CN108624511B

CN108624511B - 产生荧光物质的红曲霉突变株及其应用

Info

Publication number: CN108624511B
Application number: CN201810478035.4A
Authority: CN
Inventors: 金海如; 王志鹏; 蒋湘艳
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2038-05-18
Also published as: CN108624511A

Abstract

本发明公开了一种紫色红曲霉JWZWZ‑24，为紫色红曲霉(Monascus purpureus)JWZWZ‑24，其保藏号为：CCTCC NO:M 2018142。本发明还同时公开了上述紫色红曲霉JWZWZ‑24的用途：用于制备富含MFA和MFB的红曲米；制备方法为依次进行以下步骤：制备种子液；将大米浸泡后灭菌，得灭菌后大米；按照8～12ml/100g的接种量，在灭菌后大米中加入种子液于30±1℃进行发酵，得含有MFA和MFB的红曲米。采用本发明的方法能提高荧光物质的产量，为大量生产红曲菌中的荧光物质提供保证。

Description

产生荧光物质的红曲霉突变株及其应用

技术领域

本发明涉及提高红曲中荧光物质产量的生产方法。

背景技术

红曲霉是一类小型的腐生丝状真菌，根据真菌学的分类，红曲霉属真菌门、子囊菌亚门、真子囊菌纲、散囊菌目、红曲菌科。该科下，只有红曲菌属，红曲菌在酸性条件下能够很好的生长，尤其喜欢在乳酸条件下生长。可以耐高温和乙醇，最适生长温度是25～30℃，最佳 PH值为3～5。醇、酸和糖能够作为其碳源，无机氮和有机氮可以做氮源。红曲霉在麦芽汁琼脂糖培养基上生长状况良好，早期菌落是白色的，成熟后的颜色在不同的物种有很大差别，比如有烟灰色、淡红色、紫红色、橙红色等等。菌落正面是皮膜状及绒毡状，反向是褶皱条纹或辐射状。

在中国古代红曲米也被称为丹曲，一直被认为是一个有双重作用的药用和食用产品，接种红曲菌的稻米，经过固态发酵得到红曲米，在我们国家，古代劳动人民很早就意识到红曲食用价值。因为古代没有更多的天然或合成色素，红曲米是古代人们发现和使用的一个可食用的染色材料。红曲米中由于添加了红曲菌，所以在发酵过程中产生不同的代谢产物，除了产生酶、有机酸、脂肪酸和氨基酸、色素、monacolins类化合物、γ-氨基丁酸等代谢物外，还能产生未知化合物，随着细曲菌研究的深入,越来越多的代谢物被分离和鉴定。黄志兵等(文献出处为Huang Z,Xu Y,Li L,et al.Two new Monascus metabolites withstrong blue fluorescence isolated from red yeast rice[J].Journal ofAgricultural&Food Chemistry,2008,56(1):112-8.)从红曲米中分离纯化得到两种新的荧光物质，这两种荧光物质有着相似的性质，结构表征显示这两种物质的分子量分别为356和384，命名为MFA(monasfluore A)和MFB(monasfluore B)。紧接着他又发明了用高效液相色谱法同时检测红曲米中该物质的含量，该方法中，检测出市场中的红曲米MFA的含量平均为2.44g/kg，MFB的含量平均为6.67g/kg。他采用MTT法检测了MFA和MFB对A549、HepG2和WI.38细胞增殖抑制的影响。结果表明MFA和MFB能明显抑制A549和HepG2细胞的增殖，MFA和MFB也能抑制WI-38细胞增殖，但抑制效果不明显。

由于荧光物质应用广泛，不仅能够作为发光材料，还有抑制癌细胞增值的功能，但是有关这方面的研究较少，故发明一种高效生产红曲菌中荧光物质生产方法必不可少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种荧光物质产量高的紫色红曲霉JWZWZ-24及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种紫色红曲霉JWZWZ-24，为紫色红曲霉(Monascus purpureus)JWZWZ-24，其保藏号为：CCTCC NO:M 2018142。

本发明还同时提供了上述紫色红曲霉JWZWZ-24的用途：用于制备富含MFA和MFB的红曲米。

本发明还同时提供了一种富含MFA和MFB的红曲米的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备种子液：

将保藏号为CCTCC NO:M 2018142的紫色红曲霉JWZWZ-24接种到培养基(PDA培养基) 中，于30±1℃、100～150r/min(较佳为130r/min)的条件下进行培养，直至培养基变红，得到种子液；

2)、大米的处理：

将大米在足量的水中浸泡10～14h(浸泡时间结束后，大米仍被水所覆没)，沥干水分后，进行灭菌(为常规的高温灭菌，即，121℃下灭菌30min)，得灭菌后大米(冷却至室温后，得灭菌后大米)；

3)、大米的发酵(固体培养)：

按照8～12ml/100g(较佳为10ml/100g)的接种量，在步骤2)所得的灭菌后大米中加入步骤1)所得的种子液，均匀混合后，于30±1℃进行发酵(黑暗培养)，当发酵至72小时起(即，第4天起)，按照每24小时补加一次无菌水的频率，在发酵产物中补加无菌水均匀混合后继续进行发酵，每次补加无菌水的体积量等于种子液的体积量；共发酵11～13天(较佳为12天)；得含有MFA和MFB的红曲米。

作为本发明的富含MFA和MFB的红曲米的制备方法的改进：

所述步骤1)为：在超净工作台上，用接种环挑取两环菌株，接种到装有50mL培养基(PDA 培养基)的三角瓶中，于30±1℃、100～150r/min(较佳为130r/min)的条件下进行培养，培养时间为2天，得种子液；

所述步骤2)为：大米在浸泡之前，先用流动水进行冲洗。

本发明采用的技术方案是：

红曲菌的筛选和纯化→对红曲菌株WZWZ进行UV-LiCl复合诱变→诱变株接种在灭菌的大米上→发酵培养→HPLC检测；所述红曲菌的筛选，从金华各地不同品种的红曲米中筛选出来的菌株。

红曲菌株WZWZ的最佳诱变条件为：最适紫外诱变时间为75s，最适LiCl浓度为0.04％，采用这两种诱变条件复合诱变得到的红曲菌株WZWZ-24荧光物质产量最高。

注：在制备红曲米的过程中应避免被杂菌污染。

本发明提供的红曲菌荧光物质产量提高的生产方法，利用红曲菌株突变株，但还能满足自身最基本的新陈代谢，来改变菌株的性状，为红曲米发酵生产荧光物质减少成本，提高原料利用效率，从而提高荧光物质的产量，为大量生产红曲菌中的荧光物质提供保证。

本发明具有如下有益效果：

1、成本低，效果好，易操作；

2、环境友好。

3、本发明提高红曲菌中生物荧光物质的产量；

传统红曲的生产是以大米为原料，经过浸米、蒸饭、冷却后，接种野生型红曲霉种子，通过固体培养法制取红曲；但操作繁琐，废水排放量大，能耗高，劳动强度大；表层地面培养占地面积多，产量低，质量不稳定。本发明提供了一株红曲菌WZWZ-24，能提高荧光物质产量，从而利于工业生产。本发明的固态发酵生产红曲米的方法：大米→清洗→浸泡一夜→灭菌→冷却至室温→接种种子液→固体培养→红曲米→检测MFA、MFB含量。

综上所述，本发明提供了关于提高红曲中荧光物质(monasfluore A MFA、monasfluore B MFB)产量的生产方法，对红曲菌株WZWZ进行UV-LiCl复合诱变通过固体发酵采用带有荧光检测器的高效液相色谱(HPLC)检测荧光物质的含量，得到一株高产荧光物质的菌株 WZWZ-24。本方法操作简便，原料成本低，效率高，环境友好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为紫外诱变剂量对菌株WZWZ致死率的影响对比图；

图2为氯化锂浓度对菌株致死率的影响对比图；

图3为诱变前后菌落形态特征比较图；左图为诱变前菌落图；右图为诱变后菌落图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：紫色红曲霉JWZWZ-24的诱变获取(不同紫外条件对菌株致死率的影响)：

一、菌株的活化：

在超净工作台上用接种环将斜面保存的菌株WZWZ(从金华地区红曲米WZWZ品种中分离而得)挑选于PDA平板上，放在30℃培养箱中培养(130r/min)7d，用于诱变。

二、菌悬液的制备

用灭菌的移液枪头吸取无菌水冲洗平板上的红曲菌孢子，反复冲洗洗涤3次后，用擦镜纸叠成两层过滤菌丝体于灭菌的试管中，用血球计数板计数，将孢子菌悬液稀释成10⁵～10⁶个/mL，用于诱变。

三、菌株紫外(UV)诱变剂量的选择

用无菌移液枪取10mL孢子悬液加入直径为9cm的无菌培养皿中，放入已灭菌的磁力搅拌珠，在距离45W紫外灯30cm下进行照射。分别照射0s,15s,30s,45s,60s,75s,90s,取出 0.2mL涂布在PDA培养基上，每个条件重复三次，以未照射的菌株作为对照，30℃避光培养7d，观察并计算菌落数，计算致死率，得到最佳紫外诱变致死时间。

式中：A为未经诱变对照组的菌落培养数，B诱变处理后的菌落数。

四、紫外线-LiCl复合诱变

将经紫外最佳致死剂量诱变的孢子菌悬液，取0.2mL分别放在含有氯化铝0.01％、0.02％、 0.03％、0.04％、0.05％、0.06％浓度的PDA平板中，每个处理三个平行，以不含氯化铝的PDA 平板作为对照。30℃避光培养7d，观察并计算菌落数，计算致死率，得到最佳复合诱变致死率。

五、筛选方法

先将突变菌株按照以下流程图进行固态发酵，然后用HPLC定量测定荧光物质的含量。

具体为依次进行如下步骤：

1)、制备种子液：

在超净工作台上，用接种环挑取两环菌株(突变菌株)，接种到装有50mL培养基(PDA 培养基)的三角瓶中，于30℃、130r/min的摇床中进行培养，培养时间为2d；此时培养基变红，得到种子液。

2)、大米的处理：

将大米装入1L的大烧杯里，先用自来水洗涤2-3次，然后于水中浸泡一夜(12h)，确保浸泡时间结束后，大米仍被水所覆没，用40目筛沥干(即，至不再滴水)，称取40g分装于250 mL的锥形瓶。放入高压蒸汽灭菌锅，121℃条件下灭菌30min，冷却至室温，待接种。

3)、大米的发酵(固体培养)：

在超净工作台里将灭菌的大米震荡松散，按照10ml/100g的接种量，用已灭菌消毒的移液枪向步骤2)所得的灭菌后大米中加入步骤1)所得的种子液，均匀混合后，于30℃培养箱进行发酵(黑暗培养)，当发酵至72小时起(即，第4天起)，在发酵产物中补加无菌水均匀混合后继续进行发酵，每24小时补加一次无菌水，每次补加无菌水的体积量等于种子液的体积量；共发酵12天；得含有MFA和MFB的红曲米。

4)、按照已公开发表于《Simultaneous determination of two Monascusmetabolites in red yeast rice by HPLC using fluorescence detection》的方法，对上述红曲米进行HPLC检测，从而得知MFA和MFB的含量。

也可按照已公开发表于《Two New Monascus Metabolites with Strong BlueFluorescence Isolated from Red Yeast Rice》的方法，从红曲米中分离获得MFA和MFB。

5)、高产突变株的遗传稳定性

将获得的突变株在PDA平板上连续培养10代，每一代都测量发酵生产荧光物质的含量，观察突变菌株是否稳定。

六、所得结果如下：

各种诱变剂对红曲菌株致死率影响如下：

(1)紫外诱变剂量对菌株WZWZ致死率的影响

紫外线对红曲菌孢子有致死作用，当致死率达到80％-90％时，突变率最高，选用此时的突变剂量作为最佳诱变剂量。以紫外线诱变时间为横坐标(s)，诱变后菌落的致死率(％) 为纵坐标，得到紫外线诱变时间和红曲菌株WZWZ致死关系图(图1)，随着诱变时间的增加，致死率增加，当诱变时间为75s时，致死率达到87.5％，故选择75s作为最佳诱变时间。

(2)紫外线-LiCl复合诱变对菌株WZWZ致死率的影响

同样，对红曲菌株WZWZ进行紫外线-LiCl复合诱变，分析复合诱变对菌株WZWZ的突变作用，采用LiCl含量为横坐标，菌株WZWZ致死率为纵坐标绘制致死率曲线如图2，由图可知当LiCl含量达到0.04％，菌株致死率达到90％，故选择LiCl含量为0.04％作为最佳诱变剂量。

(3)菌株复合诱变筛选结果

以WZWZ为出发菌株，制备孢子菌悬液(10⁵-10⁶个/mL)，在紫外灯下照射75s，吸取0.2ml涂布于含有0.04％LiCl的PDA培养基中进行复合诱变，放入30℃培养箱中培养7d，挑取菌落较大，生长旺盛的菌落于PDA平板中保存，诱变共得到突变株96株。

使用固态发酵方法制得红曲米，使用HPLC检测MFA、MFB的产量。部分菌株结果见表1，由表1可知，有的诱变株产量降低，有的诱变株产量提高，其中红曲菌诱变株WZWZ-24 中MFA、MFB含量最高MFA＝4.52g/kg、MFB＝8.38g/kg，比原始菌株提高了24.4％。故选择WZWZ-24进行遗传稳定性研究和后续实验。

表1、诱变菌株MFA、MFB的产量

另：其余90株突变菌株，MFA均小于1.66g/kg，MFB均小于4.52g/kg。

(4)突变株的稳定性实验

在紫外线照射75s，LiCl浓度为0.7的最佳诱变条件下，得到高产MFA、MFB菌株WZWZ-24，为了检测突变株的稳定性，对菌株WZWZ-24连续培养5代，每代三个重复，检测每代产MFA、MFB的含量。结果如表2，菌株WZWZ-24连续培养5代后，MFA、MFB 含量改变不明显，没有发生回复突变，遗传稳定性强，因此菌株WZWZ-24被选为发酵条件优化菌株。

表2、突变株WZWZ-24的遗传稳定性

(5)突变株形态特征

经最佳诱变条件诱变后获得一株比原始菌株WZWZ(左)产量提高24.4％的突变株(右)，编号为WZWZ-24突变株与出发菌株比较，菌落边缘由圆状变为不规则状。菌落颜色比原来较白，菌丝比原来较密集。菌落形态特征诱变前后比较见图3。

将该菌株进行保藏，保藏信息如下：紫色红曲霉JWZWZ-24(Monascus purpureusJWZWZ-24)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2018142，保藏时间2018年3月18日。

实验1、一种富含MFA和MFB的红曲米的制备方法，按照实施例1步骤五中的步骤1)～步骤3)进行制备；并按照实施例1步骤五中的步骤4)对所得的红曲米进行HPLC检测，MFA含量4.52g/kg，MFB含量8.38g/kg。

对比实验1、将目前现有的红曲霉(如表3所述)替代紫色红曲霉JWZWZ-24，其余等同于实验1，所得红曲米中MFA和MFB的含量如下表3所示。

表3

对比试验2、将保藏号为CCTCC NO:M 2018142的紫色红曲霉JWZWZ-24按照现有的传统红曲生产方法，依次进行以下步骤：

1)、将100kg大米在足量的清水中浸泡10～14h(浸泡时间结束后，大米仍被清水所覆没)，然后用流动清水冲洗；

2)、蒸饭：

通蒸汽10-15分钟，大米为成熟无白心，均匀一致无结块现象，冷却至室温后进行接种，接种量同实验1；

3)、固体培养：

固体培养条件为将竹筐四周及上下以麻袋覆盖，约20小时后倒出，此时温度为48℃左右，上下翻动，温度降至43℃时再积聚成堆，以麻袋覆盖，翻动3-4次，直至饭粒长出红区菌丝，平摊5h翻动一次，培养18小时，直至饭粒变成粉红色，装框浸泡15min，沥干，平铺，4h翻动一次，过一天加一次水，加10％为宜，培养至饭粒没有白心全部变红；得红曲米。

该红曲米中，MFA的含量为3.05g/kg，MFB的含量为4.24g/kg。

采用该方法，不但红曲米中MFA、MFB的含量低，且，由于步骤1和步骤3中需要使用大量的水，因此还存在废水排放量大的缺陷。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.紫色红曲霉(Monascus purpureus)JWZWZ-24，其特征是：保藏号为：CCTCC NO:M2018142。

2.如权利要求1所述的紫色红曲霉JWZWZ-24的用途，其特征是：用于制备富含monasfluore A和monasfluore B的红曲米。

3.富含monasfluore A和monasfluore B的红曲米的制备方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、制备种子液：

将权利要求1所述的紫色红曲霉JWZWZ-24接种到培养基中，于30±1℃、100～150r/min的条件下进行培养，直至培养基变红，得到种子液；

2)、大米的处理：

将大米在水中浸泡10～14h，沥干水分后，进行灭菌，得灭菌后大米；

3)、大米的发酵：

按照8～12ml/100g的接种量，在步骤2)所得的灭菌后大米中加入步骤1)所得的种子液，均匀混合后，在黑暗条件下于30±1℃进行发酵，当发酵至72小时起，按照每24小时补加一次无菌水的频率，在发酵产物中补加无菌水，均匀混合后继续进行发酵，每次补加无菌水的体积量等于种子液的体积量；共发酵11～13天；得含有monasfluore A和monasfluore B的红曲米。

4.根据权利要求3所述的富含monasfluore A和monasfluore B的红曲米的制备方法，其特征是：

所述步骤1)为：在超净工作台上，用接种环挑取两环权利要求1所述紫色红曲霉JWZWZ-24，接种到装有50mL培养基的三角瓶中，于30±1℃、100～150r/min的条件下进行培养，培养时间为2天，得种子液；

所述步骤2)还包括：大米在浸泡之前，先用流动水进行冲洗。