CN104106370A - 一种食用菌液体菌种及其生产方法 - Google Patents

一种食用菌液体菌种及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食用菌液体菌种的生产方法，其中，所述生产方法包括以下步骤：步骤一：将食用菌菌种接种于PDA培养基中进行活化，培养后分离获得活化菌丝体；步骤二：将活化菌丝体接种于固态木屑培养基中培养28-32天获得由菌丝体和固态木屑培养基组成的恢复培养物1；步骤三：将恢复培养物1粉碎至粒径为20-40目后以3-4cm的厚度平铺在浅盘中密封培养2-3天，获得恢复培养物2；步骤四：将恢复培养物2捣碎至粒径不大于0.5cm的小块后加无菌水打浆，再与浓度为0.15-0.2％的琼脂溶液接触混匀。本发明所提供的方法操作简单、不需要复杂的培养设备，生产效率高。利用本发明所提供的方法制备获得的食用菌液体菌种具有质量稳定、菌种强壮、退化慢、宜于保藏运输等优点。

Description

一种食用菌液体菌种及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种食用菌液体菌种及一种液体菌种的生产方法食用菌液体菌种的生产方法。
背景技术
在现有的食用菌栽培技术中，通常使用固体菌种进行生产，传统的固体菌种存在食用菌菌种的生产周期长、菌种用量大、生产成本高、菌丝萌发速度慢的缺陷，不适合香菇在大规模生产中应用。
现有技术中普遍应用的液体菌种是利用液体培养基在生物发酵罐中通过深层培养技术生产的。液体菌种虽然克服了传统固态菌种生产周期长、成本高的缺陷，但是仍存在液体发酵生产设备投资大、污染难控制、菌丝老化快、菌种变异等一系列不适宜香菇大规模工业化作业的缺陷。
目前国内外已有的固体液化菌种生产方法中，均是采用的木屑或纸浆做培养基，由于木屑或纸浆内，主要成分仅是木质素和纤维素，蛋白及微量元素等含量低、纤维长，致使菌种生长弱和很难稀释均匀，制备时间长，难以实现工业化生产。因此有必要开发一种新的，生产设备简单、投资少、技术操作要求低，易于掌握、菌种质量稳定、生长快、适宜工业化生产的食用菌液体菌种制备方法和新的液体菌种。
发明内容
本发明的目的是克服现有的木屑固体和液体食用菌菌种及其制备方法中所存在的上述缺陷，提供一种新的，生产设备简单、投资少、技术操作要求低，易于掌握、菌种质量稳定、生长快、适宜工业化生产的食用菌液体菌种制备方法和新的液体菌种。
本发明提供了一种新的香菇液体菌种制备方法，及用该方法制备的液体菌种。
为达到以上目的本发明提供了一种食用菌液体菌种的生产方法，其中，所述生产方法包括以下步骤：
步骤一：将食用菌菌种接种于PDA培养基中进行活化，培养后分离获得活化菌丝体；
步骤二：将活化菌丝体接种于固态木屑培养基中培养28-32天获得由菌丝体和固态木屑培养基组成的恢复培养物1；
步骤三：将恢复培养物1粉碎至粒径为20-40目后以3-4cm的厚度平铺在浅盘中密封培养2-3天，获得恢复培养物2；
步骤四：将恢复培养物2捣碎至粒径不大于0.5cm的小块后加无菌水打浆，再与浓度为0.15-0.2％的琼脂溶液接触混匀。
优选的，所述培养基的组成成分包括：固态木屑和营养液；相对于100g的固态木屑，营养液的添加量为110-120g；所述营养液的组成成分包括麸皮水、蔗糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。更为优选的，相对于100g的培养物2，无菌水的用量为220-280ml，琼脂溶液的用量为4800-5200ml。
优选的，所述固态木屑为辣木木屑。
优选的，相对于100g的恢复培养物2，无菌水的用量为200-300ml，琼脂溶液的用量为4500-5500ml。
本发明还提供了一种食用菌液体菌种，其中，该菌种是利用本发明所提供的食用菌液体菌种生产方法生产获得的。
本发明所提供的液体菌种的培养方法操作简单、不需要复杂的培养设备在降低生产成本的同时提高了生产效率。
利用本发明所提供的方法制备获得的液体菌种具有质量稳定、菌种强壮、不退化变异、宜于长期保藏和运输等优点。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供一种食用菌液体菌种的生产方法，其中，所述生产方法包括以下步骤：
步骤一：将食用菌菌种接种于PDA培养基中进行活化，培养后分离获得活化菌丝体；
步骤二：将活化菌丝体接种于固态木屑培养基中培养28-32天获得由菌丝体和固态木屑培养基组成的恢复培养物1；
步骤三：将恢复培养物1粉碎至粒径为20-40目后以3-4cm的厚度平铺在浅盘中密封培养2-3天，获得恢复培养物2；
步骤四：将恢复培养物2捣碎至粒径不大于0.5cm的小块后加无菌水打浆，再与浓度为0.15-0.2％的琼脂溶液接触混匀。
在本发明所提供的方法中，所述食用菌菌种为食用菌栽培领域中常用的菌种，例如，所述食用菌菌种为香菇菌种、平菇菌种、杏鲍菇菌种、口蘑菌种、金针菇菌种或木耳菌种。
特别优选的情况下，所述食用菌菌种为香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler.)菌种。例如，所述食用菌菌种可以为香菇菌种808、135、中香68，庆科20、9015、9319或241-4。优选的情况下，所述食用菌菌种为香菇菌种808、庆科20、9015；特别优选的情况下，所述食用菌菌种为香菇菌种庆科20。
在本发明中，对步骤一中将食用菌菌种接种于PDA培养基中活化培养的方法没有特别的限制，可以按照本领域常规使用的菌种活化培养方法进行。例如可以在无菌条件下用接种针挑取食用菌菌种在PDA斜面培养基上划线接种。活化培养的条件可以为在24-26℃下培养15天获得活化菌丝体。
在本发明中，将活化菌丝体接种于固态木屑培养基的方法没有特别的限制，可以按照本领域常规的接种方法进行。本发明中，对于步骤二中固态木屑培养基的容器没有特别的限制，容器可以为透明袋或玻璃瓶。
在本发明所提供的方法中，将活化菌丝体接种于固态木屑培养基的接种比例为3-5％，优选的情况下，接种的比例为3.5-4.5％。当所述食用菌菌种为香菇时，接种的比例为4％。
在本发明所提供的方法中，步骤二中培养的条件为在26-28℃下密封培养72-75小时，培养过程中培养室的湿度控制在40％。
在本发明所提供的方法中，所述固态木屑培养基的原料包括：固态木屑和营养液；相对于100g的固态木屑，营养液的添加量为110-120g；所述营养液的组成成分包括麸皮水、蔗糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。
特别优选的情况下，所述固态木屑为辣木的木屑。辣木为落叶乔木类木本植物,中文学名为辣木，拉丁学名为Moringa oleifera Lam属于卫矛目、辣木科、辣木属、辣木种。辣木树被证实是含有丰富高营养价值的植物，具有以下优点：蛋白质含量高、不含胆固醇、矿物质丰富、维生素含量高，能够为食用菌生长提供生长所必须的多种养分，使食用菌菌种生长健壮。特别的，本发明的发明人通过大量实验发现，辣木材料含有辣木素及凤尾辣木素的生物碱，因此在将辣木木屑用作香菇菌丝的培养基时可增强菌种的抗杂菌力；此外，辣木木屑中含有低分子水溶性蛋白，这些溶解在水体中的蛋白对附近的固体悬浮颗粒有较大吸附力，食用菌的菌丝片段易被吸附集中，本发明的发明人还发现，由于辣木的纤维短、物质比重轻容易被快速稀释均匀和悬浮，因此在使用辣木木屑制备液体菌种时能够达到快速制备液体菌种的目的。本发明的发明人发现，用辣木木屑制作的液体菌种与采用其他木屑的液体菌种相比具有更高的活力。
在本发明所提供的方法中，所述营养液的配置方法为：用浓度为9-11％的麸皮水在80～93℃保温1小时后用4层纱布过滤获得滤液，再将滤液与蔗糖、磷酸二氢钾和硫酸镁接触，调整PH调至6.0后灭菌；
其中，相对于100g的麸皮水，蔗糖的添加量为1.8-2.2g、磷酸二氢钾的添加量为0.18-0.22g、硫酸镁的添加量为0.08-0.12g。
在本发明所提供的方法中，所述辣木木屑的颗粒为20-40目。
本发明中，生产器具、容器、培养基的灭菌要求和方法与本领域常规的方法相同，例如所述固态木屑培养基可以在121℃下高温湿热灭菌3h后冷却至28℃。
通过步骤二的培养后，菌丝基本布满培养基获得由菌丝体和固态木屑培养基所组成的恢复培养物1；从培养瓶/袋中取出恢复培养物1，在无菌条件下捣碎至粒径为20-40目的颗粒后将捣碎的颗粒平铺在培养浅盘中，为了使菌丝体更好的进行呼吸作用，所述颗粒在浅盘中的厚度为2-6厘米，优选的，为3-4厘米。
在步骤三的培养过程中，要始终保持密封黑暗培养，培养的温度恒定在26-28℃之间，培养的湿度为40％。
在通过步骤三获得恢复培养物2后再次在无菌条件下将恢复培养物2捣碎至粒径不大于0.5cm的小块，然后将无菌水打浆，无菌水的温度为常温℃，打浆的条件为在4000～8000rpm/min的转速下打浆25-35s获得均匀的悬浊液。
在本发明所提供的方法中，浓度为0.1-0.2％的琼脂溶液为高温灭菌后冷却至温度为25-30℃的琼脂溶液。
本发明对于将打浆获得的悬浊液与琼脂溶液混合的方法没有特别的限制，只要能够使得二者充分的混合均匀即可。所述接触混匀的温度条件为常温。
在本发明所提供的方法中，相对于100g的恢复培养物2，无菌水的用量为200-300ml，琼脂溶液的用量为3000-10000ml。优选的情况下，相对于100g的恢复培养物2，无菌水的用量为220-280ml，琼脂溶液的用量为4500-5500ml。
在步骤四所述的接触混匀步骤后即可获得产品食用菌液体菌种，所述食用菌液体菌种的储存条件可以为在4℃下低温贮存。
本发明还提供了一种食用菌液体菌种，其中该食用菌液体菌种是利用本发明所提供的食用菌液体菌种生产方法生产获得的。
优选的，所述食用菌液体菌种为香菇液体菌种。
特别优选的，所述食用菌液体菌种为香菇菌种庆科20的液体菌种。
本发明所提供的食用菌液体菌种中，以所述食用菌液体菌种的总重量为基准，液体菌种中的食用菌菌种的重量为1-3％。
本发明所提供的食用菌液体菌种在4℃下的储存时间为300-600天，在不高于28℃的温度下，保存时间最低为80天。
下面通过实施例对本发明所提供的方法进行详细说明。
以下实施例中，
食用菌菌种来源为香菇菌种((Lentinula edodes(Berk.)Pegler.)菌株名称为中香68，庆科20。
实施例中所使用的培养基的制备方法为，将辣木木屑(木屑颗粒取20-40目之间的部分)和营养液按重量比1:1.2混合配制，营养液的配方是用10％的麸皮水在80～93℃保温1小时后用4层纱布过滤所得,每100ml滤液中加2克蔗糖、0.2克磷酸二氢钾、0.1克硫酸镁、pH调至6.0。然后将培养基在121℃灭菌30min，再在无菌条件冷却至30℃下使用。
液体菌种中固体菌种含量的检测依照食用菌菌种通用技术要求NY/T1742-2009规定的方法进行。
菌丝萌发率的检测方法为：将食用菌液体菌种按稀释法涂布PDA培养平板中，培养并统计萌发的菌落数。具体的，取1克培养物于含100ml无菌水的500ml三角瓶，在1250rpm用磁力搅拌子搅拌1小时得母液(标记为100)，取母液1ml和9ml无菌水充分混合后得稀释液1(标记为10-1)，取1ml稀释液1加入9ml无菌水充分混合后得稀释液2(标记为10-2)，用0.1ml稀释液2涂布于90mmPDA培养皿，25℃培养7天计数萌发菌落点数为X,X/Y即菌丝萌发率。
颗粒片段浓度的检测方法为：取1克培养物于含100ml无菌水含磁的500ml三角瓶，在1250rpm下用磁力搅拌子搅拌1小时得母液(标记为100)，取母液1ml和9ml无菌水充分混合后得稀释液1(标记为10-1)，取1ml稀释液1加入9ml无菌水充分混合后得稀释液2(标记为10-2)取0.1ml稀释液2于血球计数载玻片上计数得颗粒片段数Y，则每克培养物2含颗粒片段为Y×104。
实施例1
本实施例用于说明本发明所提供的利用食用菌液体菌种生产方法。
将香菇菌种(庆科20)接种到PDA培养基中活化培养取得到菌丝体；再将菌丝体按4％的比例转接到固态木屑培养基中，置于25℃下发酵培养30天，得到100g菌丝体块状培养物；在无菌条件下，将块状培养物捣碎成粒径不大于0.5cm的小块的粉状颗粒培养物，将粉状颗粒培养物以3-4cm的厚度平铺在培养盘内密封、避光、恒温25℃培养3天；培养结束后在无菌条件下将培养物捣碎至粒径不大于0.5cm的小块，在25-28℃下加入250ml无菌水以5000rpm/min的转速下打浆30s混合均匀后制备得母液，再用浓度为0.2％的琼脂溶液4750ml和制备得的母液混合而得5000ml香菇液体稀释菌种1。
实施例2
本实施例用于说明本发明所提供的利用食用菌液体菌种生产方法。
采用与实施例1相同的方法制备香菇液体菌种，不同的是，0.2％的琼脂溶液的添加量为4500ml。
获得香菇液体稀释菌种2。
实施例3
本实施例用于说明本发明所提供的利用食用菌液体菌种生产方法。
采用与实施例1相同的方法制备香菇液体菌种，不同的是，0.2％的琼脂溶液的添加量为5500ml。
获得香菇液体稀释菌种3。
实施例4
本实施例用于说明本发明所提供的利用食用菌液体菌种生产方法。
采用与实施例1相同的方法制备香菇液体菌种，不同的是，所使用的菌种为香菇菌种808。
获得香菇液体稀释菌种4。
实施例5
本实施例用于说明本发明所提供的利用食用菌液体菌种生产方法。
采用与实施例1相同的方法制备香菇液体菌种，不同的是，所使用的菌种为中香68。
获得香菇液体稀释菌种5。
对比例1
本对比例用于说明现有的食用菌液体菌种的制备方法。
用庆科20菌种(试管PDA)接0.3×0.5(cm)大小的菌种快5块于2000ml三角瓶(内含1500ml不加琼脂的PDA配方的液体营养液和1个搅拌子)中，25℃静置培养48小时后置于磁力搅拌机上，750rpm,15min-ON,45min-OFF间隙搅拌培养192小时后制备得液体母种1500ml,将液体母接入50L罐(内含40L已灭菌营养液)。罐营养液配方为：2000克麸皮加50L水煮沸半小时后4层纱布过滤得滤液40L，在40L滤液中加入蔗糖800克、磷酸二氢钾80克、硫酸镁40克、菜籽油10ml。121℃30min灭菌后夹套进冷水冷却至罐压0.035MPa时通入无菌空气搅拌，至罐温到28℃时火焰封口接入1500ml液体母种(接种量3.75％,v/v),开始的36小时罐压0.045MPa(通气比为0.15:1,v/v),36-72小时期间罐压0.035MPa(通气比为0.5:1,v/v),72-120小时期间罐压0.025-0.03MPa(通气比为1:1，v/v)。培养120小时后获得香菇液体菌种6
测试例1-6
检测实施例1-5与对比例1中制备获得的液体菌种1-6中固体菌种含量、菌丝萌发率、颗粒片段浓度，结果列于表1。
表1
本发明的液体菌种可实现随配制随使用，对比发酵液体菌种缩短生产周期7天以上。生产设备投资对比发酵液体投资降低80％、可100％控制污染、菌丝老化慢、菌种绝对不变异、适宜香菇大规模工业化作业。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种食用菌液体菌种的生产方法，其中，所述生产方法包括以下步骤： 
步骤一：将食用菌菌种接种于PDA培养基中进行活化，培养后分离获得活化菌丝体； 
步骤二：将活化菌丝体接种于固态木屑培养基中培养28-32天获得由菌丝体和固态木屑培养基组成的恢复培养物1； 
步骤三：将恢复培养物1粉碎至粒径为20-40目后以3-4cm的厚度平铺在浅盘中密封培养2-3天，获得恢复培养物2； 
步骤四：将恢复培养物2捣碎至粒径不大于0.5cm的小块后加无菌水打浆，再与浓度为0.15-0.2％的琼脂溶液接触混匀。 
2.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述培养基的组成成分包括：固态木屑和营养液；相对于100g的固态木屑，营养液的添加量为110-120g；所述营养液的组成成分包括麸皮水、蔗糖、磷酸二氢钾和硫酸镁。 
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中，所述固态木屑为辣木木屑。 
4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中，相对于100g的恢复培养物2，无菌水的用量为200-300ml，琼脂溶液的用量为4500-5500ml。 
5.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中，所述食用菌菌种为香菇菌种、平菇菌种、杏鲍菇菌种、口蘑菌种、金针菇菌种或木耳菌种。 
6.根据权利要求5所述的生产方法，其中，所述食用菌菌种为香菇菌种。 
7.根据权利要求1、2和6中任意一项所述的生产方法，其中，所述营养液的配置方法为：用浓度为9-11％的麸皮水在80～93℃保温1小时后用4层纱布过滤获得滤液，再将滤液与蔗糖、磷酸二氢钾和硫酸镁接触，调整PH调至6.0后灭菌； 
其中，相对于100g的麸皮水，蔗糖的添加量为1.8-2.2g、磷酸二氢钾的添加量为0.18-0.22g、硫酸镁的添加量为0.08-0.12g。 
8.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中，在步骤四中，所述接触混匀的温度条件为24-26℃，加无菌水打浆的条件为在4000～8000rpm/min的转速下打浆25-35s。 
9.根据权利要求1、2和6中任意一项所述的生产方法，其中，在步骤二中，将菌丝体接种于固态木屑培养基的接种比例为3-5％。 
10.一种食用菌液体菌种，其特征在于，该菌种是利用权利要求1-9中任意一项所提供的食用菌液体菌种生产方法生产获得的。 
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