CN103305445A - 耐久肠球菌及其产生的可抑制李斯特菌的细菌素 - Google Patents

Abstract

本发明提供耐久肠球菌及其产生的可抑制李斯特菌的细菌素，涉及微生物领域。耐久肠球菌（Enterococcusdurans）NJ株，其保藏登记号为：CGMCCNo.7236。NJ株产生的可抑制李斯特菌的细菌素。所述细菌素的制备方法，发酵培养NJ株，获得发酵液，纯化后得到所述细菌素。NJ株产生的可抑制李斯特菌的细菌素具有较好的pH、热稳定性，只对李斯特菌具有瞬时高效的抑制作用，因此将该细菌素可以应用于食品保鲜。本发明采用NJ株发酵后纯化制得细菌素，方法简单，效率高，成本低，安全。

Description

耐久肠球菌及其产生的可抑制李斯特菌的细菌素

技术领域

本发明涉及微生物领域，中一株耐久肠球菌及其所产的可抑制李斯特菌的细菌素。

背景技术

细菌素是一类由核糖体产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在革兰氏阳性和阴性菌中广泛存在，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点。尤其自乳酸链球菌素Nisin获得首次商业应用以来，人们对细菌素的研究更加关注。由于乳酸菌细菌素的生物安全性地位，在对化学防腐剂的安全隐患越来越重视的今天，细菌素作为生物防腐剂的应用符合了消费者对于安全、健康和天然的要求。

李斯特菌病是一种由食物污染单核细胞增生性李斯特菌（以下简称李斯特菌）引发的高病死率的肠道传染病。欧美国家以软乳酪、未经巴氏消毒的奶产品和熟食等为高危食物和主要传播媒介，近年来也扩展到由污染的豆芽、卷心菜和香瓜导致的爆发病例。鉴于李斯特菌感染是危害公共食品安全的重要隐患，欧美国家均专门成立疾控专家组、建立监测网，加以重点防控。WHO也已将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。我国虽未有爆发性流行案例，但食品受到单增李斯特菌污染的报告屡见不鲜。随着消费者饮食结构的改善，肉类和乳制品在膳食结构中的占比提升，李斯特菌中毒的危险越来越大，由食源性李斯特菌引起的潜在公共食品安全问题也愈发引起人们的普遍关注。

传统的李斯特菌控制方法主要是通过接种发酵剂、控制温度、水活度和pH值等常规物理化学条件来控制李斯特菌生长。近年来也有学者进行超高压杀菌技术在控制李斯特菌方面的研究，但由于这一技术对设备的要求较高，在工业上推广的难度较大。

如果能够采用生物源细菌素抑制食品中李斯特菌的生长，避免化学防腐剂的使用，能够符合广大消费者对安全、健康、绿色的要求，具有较强的市场接受度。利用细菌素抑制李斯特菌的操作工艺简单，无需企业增加投入购置新的仪器设备，利于在企业中推广普及，因此具有较好的产业化前景，对于促进食品质量安全，保障广大消费者的身体健康具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株，该菌株能够产生可抑制李斯特菌的细菌素。

本发明的另一目的是提供上述菌株产生的可抑制李斯特菌的细菌素，该细菌素的抑菌谱较窄，只对肠球菌和李斯特菌有抑菌作用，对热和pH稳定，由于耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株分离自发酵乳制品，所以作为食品专用抑菌剂非常安全。

本发明的再一目的是提供上述细菌素的制备方法，该方法简单，纯化效率高，安全。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株，其保藏登记号为：CGMCC No.7236。

一种所述耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株产生的可抑制李斯特菌的细菌素。

所述细菌素的分子量为4900-5000Da。

所述细菌素的制备方法，发酵培养耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株，获得发酵液，纯化后得到所述细菌素。

所述耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株的发酵培养基含有：2-25g/L碳源，15-20g/L氮源，5-20g/L无机盐，pH5-8。

所述发酵培养基还含有0.8-1.5mL/L表面活性剂；所述发酵培养基还含有0.1-3g/L维生素。

所述碳源为葡萄糖、乳糖、干酪乳清和糖蜜中的一种或两种以上；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸粉、酪蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或两种以上，所述无机盐为磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、β-甘油磷酸钠中的一种或两种以上，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-20中的一种或两种以上；所述维生素为维生素C、维生素D中的一种或两种以上。

所述发酵培养基含有：18.0g/L葡萄糖，9.0g/L蛋白胨，6.0g/L牛肉膏粉，4.5g/L酵母浸粉，1.0mL/L吐温-80，2.0g/L磷酸氢二钾，5.0g/L乙酸钠，2.0g/L柠檬酸三铵，0.2g/L硫酸镁，0.06g/L硫酸锰，pH值为6.5。

所述耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株的发酵培养方法为：将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株接种至所述发酵培养基，在36-39℃条件下发酵培养16-36h，得到发酵液。

所述发酵液的纯化方法为：（1）将发酵液离心取上清，用大孔吸附树脂吸附，收集吸附后的大孔吸附树脂，解吸附后得到细菌素粗品；

（2）将所述细菌素粗品用截留分子量为10000-8000Da超滤膜或超滤管进行超滤，取透过液；将所述透过液用截留分子量为1000-3000Da的透析袋或超滤膜分离，取保留液或截留液，即得所述细菌素。

有益效果：

本发明提供的耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株，分离自发酵乳制品，能够产生可抑制李斯特菌的细菌素。

耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株产生的可抑制李斯特菌的细菌素，具有以下的优点和特性：

（1）在较宽的pH范围内都具有抑菌活性（pH2-11），对热的稳定性较好，在100℃条件下处理30分钟活性基本不变；细菌素分子较小，可以作为生物安全的食品添加剂使用。

（2）该细菌素只对李斯特菌具有抑制作用，因此将该细菌素应用于食品保鲜时可有效避免广谱杀菌细菌素对食品中其他细菌的抑制，在不影响食品正常菌群的前提下，达到对病原李斯特菌专一性抑制的效果。

（3）由于耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株分离自发酵乳制品，所以其产生的细菌素对人体安全。

（4）耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素是通过杀菌方式抑制李斯特菌生长的，可以避免仅抑菌不杀菌类细菌素作用时，当浓度不够情况下被抑制菌迅速反弹；另外，耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素对李斯特菌的抑制具有瞬时高效的特点。

本发明采用耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株发酵后纯化制得细菌素，方法简单，效率高，成本低，安全。

附图说明

图1耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产的细菌素的电泳图；其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2和泳道3为耐久肠球菌（Enterococcusdurans）NJ株过夜培养物上清，泳道4为同等pH值的培养基样品；箭头所示为细菌素的抑菌区域。

图2耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素对李斯特菌细胞内ATP水平的消散结果，纵坐标是荧光强度值，单位是AU；其中细菌素是耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ所产细菌素的缩写，细菌素/10倍是指耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ所产细菌素稀释液，Nisin/10倍是指Nisin稀释液。

图3各物质对李斯特菌细胞膜内外电位势(ΔΨ)的改变，横坐标S代表时间秒，D纵坐标Int代表荧光强度值，单位是AU；其中图A、B、C、D分别是耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素、Nisin、耐久肠球菌（Enterococcusdurans）NJ株所产细菌素稀释液和Nisin稀释液单独作用李斯特菌后导致其细胞膜内外电位势(ΔΨ)的改变结果；G：葡萄糖溶液；N：尼日利亚菌素；V：缬氨霉素；NJ：耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素；W：耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素稀释液；H：Nisin稀释液。

图4各物质对李斯特菌细胞膜内外跨膜pH梯度(ΔpH)的改变，横坐标S代表时间秒，纵坐标Int代表荧光强度值，单位是AU；图A、B、C和D分别是耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素，Nisin，耐久肠球菌（Enterococcusdurans）NJ株所产细菌素稀释液和Nisin稀释液单独作用李斯特菌后对其细胞膜内外跨膜pH梯度(ΔpH)的改变；N：尼日利亚菌素；V：缬氨霉素；NJ：耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素；W：耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素稀释液；H：Nisin稀释液。

保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。

参椐的微生物（株）：NJ。

分类命名：耐久肠球菌（Enterococcus durans）。

保藏号：CGMCC No.7236。

保藏日期：2013年1月31日。

具体实施方式

实例1耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株的筛选和鉴定

MRS培养基含有：9.0g/L蛋白胨，6.0g/L牛肉膏粉，4.5g/L酵母浸粉，18.0g/L葡萄糖，1.0mL/L吐温80，2.0g/L磷酸氢二钾，5.0g/L乙酸钠，2.0g/L柠檬酸三铵，0.2g/L硫酸镁，0.06g/L硫酸锰，pH值为6.5。

将内蒙古传统发酵乳制品10倍梯度稀释后，涂布至MRS培养基上，分离单菌落，控制每个平皿中的单菌落个数处于100-400之间，在37℃培养箱中过夜培养。然后将平皿中长满单菌落的培养基挑起，水平放入接种有0.5%新鲜李斯特菌（L.monocytogenes CMCC54004，购自中国药品生物制品检定所，下同）的琼脂平皿上，继续培养10-16小时，挑取抑制李斯特菌生长的菌落（产生透明圈）。从能够抑制李斯特菌生长的菌落中筛选革兰氏染色阳性、触酶阴性的菌落。获得了能够显著抑制李斯特菌生长的NJ株。

将NJ株进行16S rDNA（SEQ ID NO:1）序列同源性分析，鉴定为耐久肠球菌（Enterococcus durans），命名为耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株。

实施实例2制备耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株产生的细菌素

（1）耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株发酵液的制备

种子培养基配方：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏粉10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，吐温-801.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH值6.2，溶剂为水。

发酵培养基1配方：葡萄糖18.0g/L，蛋白胨9.0g/L，牛肉膏粉6.0g/L，酵母浸粉4.5g/L，吐温-801.0mL/L，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.06g/L，pH值6.5，溶剂为水。

发酵培养基1的前处理：将AMBERLITE XAD16树脂（购自Sigma）用pH值2、体积百分比浓度为70%的异丙醇水溶液漂洗，然后用漂洗过的AMBERLITEXAD16树脂对发酵培养基1进行澄清处理，除去AMBERLITE XAD16树脂后，

进行高压灭菌。

将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株接种至种子培养基中，普通生化培养箱中37℃静置发酵培养16小时，得到种子液。

将种子液按照接种量为1%，接种至前处理后的发酵培养基1中，普通生化培养箱中37℃静置发酵培养20小时，得到发酵液1。

检测发酵液1上清抑制李斯特菌的效果：将发酵液1在10000g条件下离心10min取上清。将上清用0.22um的滤膜过滤除菌后，进行SDS-PAGE电泳。同时，为排出有机酸的影响，将发酵培养基1用乳酸调至pH等于耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株发酵液上清pH值后与发酵液一同进行SDS-PAGE电泳。在脑心浸液肉汤培养基（BHI，购自北京陆桥技术有限责任公司）中加入0.5%的新鲜过夜培养的李斯特菌菌液之后，制备固体培养基，待固体培养基表面的水汽蒸发后，在其表面层叠放入上述SDS-PAGE电泳后得到的凝胶，在超净台中自然晾干，然后将此平皿4℃过夜，使细菌素渗透到培养基中。之后放入37℃培养箱中培养，检测抑菌圈的有无。结果发现，平板上仅在对应于发酵液1上清泳道的3kDa到6kDa之间区域出现了李斯特菌的生长抑制带，而用乳酸调节pH的对照泳道没有抑菌区域出现。说明耐久肠球菌NJ株发酵液上清中含有能抑制李斯特菌生长的细菌素，其分子量的大小在3kDa到6kDa之间，如图1所示。

发酵培养基2配方：酪蛋白胨15.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5.0g/L，pH值7.3，溶剂为水。

将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株接种至种子培养基中，普通生化培养箱中36℃静置培养15小时，得到种子液。

将发酵培养基2进行前处理，参照发酵培养基1。

将种子液按照接种量为2%，接种至前处理后的发酵培养基2中，普通生化培养箱中36℃静置发酵培养26小时，得到发酵液2。

发酵培养基3配方：酪蛋白胨2.5g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.5g/L，牛肉膏粉5.0g/L，维生素C0.5g/L，β-甘油磷酸钠19g/L，乳糖5.0g/L，pH值7.0，溶剂为水。

将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株接种至种子培养基中，普通生化培养箱中39℃静置发酵培养16小时，得到种子液。

将发酵培养基3参照发酵培养基1进行前处理。

将种子液按照接种量为3%，接种至前处理后的发酵培养基3中，39℃培养箱中培养36小时，得到发酵液3。

（2）发酵液的纯化

将发酵液1、2和3分别进行下述纯化。

将各发酵液在10000g下离心30min，分离上清和菌体。将AMBERLITE XAD16树脂进行预处理：用超纯水漂洗，然后用异丙醇漂洗。将发酵液上清采用预处理后AMBERLITE XAD16树脂吸附其中的细菌素，收集AMBERLITE XAD16树脂颗粒后，用超纯水漂洗三遍，然后用体积浓度为70%的异丙醇水溶液洗脱，收集洗脱液作为细菌素粗品I。将体积浓度为70%的异丙醇水溶液加入到菌体中，离心取上清，获得细菌素粗品II。将细菌素粗品I和II混合，得到细菌素粗品。

从发酵液1制备的细菌素粗品旋转蒸发浓缩，用截留分子量为10kDa的超滤管超滤，取透过液；将所述透过液用截留分子量为1000Da的透析袋透析，透析液为蒸馏水，取保留液即得可抑制李斯特菌的细菌素。

从发酵液2制备的细菌素粗品旋转蒸发浓缩，用截留分子量为9kDa的超滤管超滤，取透过液；将所述透过液用截留分子量为2000Da的透析袋透析，透析液为蒸馏水，取保留液即得可抑制李斯特菌的细菌素。

从发酵液3制备的细菌素粗品旋转蒸发浓缩，用截留分子量为8kDa的超滤管超滤，取透过液；将所述透过液用截留分子量为3000Da的超滤膜超滤，透析液为蒸馏水，取截留液即得可抑制李斯特菌的细菌素。

将发酵液1、2和3中提取的细菌素，计算其纯化倍数及对李斯特菌的效价。效价的检测方法是通过二倍稀释法进行。二倍稀释法具体为：将耐久肠球菌NJ株发酵液上清用等体积的超纯水稀释后，取5ul稀释液滴加到接种有0.5%新鲜李斯特菌的BHI固体培养基上，过夜培养，观察能抑制李斯特菌生长的最大稀释度，该稀释度的倒数×200即为每毫升耐久肠球菌NJ株发酵液上清中的细菌素效价。具体结果见表1。

表1细菌素的纯化倍数及对李斯特菌的效价

将各发酵液提取的细菌素进行SDS-PAGE电泳，切取具有抑制李斯特菌生长区域的条带，进行MALDI-TOF质谱分子量测定（由苏州普泰生物技术有限公司进行鉴定），得到耐久肠球菌细菌素的分子量为4968Da。

实施实例3耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株产生的细菌素的性质

将实施例2中发酵液1离心后，得到的发酵液上清进行下列性质测定。

（1）pH稳定性：用盐酸将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株发酵液上清的pH值分别调至pH2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，然后在37℃保温2小时。采用二倍稀释法，滴加5ul发酵液上清于接种有0.5%新鲜李斯特菌的BHI固体培养基上，过夜培养，观察能抑制李斯特菌生长的最大稀释度。结果发现，各pH条件下，发酵液上清能够抑制李斯特菌生长的最大稀释度为8倍。该结果说明，耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素在pH值2-11之间都具有较好的稳定性。

（2）热稳定性：将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株发酵液上清分别在45℃、60℃、75℃、100℃、121℃保温处理1小时。然后采用二倍稀释法，滴加5ul发酵液上清于接种有0.5%（v/v）新鲜李斯特菌的BHI固体培养基上，过夜培养，观察能抑制李斯特菌生长的最大稀释度。结果发现，各温度条件下，发酵液上清能够抑制李斯特菌生长的最大稀释度为8倍。该结果表明：耐久肠球菌NJ株所产细菌素在121℃以下均具有较好的热稳定性。

（3）抑菌谱：使用MRS和BHI培养基，研究了耐久肠球菌（Enterococcusdurans）NJ株所产细菌素的抑菌谱，检测方法为将新鲜过夜培养的待检菌株的发酵液，按0.25%（v/v）的初始接种量接种至MRS或BHI培养基中制备固体培养基，然后滴加10ul实施例2中的发酵液上清，放入普通生化培养箱中按待检菌株的培养条件培养，检测抑菌圈的有无及大小，有抑菌圈出现则说明耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素能抑制该菌株，抑菌圈越大则对该菌株的抑制作用越强。结果发现：耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产的细菌素可高效抑制李斯特菌，对屎肠球菌和粪肠球菌也有一定程度的抑制，而对嗜热链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳品工业中的常见菌种没有抑制效果，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌也不能抑制。该结果说明耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素应用于食品保鲜时可有效避免广谱杀菌细菌素对食品中其他细菌的抑制，在不影响食品正常菌群的前提下，达到对病原李斯特菌专一性抑制的效果。

（4）对常见的蛋白酶或淀粉酶的敏感性：检测了常见蛋白酶和淀粉酶降解耐久肠球菌NJ株所产的细菌素的效果，检测方法为将新鲜过夜培养的李斯特菌按0.25%的初始接种量接种至BHI培养基中制备固体培养基，然后滴加10ul实施例2中的发酵液上清作为正对照，同时滴加10ul与不同酶分别孵育1h的对应发酵液上清作为检测对象，将平板放入普通生化培养箱中37℃培养10-16h，检测抑菌圈的有无，有抑菌圈出现则说明耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素不被该酶降解。检测对象包括：胃蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶和α-淀粉酶，所有酶均购自Sigma公司。结果发现：蛋白酶K能显著降解该细菌素；胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶能部分降解该细菌素；而胃蛋白酶和α-淀粉酶对该细菌素没有降解作用。该结果说明耐久肠球菌（Enterococcusdurans）NJ株所产细菌素对蛋白酶K非常敏感，对胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶部分敏感，而对胃蛋白酶和α-淀粉酶不敏感。

（5）耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素对李斯特菌的作用方式

1.耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素消散李斯特菌细胞内ATP水平的实施过程如下：按1%（体积比）的初始接种量，将李斯特菌接种到10mLBHI培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）中，37℃培养至OD₆₆₀=0.6-0.7，然后用等体积的pH6.5的50mM的MES缓冲液洗涤细胞一次，重悬在5mL的MES缓冲液中，加入0.2%（质量百分浓度）的葡萄糖溶液活化细胞20分钟。将细胞分装成1mL的小份，分别加入Nisin（乳链菌肽，终浓度10IU/mL，作为阳性对照），Nisin稀释液（用pH=1.7的0.02M的盐酸稀释至1IU/mL，作为阴性对照），耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素（128AU/mL）或耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素稀释液（用超纯水稀释10倍至12.8AU/mL，作为阴性对照）以及等体积的超纯水作为阴性对照。然后分别在2.5，5，10和15分钟时，取100ul细胞悬液与ATP生物发光检测试剂盒（购自Sigma公司）中的ATP检测液混合之后检测样品的生物发光值。结果如图2所示。由图2可见，经耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株细菌素处理之后，细胞内的ATP分子大量外泄，从而引起李斯特菌细胞内ATP能量水平的迅速下降从而导致菌体死亡。

2.耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产的细菌素对李斯特菌作用后改变细胞膜内外的质子动力势方面，采用两种荧光探针进行了研究。

用细胞膜荧光探针DiSC₃(5)（购自Sigma公司）研究了细胞膜内外电位势(ΔΨ)的改变，过程如下：按1%（体积比）的初始接种量，将李斯特菌接种到50mL BHI培养基中，37℃培养至OD₆₆₀=0.6-0.7，然后5000g离心收集菌体细胞，用等体积的pH7.0的50mM的HEPES缓冲液洗涤细胞两次，重悬在500uL的HEPES缓冲液中，冰上保存备用。在1cm光程的石英比色杯中加入2mL的50mM的HEPES缓冲液，然后加入5ul、2mM的细胞膜荧光探针DiSC₃(5)储液，选定激发波长和发射波长分别为643和666nm，待荧光信号稳定后加入10ul的细胞悬液，待信号平衡2min左右时，加入20ul的20%的葡萄糖溶液使细胞活化。加入2ul5mM的尼日利亚菌素（购自Sigma公司）将细胞内的ΔpH转变成ΔΨ，当信号稳定后分别加入Nisin（乳链菌肽，终浓度10IU/mL，作为阳性对照），Nisin稀释液（用pH=1.7的0.02M的盐酸稀释至1IU/mL，作为阴性对照），耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素（128AU/mL）或耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素稀释液（用超纯水稀释10倍至12.8AU/mL，作为阴性对照），记录荧光信号的变化。最后用2ul、2mM的缬氨霉素将剩余的ΔΨ消除。结果如图3所示。结果表明经细菌素处理之后，李斯特菌的细胞膜发生损伤，导致细胞膜内物质大量外泄，从而导致菌体死亡。

用BCECF探针研究了细胞膜内外跨膜pH梯度(ΔpH)的变化，过程如下：按1%（体积比）的初始接种量，将李斯特菌接种到40mL BHI培养基中，37℃培养至OD₆₆₀=0.6-0.7，然后5000g离心收集菌体细胞，用等体积的pH6.0的50mM的磷酸钾缓冲液（KPi缓冲液）洗涤细胞两次，重悬在400uL冰冷的KPi缓冲液中，加入10ul10mM的BCECF探针（购自Sigma公司），室温放置5min使探针进入细胞内，然后用1mL50mM的KPi缓冲液洗涤细胞4次，重悬在300ul的KPi缓冲液中，冰上保存备用。在1cm光程的石英比色杯中加入2mL的50mM的KPi缓冲液（pH5.5），然后加入3.3ul BCECF探针活化的细胞悬液，选定激发波长和发射波长分别为502和525nm，待荧光信号稳定后加入2ul2mM的缬氨霉素将细胞内的ΔΨ转变成ΔpH，待信号稳定后分别加入Nisin（乳链菌肽，终浓度10IU/mL，作为阳性对照），Nisin稀释液（用pH=1.7的0.02M的盐酸稀释至1IU/mL，作为阴性对照），耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素（128AU/mL）或耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素稀释液（用超纯水稀释10倍至12.8AU/mL，作为阴性对照），记录荧光信号的变化。最后用2ul的尼日利亚菌素将剩余的ΔpH消除。结果如图4所示。结果表明经细菌素处理之后，李斯特菌的细胞膜受到损伤，细胞膜内外质子动力势迅速降低，导致细胞膜内物质大量外泄和细胞本身能量水平的下降，进而导致菌体死亡。

通过实验1、2，说明耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株所产细菌素是通过杀菌方式抑制李斯特菌生长的，可以避免仅抑菌不杀菌类细菌素当浓度不够时被抑制菌迅速反弹；且其对李斯特菌的抑制具有瞬时高效的特点。

   SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京财经大学

 

<120>  耐久肠球菌及其产生的可抑制李斯特菌的细菌素

 

<130>  20130627

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1457

<212>  DNA

<213>  耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株

 

<400>  1

acttcacccc aatcatctat cccaccttag gcggctggct ccaaaaggtt acctcaccga     60

 

cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta    120

 

ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact agcgattccg gcttcatgta ggcgagttgc    180

 

agcctacaat ccgaactgag agaagcttta agagattagc ttagcctcgc gacttcgcga    240

 

ctcgttgtac ttcccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt    300

 

gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc ttgctagagt gcccaactga    360

 

atgatggcaa ctaacaataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga    420

 

cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactttgcc cccgaagggg aagctctatc    480

 

tctagagtgg tcaaaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa    540

 

ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt    600

 

cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actgaagggc ggaaaccctc    660

 

caacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc    720

 

cccacgcttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaga gccgccttcg ccactggtgt    780

 

tcctccatat atctacgcat ttcaccgcta cacatggaat tccactctcc tcttctgcac    840

 

tcaagtctcc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact    900

 

taagaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg gacaacgctt gccacctacg    960

 

tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttagata ccgtcaaggg   1020

 

atgaacagtt actctcatcc ttgttcttct ctaacaacag agttttacga tccgaaaacc   1080

 

ttcttcactc acgcggcgtt gctcggtcag actttcgtcc attgccgaag attccctact   1140

 

gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc tcagtcccaa tgtggccgat caccctctca   1200

 

ggtcggctat gcatcgtagc cttggtgagc cgttacctca ccaactagct aatgcaccgc   1260

 

gggtccatcc atcagcgaca cccgaaagcg cctttcaaat caaaaccatg cggtttcgat   1320

 

tgttatacgg tattagcacc tgtttccaag tgttatcccc ttctgatggg caggttaccc   1380

 

acgtgttact cacccgttcg ccactcttct ttttccggtg gagcaagctc cggtggaaaa   1440

 

agaagcgtac gactgca                                                  1457

 

 

Claims (10)

1.耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株，其保藏登记号为：CGMCC No.7236。

2.一种权利要求1所述耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株产生的可抑制李斯特菌的细菌素。

3.根据权利要求2所述细菌素，其特征在于：所述细菌素的分子量为4900-5000 Da。

4.一种权利要求2或3所述细菌素的制备方法，其特征在于：发酵培养耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株，获得发酵液，纯化后得到所述细菌素。

5.根据权利要求4所述细菌素的制备方法，其特征在于：所述耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株的发酵培养基含有：2-25 g/L碳源，15-20 g/L氮源，5-20 g/L无机盐，pH 5-8。

6.根据权利要求5所述细菌素的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基还含有0.8-1.5mL /L表面活性剂；所述发酵培养基还含有0.1-3 g/L维生素。

7.根据权利要求6所述细菌素的制备方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、乳糖、干酪乳清和糖蜜中的一种或两种以上；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏粉、酵母浸粉、酪蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或两种以上，所述无机盐为磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、β-甘油磷酸钠中的一种或两种以上，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-20中的一种或两种以上；所述维生素为维生素C、维生素D中的一种或两种以上。

8.根据权利要求7所述细菌素的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基含有：18.0 g/L葡萄糖，9.0 g/L蛋白胨，6.0 g/L牛肉膏粉，4.5 g/L酵母浸粉，1.0 mL/L吐温-80，2.0 g/L磷酸氢二钾，5.0 g/L乙酸钠，2.0 g/L柠檬酸三铵，0.2 g/L硫酸镁，0.06 g/L硫酸锰，pH值为6.5。

9.根据权利要求8所述细菌素的制备方法，其特征在于：所述耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株的发酵培养方法为：将耐久肠球菌（Enterococcus durans）NJ株接种至所述发酵培养基，在36-39℃条件下发酵培养16-36 h，得到发酵液。

10.根据权利要求9所述细菌素的制备方法，其特征在于：所述发酵液的纯化方法为：

（1）将发酵液离心取上清，用大孔吸附树脂吸附，收集吸附后的大孔吸附树脂，解吸附后得到细菌素粗品；

（2）将所述细菌素粗品用截留分子量为10000-8000Da超滤膜或超滤管进行超滤，取透过液；将所述透过液用截留分子量为1000-3000Da的透析袋或超滤膜分离，取保留液或截留液，即得所述细菌素。

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