CN109825495B

CN109825495B - 一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法

Info

Publication number: CN109825495B
Application number: CN201910156087.4A
Authority: CN
Inventors: 刘松; 黎青华; 堵国成; 李江华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN109825495A

Abstract

本发明公开了一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法，属于高通量筛选技术领域。本发明利用固态发酵的方式表征液态发酵色素产量的高低，成功解决了孔板液态发酵溶氧偏低，菌丝发酵时容易长成球状而导致色价极低甚至发酵失败的问题。结合ARTP诱变技术、流式细胞仪高效分选技术，成功实现了高产红曲色素红曲霉的高通量快速筛选，且摇瓶验证效果极佳，且极大地节省了人力、物力，提高了筛选效率，为红曲霉菌的高通量筛选提供了一种有效的方法。

Description

一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法，属于高通量筛选技术领域。

背景技术

红曲红是一种由红曲霉生产的、具有较高药用及营养价值的天然色素。红曲红色素作为调色剂广泛应用于肉制品、面制品、饮料及医药等领域，因其安全无害受到广大消费者的青睐。

选育红曲色素的高产菌株是提高发酵产量直接有效的策略。相比于传统的物理化学诱变、平板分离筛选，ARTP诱变具有高效、安全、便捷等优势，且通过流式细胞仪分选、高通量培养筛选，能节省大量的人力物力。同时筛选周期缩短、自动化操作使效率显著提高，是高效筛选高产红曲色素红曲霉菌株行之有效的方法。

目前常用的诱变方法有物理诱变、化学诱变等，紫外诱变具有使用时间长、效果好、设备简单等优势，但紫外诱变的能量比较低，在遗传物质中只能引起单一的损伤和突变。化学诱变的突变率通常要比物理诱变高，并且十分经济，但它引起的突变多是引起碱基对换，这样容易发生回复突变，从而导致变异不稳定；此外，化学诱变用到的化学诱变剂大多是强致癌剂，具有较高的安全隐患。

众多研究表明，利用诱变育种可获得高产生理活性产物的优良菌株，但筛选过程中存在随机性和盲目性大、工作量繁琐、结果难以预测等缺点。目前的经典诱变结合高通量筛选的方法，应用于筛选红曲霉高产菌株时，由于孔板内的溶氧偏低，且红曲霉在孔板里液态发酵时容易长成球状，导致色价低至几个单位或发酵失败，不能明显体现诱变效果，降低了筛选的有效性。此外，红曲霉的发酵周期比较长，蒸发量太大会使色价比实际值偏高，还会影响菌丝体的正常生长，甚至培养基变干导致液态发酵失败。因此，亟需提供一种有效的高产红曲色素红曲霉菌株的高通量筛选方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高通量筛选高产红曲色素红曲霉菌株的方法，包括如下步骤：

(1)获得红曲霉的多个含死孢子在内的待筛选的孢子；

(2)利用PI(碘化丙啶)染料和FDA(荧光素双乙酸酯)染料对待筛选的孢子悬液进行染色；

(3)上流式细胞仪检测孢子活性并分选有活性的单孢子至装有固体发酵培养基的高通量孔板中；

(4)将高通量孔板进行固体发酵培养；

(5)向高通量孔板里直接添加体积分数为70％-75％的酒精，震荡浸提25-30min，离心后取上清，在合适的浓度下用酶标仪测定505nm下的吸光值OD，比较红曲色素积累的相对高低；

(6)选取上一步得到的相对高产的菌株多株进行复筛。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中的固体发酵条件为：在33.5±1℃下，静置培养120-144h。

在本发明的一种实施方式中，所述固体发酵培养基的配制方法为：添加籼米粉12.5％、黄豆粉2.5％、玉米浆0.9％、NaNO₃ 0.18％、琼脂1.5％～2％；先加入0.15％～2％的中温α-淀粉酶升温至60℃，酶解30分钟，定容后再用乳酸调pH至3.5-4.0。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色具体为：将待分选的孢子悬液浓度调至10⁵～10⁶个/mL，调整FDA染料的终浓度为110-130μg/mL，室温下染色15-20分钟；然后添加PI染料至终浓度为5-7μg/mL，4℃染色8-10分钟，离心去上清，除去过量的染料，用相同体积的pH为7.2的PBS缓冲液重悬。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)的具体是：以没有任何荧光素的样品为对照；有活性的孢子与FDA染料结合发绿荧光，由FL1通道检测；无活性的孢子与PI染料结合发红荧光，由FL3通道检测；利用流式细胞仪将发绿荧光的区域最集中的部分分选至高通量孔板中，每孔分选设定单孢子。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中，固体发酵培养基的高通量孔板装液量为：96孔为600-800μL/孔，48孔为1.2-1.5mL/孔，24孔为2.4-3mL/孔。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子是将红曲霉进行诱变后得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述诱变是采用常压室温等离子体诱变技术(ARTP)诱变。

在本发明的一种实施方式中，诱变条件设定为：孢子悬液为10μL，载片与等离子体发生器射流出口间距为2mm，功率为80w，通气量10SLM，诱变时间为40-45s。

本发明的第二个目的是提供一种提高筛选高产红曲色素红曲霉菌株准确性的方法，是将待筛选的菌株接种到固态发酵培养基中培养，向培养液中里直接添加体积分数为70％-75％的酒精，震荡浸提25-30min，离心后取上清，在合适的浓度下用酶标仪测定505nm下的吸光值OD，比较红曲色素积累的相对高低。

本发明的有益效果：本发明方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、FDA-PI双染色法、流式细胞术分析分选法、酶标仪检测、固态发酵和高通量筛选技术，提供了一种高效筛选高产红曲色素的红曲霉的方法。流式细胞仪能够在短时间内对目标孢子进行分选，构建庞大的突变库。孔板里的固态直接发酵避免了液态发酵的低溶氧问题、菌丝长成球状导致发酵失败问题以及长时间培养蒸发量大的问题；同时相比传统的平板培养后保菌再发酵方法，筛选周期由原来的16-18天缩短到6-8天。

附图说明

图1：ARTP诱变致死率与正向突变率曲线图。

图2：固态发酵和液态发酵色素积累趋势图。

图3：摇瓶复筛验证效果图：A，孔板筛初筛高产菌株；B，高产菌株摇瓶复筛验证。

具体实施方式

(一)培养基

斜面培养基：可溶性淀粉4％、麦芽糖4％、蛋白胨3％、琼脂粉2％，乳酸调pH值5.3。

种子培养基：籼米粉5％、玉米浆1.2％、NaNO₃ 0.2％、酵母膏0.9％、KH₂PO₄0.18％、MgSO₄·7H₂O 0.09％，乳酸调pH值至4.5；固体培养基加2％的琼脂。

固体发酵培养基：籼米粉12.5％、黄豆粉2.5％、玉米浆0.9％、NaNO₃ 0.18％、1.5％～2％琼脂。先加入0.15％～2％的中温α-淀粉酶升温至60℃，酶解30分钟，定容后再用乳酸调pH 3.7。

液体发酵培养基：籼米粉12.5％、黄豆粉2.5％、玉米浆0.9％、NaNO₃ 0.18％。先加入0.15％～2％的中温α-淀粉酶升温至60℃，酶解30分钟，定容后再用乳酸调pH 3.7。

(二)配制荧光染料

(1)PI染液：准确称取0.01g PI，加入10mL pH为7.2的PBS缓冲液，配制成浓度为1mg/mL的母液，置于棕色瓶4℃避光保存。

(2)FDA染液：准确称取0.05g FDA，溶于1mL的丙酮中，再加入9mL无菌水，配制成浓度为5mg/mL的FDA母液，置于棕色瓶-20℃保存。

(三)FDA-PI染色、上样检测分选、色价检测、摇瓶液态发酵复筛验证

1.FDA-PI染色

将待分选的孢子悬液浓度调至10⁵～10⁶个/mL，调整FDA染料的终浓度为120μg/mL，室温下染色20分钟；然后添加PI染料至终浓度为7μg/mL，4℃染色10分钟，离心去上清，除去过量的染料，用相同体积的pH为7.2的PBS缓冲液重悬。

2.上样检测分选

将重悬的孢子悬液400目尼龙网过滤后上流式细胞仪(MoFlo XDP)分析。根据染色剂发射荧光选择合适通道检测，设定合适光电倍增管电压，阈值等参数。用Summit 5.4软件分析，自定分选条件，将红曲霉菌活孢子分选到准备好的孔板中进行培养发酵。

3.色价检测

向发酵结束的高通量孔板里直接添加等体积的70％的酒精，震荡浸提30分钟，离心后取上清，在合适的浓度下用酶标仪测定505nm下的吸光值OD，比较红曲色素积累的相对高低，挑选2-3株高产菌接种斜面保菌。

4.摇瓶液态发酵复筛验证

挑取两到三环高产菌菌丝体接种到种子培养基中(50mL/500mL)，33.5℃、220rpm摇床培养24h。然后按8％的接种量将种子液转接发酵培养基(60mL/500mL)，33.5℃、220rpm发酵培养6天，检测505nm下的吸光值OD，比较色价高低。

实施例1ARTP诱变获得不同致死率的孢子悬液

将红曲霉从试管斜面转接PDA平板，培养成熟后用无菌水洗涤红曲霉平板，利用脱脂棉过滤后获得干净的孢子悬液。然后，用无菌去离子水洗涤2～3次，去掉溶解的色素，悬浮备用。取制好的孢子悬液，血球计数板计数调整合适浓度(10⁷个/mL，体积分数15％甘油)，取10μL孢子悬液均匀涂于载片上进行诱变。诱变条件设为：通气量10SLM、功率80W、控制时间分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s，获得不同致死率的孢子悬液。

结果如图1所示，诱变时间为40s时，正突变率为44.6％，致死率为94.7％。诱变时间越长，致死率越高。

实施例2FDA和PI染色剂对诱变后的孢子悬液染色

诱变结束后，将载片浸于500μL的pH为7.2的PBS缓冲液中，震荡2分钟洗脱，利用雪球计数板调整孢子悬液浓度为10⁵～10⁶个/mL。向一定体积的孢子悬液中加入FDA染料，并调整FDA染料的终浓度为120μg/mL，室温下染色20分钟；然后添加PI染料至终浓度为7μg/mL，4℃染色10分钟。离心去上清，除去过量的染料，用相同体积的pH为7.2的PBS缓冲液重悬。此步骤重复2-3次。

实施例3流式细胞仪检测分选

将没有进行染色的孢子悬液作为阴性对照，代表细胞背景荧光信号。将没有诱变的孢子悬液与FDA染色剂结合的样品作为阳性对照一，将完全没有活性的孢子悬液和PI染料结合的样品作为阳性对照二，照调节基本电压明确区分阴性与阳性群体界限。固定条件后进行样品检测。取处理好的孢子悬液上流式细胞仪(MoFlo XDP)分析，所得数据用Summit5.4软件分析。有活性的孢子与FDA染料结合发绿荧光，由FL1((530±15)nm)通道检测；无活性的孢子与PI染料结合发红荧光，由FL3((610±15)nm)通道检测。利用流式细胞仪将发绿荧光的区域最集中的部分分选至高通量孔板中，每孔分选设定单孢子。分选有活性的单孢子至装有固体发酵培养基的高通量孔板中。

实施例4高通量筛选高产菌株

将分选好的孔板放在33.5℃的恒温培养箱中静置培养5天，发酵结束后向孔板里直接添加等体积的70％的酒精，震荡浸提30分钟后，离心取上清，在合适的浓度下用酶标仪测定505nm下的吸光值OD，比较红曲色素积累的相对高低，挑选2-3株高产菌接种斜面保菌。

对比例

将实施例3中分选到的有活性的单孢子置于装有液体发酵培养基的高通量孔板中。培养条件是33.5℃的孔板摇床中静置培养5天。发酵结束后，向孔板里直接添加等体积的70％的酒精，震荡浸提30分钟后，离心取上清，稀释到合适的浓度，用酶标仪测定505nm下的吸光值OD，比较红曲色素积累的相对高低。

结果如图2所示，发酵48h后，使用固态发酵方法得到的上清液色价为135U/mL，而液态发酵方法，得到的上清液色价为24U/mL；发酵96h后，使用固态发酵方法得到的上清液色价为80.5U/mL，而液态发酵方法，得到的上清液色价为642U/mL，色价偏高，误差较大，应用于筛选菌株时，无法准确地对比出不同菌株间的色价高低。且液态发酵还存在低溶氧、菌丝长成球状导致发酵失败(培养基几乎不变色)以及长时间培养蒸发量大等问题。

实施例5摇瓶发酵复筛验证

挑取两到三环高产菌菌丝体接种到种子培养基中(50mL/500mL)，33.5℃、220rpm摇床培养24h。然后按8％的接种量将种子液转接固体发酵培养基(60mL/500mL)，33.5℃、220rpm发酵培养6天，检测505nm下的吸光值OD，比较色价高低。摇瓶复筛验证效果如图3所示，孔板固态发酵色价的高低趋势和摇瓶液态发酵的结果相同，说明该方法可准确高效地筛选目标菌株。

出发菌株产的红曲色素的色价为550U/mL，突变菌株产的红曲色素的色价可达1184U/mL，相较于出发菌株提高了1.2倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种快速筛选高产红曲色素红曲霉菌株的方法，其特征在于，应用高通量筛选技术进行筛选，所述筛选包括如下步骤：

（1）获得红曲霉的多个含死孢子在内的待筛选的孢子；所述待筛选孢子是将红曲霉进行诱变后得到的；所述诱变是采用常压室温等离子体诱变技术(ARTP)诱变；

（2）利用PI染料和FDA染料对待筛选的孢子悬液进行染色；所述染色为，将待分选的孢子悬液浓度调至10⁵～10⁶个/mL，调整 FDA染料的终浓度为110-130 μg/mL，室温下染色15-20分钟；然后添加PI染料至终浓度为5-7 μg/mL，4℃染色8-10分钟，离心去上清，除去过量的染料，用相同体积的pH为7.2的PBS缓冲液重悬；

（3）上流式细胞仪检测孢子活性并分选有活性的单孢子至装有固体发酵培养基的高通量孔板中，以没有任何荧光素的样品为对照；有活性的孢子与FDA染料结合发绿荧光，由FL1通道检测；无活性的孢子与PI染料结合发红荧光，由FL3通道检测；利用流式细胞仪将发绿荧光的区域最集中的部分分选至高通量孔板中，每孔分选设定单孢子；

所述固体发酵培养基的配制方法为：添加籼米粉12.5 %、黄豆粉2.5 %、玉米浆0.9 %、NaNO₃ 0.18 %、琼脂1.5% ~ 2%；先加入0.15 % ~ 2 % 的中温α-淀粉酶升温至60℃，酶解30分钟，再用乳酸调pH至3.5-4.0；

（4）将高通量孔板进行固体发酵培养，固体发酵条件为：在33.5±1℃下，静置培养120-144 h；

（5）向高通量孔板里直接添加体积分数为70%-75%的酒精，震荡浸提25-30 min，离心后取上清，在合适的浓度下用酶标仪测定505 nm下的吸光值OD，比较红曲色素积累的相对高低；

（6）选取上一步得到的相对高产的菌株多株进行复筛。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，固体发酵培养基的高通量孔板装液量为：96孔为600-800 μL/孔，48孔为1.2-1.5 mL/孔，24孔为2.4-3 mL/孔。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，诱变条件设定为：孢子悬液为10 μL，载片与等离子体发生器射流出口间距为2 mm，功率为80 w，通气量10 SLM，诱变时间为40-45 s 。