CN104928184B - 一种茶源冠突散囊菌菌株及其应用 - Google Patents
一种茶源冠突散囊菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体涉及一种冠突散囊菌菌株，其分类命名为EurotiumcristatumNHRI‑BC‑1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.8730。本发明所述的菌株分离于中茶湖南安化茶厂“”木质仓库茶样，经纯化、选育得到。在茶叶发酵过程中,该菌株能够耐高温，并通过保持对其他菌的生长优势，进而达到抑制其他非目标菌生长繁殖的目的；有效缩短了生产周期，提高了成品率，并保证了茶叶的品质。
Description
技术领域
本发明属于微生物和食品生物技术领域，具体涉及一种茶源冠突散囊菌菌株及其在黑茶发花加工工艺中的应用。
背景技术
茶叶的加工过程一般涉及其自身碳水化合物、蛋白质、脂肪、果胶、茶多酚分解与降解等过程。其中，茶多酚物质经由分解、转化、聚合、络合形成的化合物，如儿茶素衍生物、儿茶素氧化聚合物、儿茶素和有机酸络合物对茶叶的品质有直接影响。在传统茶叶生产工艺中，一般利用如“杀青”、“初制”等操作步骤使得鲜叶内源性酶系失活，进而影响茶叶的品质。而这个过程中与茶叶相互作用的微生物及其产生的酶，又是影响茶叶产品外形、色泽、风味形成的关键因素。
对于后发酵茶来说，如黑茶且尤其是黑茶中的茯砖茶，其最鲜明的产品特征便为茶砖内部与外表分布的金黄色菌体，俗称“金花”。该特征的形成便是依赖于微生物在茶叶发酵工艺中的参与，该过程俗称“发花”，其实质为野生菌种参与茶叶发酵并改善茶叶产品品质的过程。因此，“金花”作为茯砖茶区别其他茶叶的鲜明特征以及品质的保证，在黑茶加工行业中日益受到广泛关注。
目前，已分离的黑茶的优势“金花”菌大多数属于但并非局限于散囊菌属（Eurotium spp）的某一特定种。根据菌株的形态学以及生理生化特性，分别命名为冠突散囊菌Eurotium cristatum，阿姆斯特丹散囊菌Eurotium amstelodami，谢瓦散囊菌Eurotium chevalieri，间型散囊菌Eurotium intermedius，匍匐散囊菌Eurotium repens等种。其中，冠突散囊菌Eurotium cristatum是黑茶工艺的主要优势菌，而且由于物种多样性与遗传多样性，现有技术中已发现，遗传差异普遍存在于冠突散囊菌Eurotiumcristatum菌种内，因此造成冠突散囊菌Eurotium cristatum也存在诸多变种。但是在菌种筛选的过程中也发现，简单从环境中纯化分离的菌种缺少在茶叶中具有生长优势的散囊菌种，使得现有菌种无法满足现代化标准黑茶加工工艺对菌种的要求。
现有技术中已公开了诸多在茶叶加工特别是黑茶加工过程中使用冠突散囊菌的技术。如中国专利文献CN102524442A中公开了一种黑茶发花工艺，具体涉及将黑茶原料经渥堆、蒸茶、喷洒冠突散囊菌孢子粉，再将茶叶压制成砖，密封后高温杀菌，冷却后茶叶发花一段时间后烘干制成黑茶产品，采用该方法具有缩短发酵周期，又能使砖茶内外菌体生长均匀茂盛，并且能长时间保持“金花”不变色且“金花”不消失的优点。又如中国专利文献CN101669559A中公开的一种提高六堡茶品质的方法，采用初蒸后添加冠突散囊孢子悬浮液喷洒接种的方式，复蒸后，将茶叶菌种碾碎成沫再接种的方法来增加发花的效果。但是上述方法同样存在着所用菌株无法在发酵过程中通过保持冠突散囊菌对其他菌的生长优势而达到抑菌的目的，其需要进行多次接种或灭菌，才能增强冠突散囊菌的生长优势来抑制其他菌的生长，而且所得产品的“发花”状况也有待进一步提高。
可见，如何通过保持冠突散囊菌在茶叶发酵过程中的对其他菌的生长优势，以此达到抑菌目的，为赋予产品良好的品质起到关键的作用。同时，如何通过菌种的选育来满足上述问题对菌种特性的要求，成为亟待解决的另一问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种冠突散囊菌菌株，该菌株能够满足茶叶发酵过程中对菌种特性的要求，在黑茶的发酵过程中可保持对其他非目标菌株的生长优势，以更好的对黑茶进行发花加工，提高茶叶的质量。
为解决上述技术问题，本发明的提供了一种冠突散囊菌株，其分类命名为Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址为中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCCNo.8730，保藏日期是2014年1月16日。该菌株经过分离、纯化、选育得到，能够满足茶叶发酵过程中对菌种特性的要求。
本发明还提供了含上述权利要求冠突散囊菌株的菌株混合物，其特征在于，还包括所述菌株生长的培养基。对于本发明的培养基，应理解为现有技术中的普通培养基，能够满足微生物生长对营养的需求，如固体培养基中的PDA培养基，查氏培养基；同时在固体培养中利用其它富含淀粉、糖类、以及氮源等的常见材料如大豆饼粉，玉米粉，大米粉等材料；另外现有技术中的液体培养基，如添加茶汁并富含糖类，氮源等的培养基也能满足本发明的需求。
本发明还提供了一种黑茶产品的加工方法，包括使用权利要求上述的冠突散囊菌株或上述的菌株混合物对黑茶进行发酵发花的步骤。
本发明所述的加工方法，还包括取黑毛茶进行筛分、拼配、汽蒸、渥堆、二次汽蒸、压砖、发花、干燥、包装的步骤。
本发明所述的加工方法，拼配步骤中茶梗的含量按重量计占总重的15-20%。
本发明所述的加工方法，其发花温度为25-34℃；优选28-30℃；在发花温度为30-34℃时，由于菌株的耐高温特性，发花能得以实现。
本发明所述的加工方法，所述的加工方法，可以在二次气蒸后压砖之前混入如权利要求1所述的冠突散囊菌株或权利要求2所述的菌株混合物。
本发明所述的加工方法，汽蒸条件为，蒸汽压力0.3-0.6Mpa，温度为105-115℃，汽蒸时间为10-15秒；渥堆步骤操作的高度为40-60cm，渥堆的空气相对湿度为80%以上，渥堆时间为2-8h；二次汽蒸条件为，所述蒸汽压力为0.3-0.5Mpa，温度为98-102℃，汽蒸时间小于10秒；退砖温度为40℃。
本发明所述的加工方法，冠突散囊菌菌株及所述冠突散囊菌株混合物的接种量为黑茶重量的0.5%-4%。
本发明所述的加工方法制备得到的黑茶。
本发明提供的所述的冠突散囊菌株在茶叶发酵领域的应用。
本发明提供的含冠突散囊菌株混合物在茶叶发酵领域的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
（1）本技术方案提供的菌株，是经过分离、纯化、选育得到，能够满足茶叶发酵过程中对菌种特性的要求；
首先，在发酵过程中，菌株在接种茶叶发花5天后，其中金花菌菌落总数能够达到5×104CFU/g绝干茶叶，杂菌含量小于1×102CFU/g绝干茶叶；且发花结束，“金花菌”含量能够达到4×106CFU/g绝干茶叶的水平；从而满足在茶叶中的生长优势，杂菌不能有效生长；
其次，在茶叶发酵过程中，该菌株能够耐受高温，降低实际生产中夏季发花温度过高给菌种带来的影响，并保持在整个发酵过程中的生长优势，杂菌不能有效生长。其发酵耐受温度可以达到30-34℃；
再次，该菌具有良好的闭囊壳产生特性，经过特殊的选育步骤，确认了该菌种产生闭囊壳的特性，在“发花”工艺后，菌种在茶叶产品中“金花”茂密，分布均匀；
（2）在茶叶发酵过程中，按照现有工艺接入本发明的菌株，产品成品率高于98%，霉变率小于2%；外表“金花”生长茂盛、内部生长均匀；发酵茶产品品质符合质检标准、口感良好；
（3）相对于现有技术菌株，本菌株经选育得到，在与茶叶发酵作用过程中展示了优良的性状，具备经常规分离、纯化的菌株所不具备的发酵优势。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是所述实施例1制备的PCR反应产物的电泳图。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述的PDA固体平板培养基、PDA试管斜面培养基以及PDA茄形瓶的培养基均按照现有技术中常规方法制备，以本发明下述各实施例而言，所述PDA固体平板培养基、PDA试管斜面培养基以及PDA茄形瓶的培养基组成分别为：
PDA固体平板培养基、试管斜面培养基：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、自来水1000毫升，自然PH；
PDA茄形瓶的培养基：马铃薯300克、葡萄糖20克、自来水1000毫升，自然pH。
下述实施例中所述的试剂与仪器的型号分别为：
KOD：KOD-101Toyobo；
PCR产物回收试剂盒：D6492Omega；
离心机：3K15，Sigma；
电泳槽：JY-SPFT；
电泳仪：JY300C，生产厂家为北京君意东方电泳设备有限公司；
凝胶成像系统：JY04S-3C，生产厂家为北京君意东方电泳设备有限公司；
PCR仪：Life Express，生产厂家为博日科技有限公司。
实施例1菌株的分离纯化
所述黑茶的优势“金花”菌的分离纯化步骤具体如下：
（1）选取茶样
选取湖南安化茶厂“”木质仓库中茶叶中不同年份的茯砖茶产品以及湖南益阳市生产、市售主流茯砖茶产品，作为原始菌株分离的材料。上述所选取产品的茶样满足GH/T1070对茶叶包装的规定，满足GH/T1071对茶叶贮存的规定，满足GB2762—2012对食品中污染物的限量，满足GB2763/GB26130中对农药最大残留的限量，满足GB/T9833.2—2013对《紧压茶》部分的相关标准规定；同时，选取的茶样满足：包装无破损、无污渍；茶叶外形平整、茶砖内部发花均匀；选取的同批次产品，“金花”生长茂盛、内部生长均匀；
（2）对所选取的茶样进行编号
对湖南安化茶厂“”木质仓库不同年份的产品分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，上述编号依次对应1985年、1997年、2002年、2010年、2013年生产的茶样产品；对选取的市售主流茯砖茶产品编号为A、B、C、D、E；
（3）预处理茶样
茶样收集后，在无菌条件下，选取“金花”生长茂盛、内部生长均匀的茶样Ⅰ，取所述中心带菌的茶样25g，粉碎，过80-100目筛，然后将过筛的茶粉全部转移至225mL的无菌水中，充分震荡混合；
（4）涂布培养含菌茶样液体
取无菌水将上述步骤获得的混合液进行梯度稀释，取1mL稀释梯度为106的含菌液体涂布于PDA固体平板培养基中进行培养；
（5）培养并记录菌落生长情况
将涂布后的PDA固体平板培养基置于恒温培养箱中进行培养，培养温度为28-30℃，培养7天，在培养过程中，按照冠突散囊菌Eurotium cristatum的形态学、生理生化特征对所述菌落的形态特征进行菌落的识别并编号，每12h量取菌落的直径并记录；
（6）挑取纯化单菌落
取上述步骤中生长最快的5株菌的单菌落，挑取菌落并划线接种至所述PDA培养基上，于28-30℃条件下培养7天，每个菌落挑取三个样品进行纯化，传代培养的次数为两次，最终选取纯化培养过程中菌落直径增长最快的5株菌株进行保存；
（7）保存原始菌株
按照常规方法制备PDA试管斜面，挑取上述选用的5株菌分别划线接种至所述PDA试管斜面上，于28-30℃条件下，培养7天后，将试管封存后冷冻备份。
同样的，所述茶样Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、A、B、C、D、E的菌种分离纯化参照上述实验操作，得到多株备选育样品。
结果显示，选育的菌株其菌落平均直径生长的速度超过5mm/d。
其中，不规则菌落直径的折算参考文献SerraJ.Image analysis andmathematical morphology[M].Academic Press,Inc.,1983.有关图像处理以及直径折算内容所述方法。
实施例2菌株的选育
选育步骤a.按照发酵时茶叶中含菌特性以及金花生长程度选育菌株茶叶中“金花”的生长程度选育菌株
选育思路：在相同的培养条件下，选用来源于同一产地的同一批次的黑毛茶原料进行菌株接种的发酵试验。如果该菌株可以满足茶叶品质对发酵菌所具有的菌种特性以及“金花”生长程度对菌株的要求，则接种该菌株以后，则在茶产品中该菌株能够快速生长，且在一定时间内其发酵茶叶中能够达到一定的含菌数量，从而成长成为优势菌，抑制杂菌的生长；并且其良好的特性体现为最终茶叶外观以及品质。否则，认为接种该菌株不能满足茶叶对发酵菌的要求，即发酵过程接种使用该菌株对比不能在相同的发酵条件下迅速成长为优势菌株，达不到相应菌含量，产品最终的外观与品质得不到保证，或者其在茶叶中的生长周期过长，甚至烧心，霉变。
所述黑茶的优势“金花”菌的选育步骤具体如下：
1)分别取茶样Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、A、B、C、D、E经过上述步骤分离纯化的备份菌株接种至茄形瓶的PDA固体培养基上，于28℃条件下培养，培养15天以后用100mL无菌水冲洗上述固体培养基，然后将冲洗后获得的含有菌体的混合液经无菌纱布过滤获得孢子悬浮液，编号待用；
2)选用原产地为湖南安化县的一芽三叶或者一芽四叶的黑毛茶，筛分获得三级（特茯）黑毛茶原料350kg，其中茶梗按重量计占全部茶叶的15-20%，上述黑毛茶采用高温汽蒸，蒸汽压力为0.3-0.6Mpa，温度为105-115℃，时间为8-20s,将汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为40-60cm，优选40-50厘米，渥堆空气相对湿度80%以上，渥堆时间为4-12h，渥堆完成后，控制茶叶水含量为15%-25%，优选18%-22%，将渥堆后的黑茶进行二次汽蒸，汽蒸条件为98-102℃，汽蒸压力为0.6-0.5MPa，汽蒸时间小于10秒，控制所述黑茶的砖坯含水量为20-25%，汽蒸后，向所述黑茶中均匀混入上述步骤制备的孢子悬浮液1-10mL，然后按照每块茯砖含有上述得到的混合后的原料1kg的规格进行人工配料压砖，于40-70℃压砖，40℃退砖，然后转入烘房，所述烘房在培育期、发花期湿度控制不大于70%，温度为27-29℃；在发花进行第五天的时候，用特制的取样刀具，取用茶砖中心内部的茶样25g，并按照GB4789.2-94菌落总数测定所述方法计算“金花”菌以及杂菌的菌落总数，取样完毕以后，所述茶叶继续在烘房发花，发花十天以后，将烘房缓慢升温，直至黑茶产品中的水分低于14%，产品出烘房，然后按照GB4789.2-94菌落总数测定所述的方法进行“金花”菌菌落总数含量的检测，分析统计发花结束产品中金花菌菌落总数产品相关理化指标的检测参见GB2762—2012、GB2763/GB26130、GB/T9833.2—2013；
其中，每份菌株接种3个黑茶样品，并按照上述黑茶发花加工方法制作不接种所述分离的菌株的茯砖茶作为实验的对照组；
3)直接挑取上述步骤获得的茶叶内部的符合选育条件的“金花”菌于PDA固体平板培养基上纯化培养，符合选育条件的菌种至少取样一份，纯化培养后的菌株编号为A系列，于PDA试管斜面冻藏，备份，其检测的结果（部分）列出选用的菌株，编号为A，结果见表1，
表1菌种与茶叶发酵选育结果表（部分）
经过本步骤选育得到的菌株共计31株，在进行黑茶发花时，发花迅速，可以在发花第五天使得茶样中“金花”菌菌落总数能够达到5×104CFU/g绝干茶叶，杂菌含量小于1×102CFU/g绝干茶叶；且发花结束，“金花”菌菌落总数能够达到4×106CFU/g绝干茶叶水平；产品成品率达到99%；发酵茶产品外表“金花”生长茂盛、内部生长均匀、口感良好；发酵茶产品符合质检标准的菌株。
选育步骤b.采用高温发酵选育耐高温菌株
选育思路：该耐高温实验选育得到的菌株能够使得发酵能够在较高温度下进行，即在茶产品发酵中在较高温度下，保持选育步骤a中菌株发酵茶叶能达到的效果，满足实际生产中温度季节性的变化，在夏季气温较高的条件下进行发花生产。
首先，在PDA培养基中对菌种进行分离纯化，重复挑取单菌落传代培养10代以上，选择能够在38℃条件下稳定传代生长的菌株，优选菌落直径增长速度快的菌株；然后，选取该批菌株重复步骤a一代，并将其发酵温度设置在30-34℃之间，按照步骤a的选育标准进行菌种的选育，从茶叶中分离纯化得到其中生长的优势菌株B，保存，编号进行下一步选育实验。
所述黑茶的优势“金花”菌的选育步骤具体如下：
1）按照前述常规方法制作PDA固体平板培养基，挑取编号为A的原始菌株菌落划线接种至所述PDA固体平板培养基，然后将所述平板置于38℃的恒温培养箱中进行培养，培养7天后，挑取能够生长的菌株单菌落，重复上述步骤10代以上，选取能够在所述38℃温度下生长的菌落，对选取的菌株编号B，用PDA试管斜面冻存备份；
2）将上述选取的菌株重复上述步骤a中的黑茶发花发酵步骤，区别仅是将所述发花步骤中的烘房温度改变为30-34℃，然后在发花进行第五天，用特制的取样刀具取用制备的茶砖中心内部的茶样25g进行检测；
其中，每份菌株的接种3个样品；
对照样品为编号B对应的原始菌株A，其检测的相关结果列出选用的菌株，编号为B，结果（部分）如表2，
表2菌株高温选育结果
经过本步骤选育的菌种，可以在夏季环境温度较高时，满足茶叶发花在30-34℃之间生产的需要，即在茶产品发酵中在较高温度下，保持选育步骤a中菌株发酵茶叶能达到的效果，满足实际生产中温度季节性的变化，在夏季气温较高的条件下进行生产。
此步骤获得优良菌株共计17株。
选育步骤c、选育能大量产生闭囊壳的菌株
发明人在实验过程中发现，采用涂布培养法在茄型瓶PDA培养基中培养菌株时，大部分菌株在茄形瓶边缘，生长在培养基之外的少数菌株有规律的生长分化出大量的闭囊壳（子囊果），且其闭囊壳在自然条件下能够稳定的存在，因此发明人按照下述方法进行选育能大量产生闭囊壳的菌株：
取用步骤b获得的全部菌株，采用涂布培养法在PAD培养基（此处是否应为固体平板培养基）中进行培养，在距培养基边缘2cm处划线标记，挑取超出标记线之外存在的大量闭囊壳的菌株，进行第二代涂布培养；重复步骤c第一代菌株的培养方法直至第五代，得到产生闭囊壳性状优秀的菌株共计14株，对所得的菌株编号C，分别编号NHRI-BC-1.5.1--NHRI-BC-1.5.14，用试管斜面冻存备份。其中编号NHRI-BC-1.5.1的菌株为选育的目标优势菌株，经鉴定其为冠突散囊菌。
实施例3菌种性质鉴定
对上述实施例2获得的冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的形态学、生理生化特征、以及分子生物学特征进行鉴定，具体如下：
A、菌体形态特征
取用编号为NHRI-BC-1.5.1的菌株，采用划线培养法将菌株接种于PDA固体平板培养基上，在28℃恒温培养箱中培养15天，菌体形态观察时挑取培养基菌落上的菌丝体，于光学显微镜下进行观察，放大倍数为物镜10倍，目镜16倍。
观察结果显示，菌体为丝状，有隔，呈浅黄色。
B、菌落形态特征
取用编号为NHRI-BC-1.5.1的菌株，采用点样培养法将菌株接种于PDA固平板体培养基上，在28℃恒温培养箱中培养15天，培养结束以后，置于4℃冰箱冻存，记录菌落的特征。
观察结果显示，所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株菌落干燥，致密，圆形，表面粗糙，凸起或者隆起，边缘粗糙呈菌丝分散状，直径最大可达60mm左右，色调为金黄色和褐色。
所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株菌落存在菌丝体，菌丝体细长，分为基内菌丝、气生菌丝。基内菌丝呈褐色，气生菌丝随着时间的推移与菌落的扩大，中心气生菌丝分别呈现出白色、淡黄色、金黄色、褐色、深褐色的变化。培养前期（1-3天），菌落边缘为白色或淡黄色，中心为金黄色，直径大小为2-10mm；培养中期（2-5天），菌落中心出现褐色或者棕褐色菌落，直径大小为5-40mm；培养后期（5-9天以后），菌落分为3-4层，边缘为白色带淡黄色，边缘内部为金黄色，中心褐色菌落其生菌丝生长出金黄色囊壳；同时培养后期伴随有棕色渗出液，棕色渗出液在培养结束冻存以后更加明显，棕色渗出液呈点状分布在棕色菌落表层，金黄色以及淡黄色菌落层很少或者不存在渗出液。同时，渗出液会渗入培养基中，将培养基染为褐色。其淡黄色或者白色菌落层及金黄色层始终保持2-10mm的菌环大小，褐色菌落层，会随着菌落的增大而变大。
C、生殖及生殖结构形态
取用编号为NHRI-BC-1.5.1的菌株，将菌株划线接种于如文献《利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因[J]》（谭玉梅,王海,刘永翔,等.菌物学报,2013,32(1):56-63）中所述的低渗和高渗固体培养基中，于28℃培养3天，收集菌丝体、子囊孢子以及分生孢子染色制片，在光学显微镜下观察分生孢子以及子囊果情况，收集菌丝以及子囊孢子于液氮中保存，用扫描电镜进行观察各生殖结构的微观形态。
观察结果显示，所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株可在低渗固体培养基中产生子囊孢子与分生孢子，子囊由黄色闭囊壳包裹并最终释放，闭囊壳被菌体生长缠绕；闭囊壳肉眼可见，大小为90～170μm，呈椭圆形；闭囊壳内含大量子囊，粘合在一起，子囊呈不规则球形；释放后的子囊包含8个子囊孢子；子囊孢子直径4-6μm，形似河蚌，瓣形凸状，表面中心粗糙具疣体，边缘光滑，两瓣结合处有明显凹痕；分生孢子呈串生状，按其结构可分为串生孢子头，孢子梗两大部分；其中，多束孢子串生于孢子头，分生孢子结合处存在凹痕；单个分生孢子大小为4～5μm，呈椭球状，表面布满尖疣。
D、菌株的常规生化性质
所述冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株异生耗氧，耐受干旱、耐受高渗透压，能够利用液体LB培养基进行菌体生长，能够代谢利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，pH耐受性为4.5-6.5，生长温度为24-38℃，发酵茶叶时的适宜生长温度为26-34℃。
E、分子生物学特征
取用编号为Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌株，在PDA斜面培养基上培养生长出菌落。
1）、菌体DNA提取
挑取真菌菌丝大约10mg，加入真菌DNA提取裂解液300μl，涡旋起沉淀。于65℃水浴30min，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），涡旋混匀，13000rpm离心5min。取上清，加入体积异丙醇，混匀；13000rpm，离心5min。弃上清，加入70%乙醇混匀，13000rpm离心1min。弃乙醇，倒置离心管，晾干。加入30μlddH2O，溶解DNA；
2）、18SrDNA/ITS扩增
（1）取上述步骤获得的DNA，稀释作为PCR反应模板，利用引物对所述DNA序列进行PCR反应扩增，向PCR管中依次加入以下列表3的PCR反应体系中的试剂；
表3、PCR反应体系（组分以μL计）：
（2）取上述步骤得到的PCR管按照下表4的PCR的反应程序进行所述DNA序列的PCR反应扩增；
表4、PCR的反应程序
（3）上述步骤反应完毕后，取反应产物用1%的agrosegel进行电泳检测，确定有特异扩增后，取所述反应产物再次按照上述步骤（1）和（2）进行PCR反应扩增，然后回收PCR产物进行电泳检测，所述电泳结果见附图1，其中M：marker2000:2000,1000,750,500,250,100bp，亮带是750bp；
所述PCR产物回收的方法如下：
取4倍体积的的Buffer CP加入到含有PCR反应物体积100μL的1.5mL离心管中，然后剧烈震荡，短暂离心，随后把吸附柱放在收集管里，再把步骤（3）得到的混合物转入吸附柱中（每次750μL，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心），于13000rpm离心下1min后，弃滤液，然后向所述吸附柱中加入700μL的洗脱液，于13000rpm下离心1min后，弃滤液，再向所述吸附柱中加入500μL洗脱液，于13000rpm离心1min，弃滤液，再次于13000rpm离心2min，甩吸附柱上的乙醇，把所述吸附柱转移到一个新的1.5mL离心管中，然后向所述吸附柱的中心加入30μL的ddH2O，于室温条件下放置1min后再15000rpm条件下离心2min，所得的滤液即为经PCR反应扩增的DNA。
3）、测定序列
上述获得的DNA需要测定的序列，包含18SrDNA/ITS1/5.8SrDNA/ITS2区域，所述序列测定结果见SEQ.IDNO：1，将所获得的序列进行序列BLAST比对；
结果显示，Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌株属于冠突散囊菌，同源性为99%。
将上述鉴定的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址为中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCCNo.8730，保藏日期是2014年1月16日。实施例4菌株的活化及增殖培养
取保存的菌株Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1（保藏编号为CGMCCNo.8730），无菌接种在上述配制的PDA斜面培养基上，28-30℃培养7-15天。
在无菌条件下，用足量无菌水冲洗上述斜面培养基的表面，将获得的菌体充分混匀捣碎，然后采用16层纱布过滤，用加入灭菌玻璃珠的三角瓶盛装滤液，将上述三角瓶置于摇床在30℃、摇床转速250rpm下震荡1小时，获得冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的孢子悬浮液，置于4℃冰箱，待用。
配制种子培养基（重量份）：茶汁滤液20-50份，食用蔗糖5-20份，其余成分为水，自然pH，高温蒸汽灭菌。
所述茶汁滤液为按质量比取用茯砖茶1份与水20份，于常压下煮沸30分钟，然后压滤即得，所述茯砖茶符合相关质量标准的要求，所述水符合食品生产标准的要求。
按质量份数，取上述方法制备的孢子悬浮液1-10份，上述方法制备的种子培养基99-90份，液接种于搅拌式耗氧生物反应器中，培养条件为搅拌转速为200-800rpm，通气0.2-1vvm，培养时间为3-7天，经液体发酵扩配获得冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌种悬浮液，待用。
实施例5黑茶的发花加工
本实施例所述黑茶的发花加工方法的具体步骤如下：
取用2kg黑毛茶，采用中国专利文献CN101491281B中所述的预处理方法进行黑茶的预处理，即经压块汽蒸后分散晾干待用，向晾干后的散茶中直接混入实施例4制备的为黑茶重量1-4%的冠突散囊菌Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的孢子悬浮液，于无菌条件下混匀，然后将混匀后的黑茶置于灭菌的竹制容器中，于恒温（温度为28℃）恒湿（湿度不大于70%）培养箱中培养15天进行发花发酵，在发花第五天进行取样，进行取样分析，在发花至第十天的时候，结束发花。
发花结束，按照GB4789.2-94菌落总数测定所述的方法进行“金花菌”菌落总数含量的检测；按照GB4789.2-94菌落总数测定所述的方法进行杂菌菌落总数含量的检测；按照GB4789.2-94分析统计发花结束产品中金花菌菌落总数。其中，金花菌与杂菌菌落的区分参见实施例3中关于菌落特征的描述。产品相关理化指标的检测参见GB2762—2012、GB2763/GB26130、GB/T9833.2—2013。对金花菌在产品的外观表性状进行描述。
检测分析结果显示，加入冠突散囊菌EurotiumcristatumNHRI-BC-1.5.1经过散茶发花的茶叶，菌株在接种茶叶发花5天后，其中金花菌菌落总数能够达到5×104CFU/g绝干茶叶，杂菌含量小于1×102CFU/g绝干茶叶；且发花结束，“金花菌”含量能够达到4×106CFU/g绝干茶叶。发酵茶产品外表“金花”生长茂盛、生长均匀、口感良好；产品符合质检标准。
实施例6黑茶的发花加工
本实施例所述黑茶的发花加工方法的具体步骤如下：
（1）取湖南安化县的一芽三叶或者一芽四叶的黑毛茶，经筛分获得三级与四级的原料，取上述得到的原料进行拼配，其中黑茶茶梗含量为15%，重量共计105kg。
（2）采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.64Mpa，温度为103℃，汽蒸时间为8s；
（3）将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为80cm，渥堆的空气相对湿度为80%以上，渥堆时间为9h，控制所述茶叶中的水含量为25%；
（4）渥堆后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.3Mpa，温度为98℃，汽蒸时间9秒。二次汽蒸后的原料按照接种量为黑茶重量的0.3%接入实施例4制备的菌株Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1孢子悬浮液；
（5）将上述接种后的原料按照1kg的规格进行人工压砖，退砖温度为35℃；
（6）制得茯砖半成品100份，然后将所述茯砖转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于70%，温度为28℃，进行发花发酵，在发花第五天进行取样分析，在发花至第十天的时候，结束发花，然后升高温度干燥所述黑茶直至其中水分含量低于14%，即得。
发花结束，按照GB4789.2-94菌落总数测定所述的方法进行“金花菌”菌落总数含量的检测；按照GB4789.2-94菌落总数测定所述的方法进行杂菌菌落总数含量的检测；按照GB4789.2-94分析统计发花结束产品中金花菌菌落总数。其中，金花菌与杂菌菌落的区分参见实施例3中关于菌落特征的描述。产品相关理化指标的检测参见GB2762—2012、GB2763/GB26130、GB/T9833.2—2013。
符合产品相关理化指标的产品统计为成品，按照成品/半成品数量进行成品率统计；对金花菌在产品的外观性状进行描述。
实施例7黑茶的发花加工
本实施例所述黑茶的发花加工方法的具体步骤如下：
（1）取湖南安化县的一芽三叶或者一芽四叶的黑毛茶，经筛分获得三级与四级的原料，取上述得到的原料进行拼配，其中黑茶茶梗含量为25%，重量共计105kg。
（2）采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.28Mpa，温度为117℃，汽蒸时间为17s；
（3）将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为35cm，渥堆的空气相对湿度为80%以上，渥堆时间为1.5h，控制所述茶叶中的水含量为15%；
（4）渥堆后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.5Mpa，温度为102℃，汽蒸时间6秒。二次汽蒸后的原料按照接种量为黑茶重量的1%接入实施例4制备的菌株Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1孢子悬浮液；按照
（5）将上述接种后的原料按照1kg的规格进行人工压砖，退砖温度为35℃。
制得茯砖半成品100份，然后将所述茯砖转入烘房，控制烘房在培育期、发花期空气湿度不大于70%，温度为34℃，进行发花发酵，在发花第五天进行取样分析，在发花至第十天的时候，结束发花，然后升高温度干燥所述黑茶直至其中水分含量低于14%，即得。
按照实施例6所述方法进行产品的分析检测。
实施例8黑茶的发花加工
本实施例所述黑茶的发花加工方法的具体步骤如下：
（1）取湖南安化县的一芽三叶或者一芽四叶的黑毛茶，经筛分获得三级与四级的原料，取上述得到的原料进行拼配，其中黑茶茶梗含量为20%，重量共计105kg。
（2）采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.3Mpa，温度为110℃，汽蒸时间为13s；
（3）将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为40cm，渥堆的空气相对湿度为80%以上，渥堆时间为4h，控制所述茶叶中的水含量为20%；
（4）渥堆后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.3Mpa，温度为100℃，汽蒸时间4秒。二次汽蒸后的原料按照接种量为黑茶重量的2%接入实施例4制备的菌株Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1孢子悬浮液；
（5）将上述接种后的原料按照1kg的规格进行人工压砖，退砖温度为35℃；
（6）制得茯砖半成品100份，然后将所述茯砖转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于70%，温度为33℃，进行发花发酵，在发花第五天进行取样分析，在发花至第十天的时候，结束发花，然后升高温度干燥所述黑茶直至其中水分含量低于14%，即得。
按照实施例6所述所述方法进行产品的分析检测。
实施例9黑茶的发花加工
本实施例所述黑茶的发花加工方法的具体步骤如下：
（1）取湖南安化县的一芽三叶或者一芽四叶的黑毛茶，经筛分获得三级与四级的原料，取上述得到的原料进行拼配，其中黑茶茶梗含量为17%，重量共计105kg；
（2）采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.6Mpa，温度为115℃，汽蒸时间为10s；
（3）将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为60cm，渥堆的空气相对湿度90%，渥堆时间为8h，控制所述茶叶中的水含量为18%；
（4）渥堆后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.5Mpa，温度为100℃，汽蒸时间4秒。二次汽蒸后的原料按照接种量为黑茶重量的4%接入实施例4制备的菌株Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1含菌发酵液；
（5）将上述接种后的原料按照1kg的规格进行人工压砖，退砖温度为35℃；
（6）制得茯砖半成品100份，然后将所述茯砖转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于70%，温度为30℃，进行发花发酵，在发花第五天进行取样分析，在发花至第十天的时候，结束发花，然后升高温度干燥所述黑茶直至其中水分含量低于14%，即得。
按照实施例6所述所述方法进行产品的分析检测。
实施例10黑茶的发花加工
本实施例所述黑茶的发花加工方法的具体步骤如下：
（1）取湖南安化县的一芽三叶或者一芽四叶的黑毛茶，经筛分获得三级与四级的原料，取上述得到的原料进行拼配，其中黑茶茶梗含量为21%，重量共计105kg。
（2）采用高温蒸汽对上述原料进行汽蒸，蒸汽压力为0.4Mpa，温度为108℃，汽蒸时间为15s；
（3）将上述汽蒸后的黑毛茶进行渥堆，渥堆高度为50cm，渥堆的空气相对湿度93%，渥堆时间为6h，控制所述茶叶中的水含量为22%；
（4）渥堆后的茶叶进行二次汽蒸，汽蒸条件为，蒸汽压力为0.4Mpa，温度为100℃，汽蒸时间4秒。二次汽蒸后的原料按照接种量为黑茶重量的3%接入实施例4制备的菌株Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1含菌发酵液；
（5）将上述接种后的原料按照1kg的规格进行人工压砖，退砖温度为35℃；
（6）制得茯砖半成品100份，然后将所述茯砖转入烘房，控制烘房在培育期、发花期湿度不大于70%，温度为26℃，进行发花发酵，在发花第五天进行取样分析，在发花至第十天的时候，结束发花，然后升高温度干燥所述黑茶直至其中水分含量低于14%，即得。
按照实施例6所述所述方法进行产品的分析检测。
实施例11黑茶的发花加工
本实施例与实施例6的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于其在渥堆后不接入Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌种，直接进行压砖等后续步骤。
实施例12黑茶的发花加工
本实施例与实施例6的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于在黑茶原料进行拼配过程中，向所述黑茶原料中加入为黑茶重量2-4%的茶粉，其他生产工艺与参数保持不变。其中，所述的茶粉为按实施例6所述方法进行发花加工制备得到的最终菌落平均含量超过4.9×106CFU/g黑茶产品粉碎而成的。
实施例13黑茶的发花加工
本实施例与实施例12的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于其在渥堆后不接入Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1的菌种，渥堆后的黑茶直接进行压砖等后续步骤。
实施例14黑茶的发花加工
本实施例与实施例13的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于在于其改变其发花温度为34℃，其他生产工艺与参数保持不变。
实施例15黑茶的发花加工
本实施例与实施例6的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于在于其在渥堆后接入现有技术中市售的冠突散囊菌Eurotium cristatum的孢子粉，其他生产工艺与参数保持不变。所述的冠突散囊菌孢子粉购自长沙湘资生物科技有限公司。
实施例16黑茶的发花加工
本实施例与实施例6的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于在于其在渥堆后接入现有技术中市售的冠突散囊菌Eurotium cristatum的孢子悬液，其浓度为1*104个/mL的孢子悬液，其他生产工艺与参数保持不变。所述的冠突散囊菌孢子悬液由购自长沙湘资生物科技有限公司的冠突散囊菌孢子粉按照常规方法制备而成。
实施例17黑茶的发花加工
本实施例与实施例14的所述黑茶的发花加工方法相同，其区别仅在于在于其改变其发花温度为34℃，其他生产工艺与参数保持不变。
实施例18黑茶的发花加工
本实施例为按照中国专利文献CN102273527A的黑茶的生产工艺生产所述黑茶产品。
效果例
按照常规方法统计实施例6-19发花过程中、发花结束后的所述黑茶的“金花”菌菌落总数、“金花”菌菌落平均含量、成品率以及产品常规理化指标，结果如下表：
表5所述黑茶产品的各项指标
表中金花茂盛程度，+表示肉眼可见金花，–表示肉眼不可见金花，+++++表示金花生长茂盛。金花茂盛程度：+表示表面分布均匀，++表示内部与内部分布均匀，-表示金花内部分布不均匀
由上述结果比较可知，本发明所述的Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1菌株，在茶叶发酵过程中,能够耐高温，并通过保持对其他菌的生长优势，进而达到抑制其他非目标菌生长繁殖的目的；有效缩短了生产周期，提高了成品率，并保证了茶叶的品质。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (11)
1.一种冠突散囊菌株，其分类命名为(Eurotium cristatum NHRI-BC-1.5.1)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.8730。
2.一种含权利要求1所述冠突散囊菌株的菌株混合物，其特征在于，还包括所述菌株生长的培养基。
3.一种黑茶产品的加工方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的冠突散囊菌株或权利要求2所述的菌株混合物对黑毛茶进行发酵发花的步骤。
4.根据权利要求3所述的加工方法，其特征在于，还包括取黑毛茶进行筛分、拼配、汽蒸、渥堆、二次汽蒸、压砖、发花、干燥、包装的步骤。
5.根据权利要求4所述的加工方法，其特征在于，发花温度为25-34℃。
6.根据权利要求5所述的加工方法，其特征在于，发花温度为30-34℃。
7.根据权利要求4-6任一所述的加工方法，其特征在于，在二次气蒸后压砖之前混入如权利要求1所述的冠突散囊菌株或权利要求2所述的菌株混合物。
8.根据权利要求7所述的加工方法，其特征在于，
所述拼配步骤中含按重量计占总重的15-20％的茶梗；
所述汽蒸步骤条件为，蒸汽压力0.3-0.6Mpa，温度为105-115℃，汽蒸时间为10-15秒；
所述渥堆步骤操作的高度为40-60cm，空气相对湿度为80％以上，时间为2-8h；
所述二次汽蒸步骤的蒸汽压力为0.3-0.5Mpa，温度为98-102℃，汽蒸时间小于10秒，退砖温度为40℃。
9.根据权利要求8所述的加工方法，其特征在于，冠突散囊菌菌株及所述冠突散囊菌株混合物的接种量为黑茶重量的0.5％-4％。
10.如权利要求1所述的冠突散囊菌菌株在茶叶发酵领域的应用。
11.如权利要求2所述的含冠突散囊菌株混合物在茶叶发酵领域的应用。
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