述方法是将青霉菌JS2接入液体发酵培养基，pH 6.0，培养温度32℃，摇床转速120rpm/min，摇床培养96h，得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中，含有DON毒素2mg/L，KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.1％，(NH4)2SO4 0.3-0.4％，CaCl2·2H2O 0.2％，琼脂2.0％。
6.根据权利要求4-5的方法得到的发酵液。
7.权利要求6所述的发酵液在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是利用发酵液离心后得到的粗酶液降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
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