CN111235038A - 一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法 - Google Patents
一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111235038A CN111235038A CN202010129486.4A CN202010129486A CN111235038A CN 111235038 A CN111235038 A CN 111235038A CN 202010129486 A CN202010129486 A CN 202010129486A CN 111235038 A CN111235038 A CN 111235038A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- eurotium cristatum
- strain
- extract
- cristatum strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 121
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 121
- 241001205401 Aspergillus cristatus Species 0.000 title claims abstract description 73
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 18
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 13
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 6
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 6
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 6
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 4
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 4
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 2
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 claims description 2
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 241000168254 Siro Species 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 210000004990 primary immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域,公开了一种冠突散囊菌株,冠突散囊菌株(Eurotium cristatum)116于2019年11月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏,保藏编号为CGMCC No.18826;同时还公开了一种发酵液提取物的制备方法,该方法包括菌种活化、种子液制备、一级发酵、二级发酵、超声辅助提取、离心处理、微滤、浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥等步骤,本发明优化了冠突散囊菌株发酵液提取物的制备工艺,其提取纯度更高,所制取发酵液提取物提高免疫力的效果更加明显,为进一步研究提高免疫力的药物、食品或保健食品提供了依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体的说涉及一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法。
背景技术
“金花菌”,即冠突散囊菌,是茯砖茶生产的优势菌,在茯砖茶上长有大量金黄色颗粒,俗称“金花”。“金花”是茯砖茶独特风味的主要影响因素,长年饮用茯砖茶有调理肠胃、促进消化、降血糖、降血脂、增强人体体质及延缓衰老等功效,而这些功效与“金花菌”的作用是密不可分的。冠突散囊菌的发酵液提取物同样具备抗氧化、抑菌、抑制乙酰胆碱脂酶活性作用、肉制品保鲜功能及提高免疫力作用,但是目前冠突散囊菌发酵液提取物的制备工艺太过粗糙,其提取纯度较低,如中国专利申请:201710010631.5,所提取得到的发酵液提取物功效较差,无法满足提高免疫力的药物、食品或保健食品功效的高要求。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明要解决的技术问题在于提供了一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明通过以下方案来实现:一种冠突散囊菌株(Eurotium cristatum)116,该菌株已于2019年11月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏,保藏编号为CGMCC No.18826。
本发明的一种冠突散囊菌株发酵液提取物,该发酵液提取物以冠突散囊菌株116为菌种,通过以下步骤制备而成:
(1)菌种活化:挑取冠突散囊菌株菌丝接种于PDA平板上,25℃培养5天,连续活化2次;
(2)种子液制备:在去离子水中加入PDB、KH2PO4 、MgSO4·7H2O、维生素B1充分搅拌溶解,pH自然,配置得到PDB 24.0 g/L,KH2PO4 3.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,维生素B1 10.0mg/L的种子培养液;
从步骤1中PDA平板上取5个0.5 cm2大小菌块连同培养基分别接种到含有250 ml种子培养基的500 ml三角瓶中,在恒温震荡培养箱上培养5天(培养温度为25℃,转速150 rpm);
(3)一级发酵:制备7.0L发酵培养基置于10L一级发酵罐中,121℃高压原位灭菌后冷却后备用;将步骤2中制备的冠突散囊菌株种子液在火焰保护法下接种于10L一级发酵罐发酵培养基中,接种量为1-10%;接种后,在温度24-30℃,转速60-250rpm,通气量0.1-4 m3/h,罐压0.01-0.06MPa条件下发酵3-20天,得到冠突散囊菌株一级发酵液;
(4)二级发酵:制备70L发酵培养基置于100L二级发酵罐中,121℃高压原位灭菌后冷却后备用;将步骤3中制备的冠突散囊菌株一级发酵液移种至100L二级发酵罐发酵培养基中,接种量为1-10%;接种后,在温度24-30℃,转速60-250rpm,通气量0.3-5m3/h,罐压0.01-0.06MPa条件下发酵4-35天,得到冠突散囊菌株二级发酵液;
(5)超声辅助提取:将步骤4得到的冠突散囊菌株的发酵液在聚能式超声提取机中超声处理20 min,超声频率20KHz,超声功率1200-3600W,占空比1:1-5:5,连续超声处理2次;
(6)离心处理:将步骤5中冠突散囊菌株的发酵液通入管式离心机中,以转速19000rpm高速离心处理60分钟得到发酵液清液;
(7)微滤:将步骤6中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入超滤陶瓷膜,温度35-45℃,循环流量6 m3/h,进行微滤40 min除去悬浮物得到发酵液清液和浓缩液;
(8)浓缩:将步骤7中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入卷式膜,温度27-32℃,循环流量1200L/h,进口压力0.25MPa,纳滤浓缩20 min得到发酵浓缩液;
(9)喷雾干燥或冷冻干燥:将步骤7和步骤8中冠突散囊菌发酵浓缩液,通入喷雾干燥器中,进风温度为150-220℃,出口温度为80-120℃,喷雾干燥得到冠突散囊菌发酵液提取物;或将步骤7和步骤8中冠突散囊菌发酵浓缩液,放入冷冻干燥机不锈钢托盘中,经过预冻、一次升华、二次解析过程在-60-40℃下真空冷冻干燥24-72h获得发酵液提取物。
进一步的,所述步骤2中每个500 ml三角瓶中加入250 ml培养基并在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
进一步的,所述步骤3中发酵培养基的制备方法为:在去离子水中加入碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、维生素B1充分搅拌溶解,得到碳源 10-50g/L,氮源1-20g/L, KH2PO4 2-10 g/L,MgSO4·7H2O 0.5-5.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.05-2.5 g/L,维生素B1 10-100 mg/L的发酵培养液,调节pH至5.0-6.5,在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
进一步的,所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种;所述氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种。
进一步的,所述步骤4中发酵培养基的制备方法为:在去离子水中加入碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、维生素B1充分搅拌溶解,得到碳源 10-50g/L,氮源1-20g/L, KH2PO4 2-10 g/L,MgSO4·7H2O 0.5-5.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.05-2.5 g/L,维生素B1 10-100 mg/L的发酵培养液,调节pH至5.0-6.5,在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
进一步的,所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种;所述氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种。
进一步的,该冠突散囊菌株发酵液提取物在制备提高免疫力的药物、食品或保健食品方面的应用。
相对于现有技术,本发明的有益效果是:本发明的冠突散囊菌株的活化启动快,只需连续活化2次即可完成活化进行发酵工作,同时,本发明通过菌种活化、种子液制备、一级发酵、二级发酵、超声辅助提取、离心处理、陶瓷膜微滤、卷式膜纳滤浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥等一系列步骤来制备得到冠突散囊菌株发酵液提取物,相对于现有技术,本发明优化了发酵液提取物的制备工艺,其提取纯度更高,所制取发酵液提取物提高免疫力的效果更加明显,为进一步研究提高免疫力的药物、食品或保健食品提供了依据。
附图说明
图1为本发明优选实施例中发酵液提取物的制备方法流程图;
图2为本发明发酵液提取物对RAW264.7对数生长期细胞的活性影响示意图;
图3为本发明发酵液提取物对小鼠脾淋巴细胞的活性影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述,以使发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解,从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明的一种冠突散囊菌(Eurotium cristatum)116,该菌株已于2019年11月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.18826。
本发明的冠突散囊菌株用于制备冠突散囊菌株发酵液提取物,一种冠突散囊菌株发酵液提取物,以冠突散囊菌株116为菌种,通过以下步骤制备而成:
(1)菌种活化:挑取冠突散囊菌株菌丝接种于PDA平板上,25℃培养5天,连续活化2次;
(2)种子液制备:在适量去离子水中加入36克PDB、4.5克KH2PO4 、2.25克MgSO4·7H2O、15mg维生素B1充分搅拌溶解,再加入适量去离子水配置得到1.5L种子培养液,充分搅拌,pH自然;
从步骤1中PDA平板上取5个0.5 cm2大小菌块连同培养基分别接种到含有250 ml种子培养基的500 ml三角瓶中(每个500 ml三角瓶中加入250 ml培养基并在121℃高压灭菌20min,冷却后备用),在恒温震荡培养箱上培养5天(培养温度为25℃,转速150 rpm);
(3)一级发酵:制备7.0L发酵培养基置于10L一级发酵罐中,121℃高压原位灭菌后冷却后备用;将步骤2中制备的冠突散囊菌株种子液在火焰保护法下接种于10L一级发酵罐发酵培养基中,接种量为1-10%;接种后,在温度24-30℃,转速60-250rpm,通气量0.1-4 m3/h,罐压0.01-0.06MPa条件下发酵3-20天,得到冠突散囊菌株一级发酵液;
一级发酵培养液制备:在适量去离子水中加入10g碳源、10g氮源、2克KH2PO4、1克MgSO4·7H2O、1克FeSO4·7H2O、10mg维生素B1充分搅拌溶解,再加入适量去离子水配置得到1L一级发酵培养液(碳源 10g/L,氮源10g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,FeSO4·7H2O 1 g/L,维生素B1 10 mg/L),充分搅拌,调节pH至5.0-6.5,在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
(4)二级发酵:制备70L发酵培养基置于100L二级发酵罐中,121℃高压原位灭菌后冷却后备用;将步骤3中制备的冠突散囊菌株一级发酵液移种至100L二级发酵罐发酵培养基中,接种量为1-10%;接种后,在温度24-30℃,转速60-250rpm,通气量0.3-5m3/h,罐压0.01-0.06MPa条件下发酵4-35天,得到冠突散囊菌株二级发酵液;
二级发酵培养液制备:在适量去离子水中加入10g碳源、10g氮源、2克KH2PO4、1克MgSO4·7H2O、1克FeSO4·7H2O、10mg维生素B1充分搅拌溶解,再加入适量去离子水配置得到1L一级发酵培养液(碳源 10g/L,氮源10g/L, KH2PO4 2 g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,FeSO4·7H2O 1 g/L,维生素B1 10 mg/L),充分搅拌,调节pH至5.0-6.5,在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
(5)超声辅助提取:将步骤4得到的冠突散囊菌株的发酵液在聚能式超声提取机中超声处理20 min,超声频率20KHz,超声功率1200-3600W,占空比1:1-5:5,连续超声处理2次;
(6)离心处理:将步骤5中冠突散囊菌株的发酵液通入管式离心机中,以转速19000rpm高速离心处理60分钟得到发酵液清液;
(7)微滤:将步骤6中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入超滤陶瓷膜,温度35-45℃,循环流量6 m3/h,进行微滤40 min除去悬浮物得到发酵液清液和浓缩液;
(8)浓缩:将步骤7中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入卷式膜,温度27-32℃,循环流量1200L/h,进口压力0.25MPa,纳滤浓缩20 min得到发酵浓缩液;
(9)喷雾干燥:将步骤7和8中冠突散囊菌发酵浓缩液,通入喷雾干燥器中,进风温度为150-220℃,出口温度为80-120℃,喷雾干燥得到冠突散囊菌发酵液提取物。
需要说明的是,步骤3中的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种,本优选实施例采用葡萄糖作为碳源来制备一级发酵培养液,步骤3中的氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种,本优选实施例采用酵母粉作为氮源来制备一级发酵培养液。
需要说明的是,步骤4中的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种,本优选实施例采用葡萄糖作为碳源来制备二级发酵培养液,步骤4中的氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种,本优选实施例采用蛋白胨作为氮源来制备二级发酵培养液。
本发明冠突散囊菌株发酵液提取物在制备提高免疫力的药物、食品或保健食品方面具有广泛的应用。
实施例2 冠突散囊菌发酵液提取物的提高免疫力作用
本实施例通过以下两种方法对上述发酵和提取干燥获得的冠突散囊菌发酵液提取物进行活性检测评估:
A细胞活性评价:取RAW264.7对数生长期细胞配制为合适浓度,并取200 μL接种于96孔板中铺板,置于37°C,5%二氧化碳恒温培养箱中培养过夜后,将本发明发酵和提取干燥获得的冠突散囊菌发酵液提取物配制成不同浓度溶液,给予1-200 µg/ml (具体的为2µg/ml、10µg/ml、50µg/ml、100µg/ml、200µg/ml)发酵液提取物给药处理,分别在培养24 h后加入10 μL CCK-8孵育3小时,450 nm波长处检测吸光度值,按公式(1a)计算细胞增殖活性,以免疫增强剂AHCC作为阳性对照药物。
增殖率(%)=(A样品-A对照)/A对照×100% (1a)
本发明获取的冠突散囊菌发酵液提取物能明显促进该细胞增殖,结果见图2。结果表明,100 µg/mL浓度下AHCC和冠突散囊菌发酵液提取物均能显著促进巨噬细胞RAW264.7的增殖活性(P < 0.01)。
B原代免疫细胞活性评价:无菌取脾,制备小鼠脾淋巴细胞悬液,调整细胞浓度为1 × 106 个/mL, 于 96 孔板接种 100 µL/孔,再分别加入培养液(空白对照)、5 µg/mLConA(阳性对照)及不同浓度冠突散囊菌发酵液提取物溶液,置 37℃,5% CO2培养箱内孵育48 h。CCK8 法检测450 nm 吸光值,按公式(1b)计算细胞增殖活性淋巴细胞增殖指数SI。以免疫增强剂AHCC作为阳性对照药物。
SI=样品组吸光值/空白对照组吸光值×100% (1b)
本发明获取的冠突散囊菌发酵液提取物能明显促进该细胞增殖,结果见图3。实验结果表明,50 µg/ml发酵液提取物能够显著刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖,但是对Con A协同作用弱于AHCC。
以上所述仅为本发明的优选实施方式,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种冠突散囊菌株(Eurotium cristatum)116,其特征在于,该菌株已于2019年11月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏,保藏编号为CGMCCNo.18826。
2.一种冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于,以权利要求1所述的冠突散囊菌株116为菌种,通过以下步骤制备而成:
(1)菌种活化:挑取冠突散囊菌株菌丝接种于PDA平板上,25℃培养5天,连续活化2次;
(2)种子液制备:在去离子水中加入PDB、KH2PO4 、MgSO4·7H2O、维生素B1充分搅拌溶解,pH自然,配置得到PDB 24.0 g/L,KH2PO4 3.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,维生素B1 10.0mg/L的种子培养液;
从步骤1中PDA平板上取5个0.5 cm2大小菌块连同培养基分别接种到含有250 ml种子培养基的500 ml三角瓶中,在恒温震荡培养箱上培养5天(培养温度为25℃,转速150 rpm);
(3)一级发酵:制备7.0L发酵培养基置于10L一级发酵罐中,121℃高压原位灭菌后冷却后备用;将步骤2中制备的冠突散囊菌株种子液在火焰保护法下接种于10L一级发酵罐发酵培养基中,接种量为1-10%;接种后,在温度24-30℃,转速60-250rpm,通气量0.1-4 m3/h,罐压0.01-0.06MPa条件下发酵3-20天,得到冠突散囊菌株一级发酵液;
(4)二级发酵:制备70L发酵培养基置于100L二级发酵罐中,121℃高压原位灭菌后冷却后备用;将步骤3中制备的冠突散囊菌株一级发酵液移种至100L二级发酵罐发酵培养基中,接种量为1-10%;接种后,在温度24-30℃,转速60-250rpm,通气量0.3-5m3/h,罐压0.01-0.06MPa条件下发酵4-35天,得到冠突散囊菌株二级发酵液;
(5)超声辅助提取:将步骤4得到的冠突散囊菌株的发酵液在聚能式超声提取机中超声处理20 min,超声频率20KHz,超声功率1200-3600W,占空比1:1-5:5,连续超声处理2次;
(6)离心处理:将步骤5中冠突散囊菌株的发酵液通入管式离心机中,以转速19000rpm高速离心处理60分钟得到发酵液清液 发酵浓缩液,放入冷冻干燥机不锈钢托盘中,经过预冻、一次升华、二次解析过程在-60-40℃下真空冷冻干燥24-72h获得发酵液提取物。
3.根据权利要求2所述的冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于:所述步骤2中每个500 ml三角瓶中加入250 ml培养基并在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
4.根据权利要求2所述的冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于:所述步骤3中发酵培养基的制备方法为:在去离子水中加入碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、维生素B1充分搅拌溶解,得到碳源 10-50g/L,氮源1-20g/L, KH2PO4 2-10 g/L,MgSO4·7H2O0.5-5.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.05-2.5 g/L,维生素B1 10-100 mg/L的发酵培养液,调节pH至5.0-6.5,在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
5.根据权利要求4所述的冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于:所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种;所述氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种。
6.根据权利要求2所述的冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于:所述步骤4中发酵培养基的制备方法为:在去离子水中加入碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、维生素B1充分搅拌溶解,得到碳源 10-50g/L,氮源1-20g/L, KH2PO4 2-10 g/L,MgSO4·7H2O0.5-5.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.05-2.5 g/L,维生素B1 10-100 mg/L的发酵培养液,调节pH至5.0-6.5,在121℃高压灭菌20 min,冷却后备用。
7.根据权利要求6所述的冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于:所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种;所述氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种。
8.根据权利要求2所述的冠突散囊菌株发酵液提取物,其特征在于:该冠突散囊菌株发酵液提取物在制备提高免疫力的药物、食品或保健食品方面的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010129486.4A CN111235038A (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010129486.4A CN111235038A (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111235038A true CN111235038A (zh) | 2020-06-05 |
Family
ID=70873082
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010129486.4A Pending CN111235038A (zh) | 2020-02-28 | 2020-02-28 | 一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111235038A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111635915A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-08 | 中南林业科技大学 | 一种冠突散囊菌黑色素发酵产物的制备方法与应用 |
CN114304600A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-12 | 中华全国供销合作总社济南果品研究院 | 一种冠突散囊菌发酵小米粉的制备方法 |
CN116064685A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-05-05 | 大连工业大学 | 一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103305565A (zh) * | 2013-06-13 | 2013-09-18 | 彭呈悦 | 一种冠突散囊菌菌丝体提取物的制备方法 |
CN104739888A (zh) * | 2013-12-31 | 2015-07-01 | 深圳华大基因科技有限公司 | 冠突散囊菌菌粉及其制备方法和应用 |
CN104893984A (zh) * | 2015-04-07 | 2015-09-09 | 安徽农业大学 | 一种冠突散囊菌株 |
CN104928184A (zh) * | 2014-03-17 | 2015-09-23 | 中国土产畜产进出口总公司 | 一种茶源冠突散囊菌菌株及其应用 |
CN105434690A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-03-30 | 贵州大学 | 一种废弃茶渣利用冠突散囊菌生产浴足粉的方法 |
CN106497806A (zh) * | 2017-01-06 | 2017-03-15 | 青岛农业大学 | 一种冠突散囊菌株及其应用 |
WO2018161216A1 (zh) * | 2017-03-06 | 2018-09-13 | 中国茶叶有限公司 | 一种冠突散囊菌及其应用 |
CN110591926A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-12-20 | 青岛中科星熠高新技术研究院有限公司 | 一种冠突散囊菌生产发酵方法、菌粉及药物 |
-
2020
- 2020-02-28 CN CN202010129486.4A patent/CN111235038A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103305565A (zh) * | 2013-06-13 | 2013-09-18 | 彭呈悦 | 一种冠突散囊菌菌丝体提取物的制备方法 |
CN104739888A (zh) * | 2013-12-31 | 2015-07-01 | 深圳华大基因科技有限公司 | 冠突散囊菌菌粉及其制备方法和应用 |
CN104928184A (zh) * | 2014-03-17 | 2015-09-23 | 中国土产畜产进出口总公司 | 一种茶源冠突散囊菌菌株及其应用 |
CN104893984A (zh) * | 2015-04-07 | 2015-09-09 | 安徽农业大学 | 一种冠突散囊菌株 |
CN105434690A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-03-30 | 贵州大学 | 一种废弃茶渣利用冠突散囊菌生产浴足粉的方法 |
CN106497806A (zh) * | 2017-01-06 | 2017-03-15 | 青岛农业大学 | 一种冠突散囊菌株及其应用 |
WO2018161216A1 (zh) * | 2017-03-06 | 2018-09-13 | 中国茶叶有限公司 | 一种冠突散囊菌及其应用 |
CN110591926A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-12-20 | 青岛中科星熠高新技术研究院有限公司 | 一种冠突散囊菌生产发酵方法、菌粉及药物 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ZHENG-FEI YAN ET AL: "Immune activation effects of Eurotium cristatum on T cells through NF-κB signaling pathways in humans", 《FOOD AND AGRICULTURAL IMMUNOLOGY》, 2 March 2017 (2017-03-02), pages 388 - 400 * |
李文娟: "冠突散囊菌液体发酵工艺的研究", 《陕西科技大学学报》, vol. 34, no. 1, 28 February 2016 (2016-02-28), pages 128 - 133 * |
杨娟娟等: "冠突散囊菌与金黄色葡萄球菌混合发酵次级代谢产物及细胞毒活性", 《科技导报》, no. 09, 13 May 2016 (2016-05-13), pages 96 - 101 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111635915A (zh) * | 2020-06-29 | 2020-09-08 | 中南林业科技大学 | 一种冠突散囊菌黑色素发酵产物的制备方法与应用 |
CN114304600A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-12 | 中华全国供销合作总社济南果品研究院 | 一种冠突散囊菌发酵小米粉的制备方法 |
CN114304600B (zh) * | 2022-01-12 | 2023-06-30 | 中华全国供销合作总社济南果品研究院 | 一种冠突散囊菌发酵小米粉的制备方法 |
CN116064685A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-05-05 | 大连工业大学 | 一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用 |
CN116064685B (zh) * | 2022-12-26 | 2024-02-02 | 大连工业大学 | 一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111235038A (zh) | 一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法 | |
JP6398135B2 (ja) | 茶系発酵飲料、栄養補助食品の製造方法 | |
CN103330258B (zh) | 一种液体深层发酵制备的蛹虫草保健饮料及其制备方法 | |
CN106497806B (zh) | 一种冠突散囊菌株及其应用 | |
CN108504621B (zh) | 用于蝙蝠蛾拟青霉Cs-4的培养基及其制备方法 | |
CN106635820B (zh) | 一种高产茶褐素的黑曲霉菌株及其应用 | |
CN112760271B (zh) | 一种负压条件下高密度发酵生产丁酸梭菌的工艺及应用 | |
CN105077484A (zh) | 一种桑黄风味饮品及其制备方法 | |
WO2021012870A1 (zh) | 一种低嘌呤豆浆粉及其制作方法 | |
CN109554265A (zh) | 一种甜酒酿低醇饮料及其制备方法 | |
CN116064685B (zh) | 一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用 | |
CN113969242B (zh) | 一种高产γ-氨基丁酸的酿酒酵母菌以及在制备γ-氨基丁酸产品中的应用 | |
CN109504725B (zh) | 一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基 | |
CN108330069B (zh) | 酵母浸液及其制备方法和应用 | |
CN114304335A (zh) | 一种发酵富集石斛叶活性成分的方法及其应用 | |
CN106135542B (zh) | 一种绿茶茶汤的澄清方法 | |
CN116121078B (zh) | 一种联合制备高蛋白粉和高核酸破壁菌丝体的方法 | |
CN109593627B (zh) | 一种沙棘枸杞保健果酒的电场强化酿造工艺 | |
CN111567711A (zh) | 一种具有高生物可利用度的黄嘌呤氧化酶抑制活性酵素饮料的制备方法 | |
CN116376729A (zh) | 异常威克汉姆酵母、微生物制剂和枸杞西打酒及其酿造方法 | |
CN109321469A (zh) | 一株高产乳糖酶的米曲霉及其发酵产酶方法 | |
CN109662224B (zh) | 一种富含辅酶q10苹果汁的发酵生产方法及辅酶q10苹果汁 | |
CN115068571A (zh) | 一种基于多种乳杆菌发酵制备的中药饮品及其制备方法 | |
CN111607621A (zh) | 一种产玫瑰花香的酵母及其在灵武长枣酵素中的应用 | |
CN104651157A (zh) | 一种牦牛乳清低醇饮料的生产方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200605 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |