CN110408551A - 一株美孢胶膜菌qs104及其应用和促进兜兰无菌苗生长的方法 - Google Patents

一株美孢胶膜菌qs104及其应用和促进兜兰无菌苗生长的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株美孢胶膜菌QS104及其应用和促进兜兰生长的方法，涉及兜兰无菌苗培养技术领域，本发明所述美孢胶膜菌QS104(Tulasnella calospora)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17777。本发明所述美孢胶膜菌QS104是从兜兰根部分离的植物内生真菌，经鉴定为美孢胶膜菌。本发明研究表明，将所述美孢胶膜菌QS104与兜兰无菌苗进行共培养能够显著提高兜兰的干物质量，提高兜兰无菌苗中的P、S、Mg、Fe、Zn和Mn等元素的含量。

Description

一株美孢胶膜菌QS104及其应用和促进兜兰无菌苗生长的 方法
技术领域
本发明涉及兜兰无菌苗培养技术领域，尤其涉及一株美孢胶膜菌QS104及其应用和促进兜兰无菌苗生长的方法。
背景技术
兜兰(Paphiopedium)又称拖鞋兰，我国台湾地区称之为仙履兰，该属植物全世界约有70余种，广泛分布于亚洲热带地区至太平洋岛屿的热带及亚热带林下。兜兰是洋兰中独具特色的一个类群，也是最奇特的观赏兰花。其观赏性主要体现在(1)花形大而奇特，唇瓣似荷包，有吉祥喜庆的意义；(2)花色艳丽丰富，涵盖红、白、绿、黄等多个色系；(3)一年四季都有不同种类开放，以冬春季集中，易满足春节的观赏需求；(4)单朵花期长，通常可以开放30～60天。兜兰优良的观赏性状已使其成为继蝴蝶兰，大花蕙兰和文心兰之后最具产业前景的兰科花卉。目前世界兜兰每年的销量应该在400万株左右，产值约为1.5亿美元。以世界花卉主要出口和销售国荷兰为例：2008年荷兰的兜兰销量为200万株左右，其售价在20美元和200美元之间，平均售价在40美元左右。在我国台湾地区，从事兜兰生产和销售的花卉企业有几十家，年产值达数亿新台币，而且这几年兜兰的销量以10％稳步增长。
兜兰种苗产业化生产目前主要依靠种子无菌萌发快繁技术实现。目前，很多兜兰种类的无菌播种和规模化繁殖技术已获成功，但无菌苗生长缓慢，移栽成活率低，制约着兜兰的人工繁育。
发明内容
本发明为了克服现有兜兰无菌苗生长缓慢的缺陷，提供了一株美孢胶膜菌QS104及其应用、一种促进兜兰无菌苗生长的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株美孢胶膜菌QS104(Tulasnella calospora)，所述美孢胶膜菌QS104保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCCNO.17777。
优选的，所述美孢胶膜菌QS104的ITS-5.8S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述美孢胶膜菌QS104在促进兜兰无菌苗生长中的应用。
本发明还提供了一种促进兜兰无菌苗生长的方法，包括以下步骤：
(1)将前述技术方案所述的美孢胶膜菌QS104接种于PDA培养基上培养至菌丝长满培养基表面；
(2)兜兰无菌苗移入无菌苗培养基中培养；
(3)截取一块直径0.3～0.8cm的步骤(1)得到的菌丝长满表面的培养基，接入步骤(2)所述培养有兜兰无菌苗的无菌苗培养基中共培养；
所述步骤(1)和步骤(2)无先后顺序的限制。
优选的，步骤(2)所述兜兰无菌苗为6～10月龄的幼苗。
优选的，步骤(2)中所述无菌苗培养基包括：CaCl2 0.5～2.0mmol/L，MgSO4 0.2～1.0mmol/L，K2SO4 0.5～2.0mmol/L，KH2PO4 0.1～0.8mmol/L，FeSO4 60～150μmol/L，H3BO415～40μmol/L，MnCl2 15～60μmol/L，ZnSO4 1～6μmol/L，NaMoO4 0.5～2.0μmol/L，Na2EDTA100～180μmol/L，酵母浸膏0.5～2.0g/L，琼脂6～10g/L，pH值5.8～6.2。
优选的，所述无菌苗培养基包括：CaCl2 1.0mmol/L，MgSO4 0.5mmol/L，K2SO41.0mmol/L，KH2PO4 0.4mmol/L，FeSO4 100μmol/L，H3BO4 25μmol/L，MnCl2 33μmol/L，ZnSO42.8μmol/L，NaMoO4 1.0μmol/L，Na2EDTA 140μmol/L，酵母浸膏1.0g/L，琼脂8.5g/L，pH值6.0。
优选的，步骤(3)所述共培养的温度为25～28℃。
优选的，步骤(3)所述共培养的光照强度为1200～1400Lux，所述共培养的光照时间为12h/d。
优选的，所述兜兰包括杏黄兜兰。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一株美孢胶膜菌QS104(Tulasnella calospora)，所述美孢胶膜菌QS104保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCCNO.17777。本发明所述美孢胶膜菌QS104是从兜兰根部分离的植物内生真菌，经鉴定为美孢胶膜菌。本发明研究表明，将所述美孢胶膜菌QS104与兜兰无菌苗进行共培养能够显著提高兜兰的干物质量，提高兜兰无菌苗中的P、S、Mg、Fe、Zn和Mn等元素的含量。
保藏说明
美孢胶膜菌(Tulasnella calospora)，参椐生物材料为QS104，于2019年05月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC NO.17777。
附图说明
图1为杏黄兜兰显微结构图；其中，A：杏黄兜兰横切面；B：根被及外皮层细胞；C：皮层细胞中的菌丝团及细胞核；D：维管柱结构；E：根被中的菌丝及破坏的外皮层；F：激光共聚焦显微镜下的菌丝团；
图中标记为：C:皮层；EN：内皮层；EX：外皮层；F：菌丝；N：细胞核；P：菌丝团；PC:通道细胞：PE：中柱鞘；RH：根毛；VC：维管柱；VE：根被；W：细胞壁；XY：木质部；
图2为实施例中分离得到的QS104菌的特征；其中，A为QS104菌落特征；B为菌丝特征。
具体实施方式
本发明提供了一株美孢胶膜菌QS104(Tulasnella calospora)，其特征在于，所述美孢胶膜菌QS104保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17777。在自然条件下，兜兰的种子萌发和植株生长依赖于菌根真菌的帮助，菌根真菌提高兜兰植株提高养分的吸收效率和逆境抵抗力。本发明通过分离培养兜兰的菌根真菌，并利用这些有益的菌根真菌与兜兰幼苗共培养，有效促进了兜兰幼苗的生长，对兜兰规模化栽培以及保护具有重要意义。
本发明所述美孢胶膜菌QS104分离自兜兰根部，如图2-B所示，其菌落呈白色圆周状发散生长，生长面有稀松的白色菌丝，生长速度较快(PDA培养基中的生长速度为11mm/d)，经诱导未见有性孢子形成。
所述美孢胶膜菌QS104的菌丝体光学显微特征：如图2-C所示，其菌丝有分隔，分枝几近直角，分枝处略呈缢缩或不明显缢缩，距菌丝分枝点较近处形成隔膜；具有由桶状无性厚垣孢子串联而成的念珠细胞结构，常见典型厚壁菌丝，菌丝粗2～5μm，常见4μm，有菌环和菌丝融合，为观察到菌核。即具有丝核菌类(Rhizoctonia-like)真菌的典型特征。
在本发明中，所述美孢胶膜菌QS104可以采用适宜真菌生长的培养基进行扩繁和保存，例如PDA培养基；所述美孢胶膜菌QS104的适宜生长温度为25～30℃，适宜pH值为5.5～5.8。
在本发明中，所述美孢胶膜菌QS104的ITS-5.8S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，与现有的美孢胶膜菌的ITS-5.8S rDNA序列相比，相似度在99％以上。
所述SEQ ID NO.1如下：
TGAGGTCATGCGTGGTAGTACCGACGTGCGCAAAGGACGCGGACTTGGTGACACGAGCCCAACGGCCGGTCAAGCACGTGCTCAAACCCAGAAGGACTCCACGCTCAGGCATGTAGAGTACCCATCAGGCGATCGGCGCGACGCATCTAAGAGAACACGATCCAAAGACCGAGGACTCCGAACTCGGGTCTTTCGCGAGGAAAGACTCCCGAAGGAATACAATGACGCTCAAAGGGGCATACCGCAGCCGGATTAGGGCGCGGTGCAATGCGTTCAACAACTCGATGATTCACGTATAAGTGGTGGACTTGCGCATCACATCACTTTATCGCAATTTGCAACGGTCTTCATCGAATGACGTGCCAAGGGATCCAGCGCTGCCGGTTGTAAGATGTTACAACTGGTGTTAGACTCACAATGCGGAACGATCTTTAACGTGTGCCTCGGAAGAGGTAACACAGCAGGGACGGCTTAACCTCGGTCAGAGGGGTCGTTTATCCTCGACCAGAGCGCCTTAACGTCCCGAGGACGACCGGGATAGAATGTC。
本发明还提供了上述技术方案所述美孢胶膜菌QS104在促进兜兰无菌苗生长中的应用。如本发明的实施例所示，本发明将美孢胶膜菌QS104与兜兰无菌苗进行共培养可显著提高兜兰无菌苗的干物质重量以及矿物质元素的吸收。
具体的，本发明提供了一种促进兜兰无菌苗生长的方法，包括以下步骤：
(1)将前述技术方案所述的美孢胶膜菌QS104接种于PDA培养基上培养至菌丝长满培养基表面；
(2)兜兰无菌苗移入无菌苗培养基中培养；
(3)截取一块直径0.3～0.8cm的步骤(1)得到的菌丝长满表面的培养基，接入步骤(2)所述培养有兜兰无菌苗的无菌苗培养基中共培养；
所述步骤(1)和步骤(2)无先后顺序的限制。
本发明将所述美孢胶膜菌QS104接种到PDA培养基中培养是为了对其扩繁，获得较多的真菌以进行后续的共培养。本发明对接种到PDA培养基中的美孢胶膜菌QS104的接种量无特殊限定，挑取一块即可。本发明对美孢胶膜菌QS104接种PDA培养基后的具体培养条件无特殊限定，能够培养至菌丝长满培养基表面即可。
本发明将兜兰无菌苗移入无菌苗培养基中培养的目的是为了便于所述美孢胶膜菌QS104接种。在本发明中，所述兜兰无菌苗优选为6～10月龄的幼苗。在本发明中，所述兜兰的品种包括但不限于杏黄兜兰。
在本发明中，所述无菌苗培养基起到为兜兰无菌苗生长提供营养物质的作用，可以采用本领域已知的任何具有培养兜兰无菌苗的培养基。具体的，所述无菌苗培养基包括：CaCl2 0.5～2.0mmol/L，MgSO4 0.2～1.0mmol/L，K2SO4 0.5～2.0mmol/L，KH2PO4 0.1～0.8mmol/L，FeSO4 60～150μmol/L，H3BO4 15～40μmol/L，MnCl2 15～60μmol/L，ZnSO4 1～6μmol/L，NaMoO4 0.5～2.0μmol/L，Na2EDTA 100～180μmol/L，酵母浸膏0.5～2.0g/L，琼脂6～10g/L，pH值5.8～6.2；更优选的包括：CaCl2 1.0mmol/L，MgSO4 0.5mmol/L，K2SO4 1.0mmol/L，KH2PO4 0.4mmol/L，FeSO4 100μmol/L，H3BO4 25μmol/L，MnCl2 33μmol/L，ZnSO4 2.8μmol/L，NaMoO4 1.0μmol/L，Na2EDTA 140μmol/L，酵母浸膏1.0g/L，琼脂8.5g/L，pH值6.0。
本发明截取一块直径0.3～0.8cm的菌丝长满培养基表面的美孢胶膜菌QS104培养基，将其接入所述培养有兜兰无菌苗的无菌苗培养基中共培养。
在本发明中，所述截取的培养基直径优选为0.5cm。在本发明中，所述共培养的温度优选为25～28℃，更优选为26～27℃。在本发明中，所述共培养的光照强度优选为1200～1400Lux；所述共培养的光照时间更优选为12h/d。
本发明将所述美孢胶膜菌QS104与兜兰无菌苗进行共培养能够有效提高兜兰无菌苗的生长，为解决常规兜兰无菌苗生长缓慢的问题提供了新的解决方案。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、菌根真菌的观察及分离培养
材料：杏黄兜兰(P.armeniacum)地生或半附生植物，产云南西部(碧江、沪水)。生于海拔1400-2100米的石灰岩积土处或多石而排水良好的草坡上，花期2-4月。
激光共聚焦观察根部结构以确定根部材料：WGA-AF(wheat germ agglutinin-alexa fluor conjugate)488(Molecular Probes)可以对菌丝的几丁质特异性染色，根材料固定于无水乙醇中24h以上，徒手切成1mm左右的薄片，置于10％KOH溶液中过夜，将材料置于染液中(10mg/ml WGA-AF 488，0.02％Tween20溶于1×PBS(137mM NaCl，27mM KCl，100mM Na2HPO4，2mM K2HPO4，pH 7.4)染色2h，染色期间每隔15min抽真空一次，然后将材料置于1×PBS溶液中漂洗三次，置于载玻片上镜检。激光共聚焦显微镜型号为OlympusFV1000，WGA-AF 488激发光为488nm激光，检测光为500～540nm。
结果：菌根真菌菌丝通过根毛进入根被细胞，再通过破坏外皮层细胞侵染皮层细胞并形成内生菌根结构(图1A-E，其中各字母分别表示如下内容，A：杏黄兜兰横切面；B：根被及外皮层细胞；C：皮层细胞中的菌丝团及细胞核；D：维管柱结构；E：根被中的菌丝及破坏的外皮层；F：激光共聚焦显微镜下的菌丝团。且图片内的标记C:皮层；EN：内皮层；EX：外皮层；F：菌丝；N：细胞核；P：菌丝团；PC:通道细胞：PE：中柱鞘；RH：根毛；VC：维管柱；VE：根被；W：细胞壁；XY：木质部)。皮层细胞是菌根真菌栖息的主要场所。离根尖1-2cm处的菌根真菌生长最为旺盛。
3、菌根内生真菌分离
3.1根材料采集
剪取适宜数量成年健壮兜兰的完整根段，流水下冲洗干净，用纱布擦干，从根尖1-2cm处切成1cm左右的根段。
3.2真菌的分离、纯化、保存及诱导产孢
分离培养基为改良PDA培养基：去皮马铃薯200g/L，切成0.5cm厚的片，沸水煮30min后取其汁，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO41.5g/L，柠檬酸0.1g/L，VB110mg/L，酵母浸膏1g/L，琼脂粉14g/L，pH值自然，121℃灭菌20min。无菌条件下以75％的乙醇浸泡30s，再用0.1％氯化汞表面消毒4min，无菌水冲洗4-5次后，将材料切成2-3mm的小段，接种于真菌分离培养基上，27℃黑暗培养。挑取自材料切片中发出的菌丝多次转移培养获得纯化菌株，接种于改良PDA斜面，4℃保存。
诱导产孢：将菌株接种在仅含琼脂的培养基上，37℃培养一个月诱导产孢；菌株在4℃的冰箱中保存6个月诱导产孢。
3.3特征菌根真菌培养及挑选
菌株接种于PDA平板上，27℃黑暗培养，记录菌株生长速度，观察菌落特征。同时挑取菌根真菌菌丝，OLYMPUS CX31型显微镜观察，JVC TK-C721EG照相。挑选具有丝核菌类特征的菌株转移到新鲜的PDA培养基上。
所述四核菌类特征包括：
1)幼年菌丝分枝末梢有隔膜；
2)菌丝分枝点有缢痕；
3)分支点不远处有隔膜。
结果：从杏黄兜兰均分离得到QS104，QS104在PDA平板是呈白色圆周状发散生长，生长面有稀松的白色菌丝，生长速度较快(11mm/d)，经诱导未见有性生殖孢子形成(图2-A)。
菌丝体光学显微特征：菌丝有分隔，分枝几近直角(图2-B)，分枝处略呈缢缩或不明显缢缩，距菌丝分枝点较近处形成隔膜；具有由桶状无性厚垣孢子串联而成的念珠细胞结构，常见典型厚壁菌丝，菌丝粗2～5μm，常见4μm，有菌环和菌丝融合，未观察到菌核。基于培养特征和菌丝体光学显微特征初步鉴定为丝核菌类(Rhizoctonia-like)真菌。
二、菌根真菌的分子鉴定
1、DNA提取
取新鲜纯培养的菌丝，采用改良的2×CTAB法提取DNA。具体操作步骤如下：
1)取纯培养的真菌菌丝，置于1.5mL离心管中，在液氮中充分冷却，用预先灭过菌的研磨棒将材料磨成粉末，加入700μL2×CTAB提取液(提取液配方：100mM Tris pH 8.0，20mM EDTA，1.4M NaCl，2％w/v CTAB，1％w/v PVP，0.2％β-巯基乙醇)。65℃水浴60分钟。
2)从水浴锅中取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)轻轻摇晃10min，以12000r/min离心10min，吸取上清液转入新的离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)重新抽提一次。
3)取上清液，加等体积的提前预冷(-20℃放置)的异丙醇摇匀，置于-20℃的冰箱过夜，沉淀DNA。
4)取出离心管，以12000r/min离心10min，室温下，将上清液缓慢的倒掉，用干净的吸水纸垫将离心管倒置(充分控尽其上清液，每一步尽可能的避免污染)。
5)加200μl的70％乙醇和无水乙醇各清洗一遍，以除去残留的杂质。真空干燥DNA。
6)加35μLTE buffer，-20℃下备用。
7)检测DNA：1.0％的琼脂糖胶(0.30g胶粉+30mL TAE溶液，微波炉450℃，加热90s，稍冷却，加入2μLEB染料，倒胶，冷却30min)，上样2μl检测。
PCR扩增引物
2、DNA特征引物的扩增
表1 PCR扩增引物名称及碱基组成
2)PCR扩增反应体系
采用25μl反应体系，包括：
10×PCR Buffer(含10mM Tris-Hcl，50mM kcl，1％Triton×1w)2.5μl；
Mg2+25mM 2.5μl；
dNTP 2.5mM 1.5μl；
TaqE 0.3μL；
正向Primer 2μl；
反向Primer 2μl；
真菌DNA2μl；
ddH2O(双蒸水)补充至25μl。
3)PCR扩增反应及产物检测
94℃变性3min，然后进入32个反应循环：94℃变性30s，48-52℃退火30s，72℃延伸55s，循环结束后72℃再延伸7min。
1.5％的琼脂糖胶(0.45g胶粉+30mL TAE溶液，微波炉450℃，加热90s，稍冷却，加入2μL EB染料，倒胶，冷却30min)，上样2μl检测。
3、菌根真菌DNA序列分析
将PCR反应产物送至生工生物工程技术服务有限公司，割胶纯化后检测。得到的序列文件用ContigExpress软件进行校对，仔细核查每一个碱基以确保所得序列的准确性。然后通过BLAST搜索在GenBank中进行序列比对，从GenBank中选择相关的序列和本研究得到的真菌序列一起分析。
测序结果如SEQ ID NO.1所示：
ATGAGGTCATGCGTGGTAGTACCGACGTGCGCAAAGGACGCGGACTTGGTGACACGAGCCCAACGGCCGGTCAAGCACGTGCTCAAACCCAGAAGGACTCCACGCTCAGGCATGTAGAGTACCCATCAGGCGATCGGCGCGACGCATCTAAGAGAACACGATCCAAAGACCGAGGACTCCGAACTCGGGTCTTTCGCGAGGAAAGACTCCCGAAGGAATACAATGACGCTCAAAGGGGCATACCGCAGCCGGATTAGGGCGCGGTGCAATGCGTTCAACAACTCGATGATTCACGTATAAGTGGTGGACTTGCGCATCACATCACTTTATCGCAATTTGCAACGGTCTTCATCGAATGACGTGCCAAGGGATCCAGCGCTGCCGGTTGTAAGATGTTACAACTGGTGTTAGACTCACAATGCGGAACGATCTTTAACGTGTGCCTCGGAAGAGGTAACACAGCAGGGACGGCTTAACCTCGGTCAGAGGGGTCGTTTATCCTCGACCAGAGCGCCTTAACGTCCCGAGGACGACCGGGATAGAATGTC
表2分离得到的QS104菌根真菌DNA比对结果
可以看出，QS104的ITS-5.8S rDNA序列和美孢胶膜菌(Tulasnella calospora)(GenBank accession number FJ613176)有99％的相似性，通过形态学特征，GenBank序列比对(表2)表明，QS104属于美孢胶膜菌。
本发明将得到的美孢胶膜菌QS104于2019年05月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17777。
实施例2美孢胶膜菌QS104和杏黄兜兰无菌苗共培养
1、材料与方法：
供试杏黄兜兰幼苗为9月龄大小均一无菌幼苗，(株高2～3cm，叶4～5片，根2～4条，根长约1cm左右)。供试菌株为从杏黄兜兰中分离得到内生真菌——美孢胶膜菌QS104(保藏编号CGMCC NO.17777)。
共培养培养基选用DE培养基。
DE培养基配方：CaCl2 1.0mmol/L，MgSO4 0.5mmol/L，K2SO4 1.0mmol/L，KH2PO40.4mmol/L，FeSO4 100μmol/L，H3BO4 25μmol/L，MnCl2 33μmol/L，ZnSO4 2.8μmol/L，NaMoO41.0μmol/L，Na2EDTA 140μmol/L，酵母浸膏1.0g/L，琼脂8.5g/L，pH值6.0。
共培养方法：将兜兰幼苗在无菌操作台中接入盛有培养基的兰花组培瓶中(容积600mL，瓶口内径4cm，培养基120mL/瓶)，每瓶5株幼苗。将共培养的真菌在PDA平板上培养，待菌丝长满平板，用直径0.5cm的打孔器取PDA平板上的菌株琼脂块，置于兰花瓶的中央，距每株幼苗的距离大致相等。每个处理30个重复。对照组不接菌。所有处理组和对照组均置于温度25-28℃，光照1200-1400Lux 12h/d的组培室内培养。
生物量指标的测量：共培养150d之后，以瓶为单位，将苗取出测量鲜重，80℃烘箱中烘48h，测量叶片干重，根干重，总干重。矿质元素含量测量：以6瓶为单位，将兜兰接菌苗和对照苗置于80℃烘箱中烘干，研磨后过60目筛。样品送至云南大学现代测试分析中心，采用混合酸消煮法提取苗内矿质元素，ICP-AES(电感耦合等离子体原子发射光谱仪)测量苗内各元素含量。数据分析使用SPSS 16.0统计软件。
结果：在DE培养基上，接种QS104的杏黄兜兰鲜重比对照组显著增加，叶干重、根干重和总干重与对照组无显著差异(表3)。接种QS104的杏黄兜兰总鲜重、叶干重、根干重和总干重分别高于对照组63.758％、43.510％、18.218％和20.263％(表4)，从干物重增加百分率上看，QS104对杏黄兜兰生长有的促进作用。杏黄兜兰接菌苗的Ca元素含量比对照组显著减少，P、S、Mg、Fe、Zn、Mn元素含量极显著增加(表4)。
表3 DE培养基上兜兰接菌组与对照组的生物量差异
对照组 接菌组 P
总鲜重(g) 0.677±0.078 1.051±0.127 0.036*
叶干重(g) 0.055±0.005 0.074±0.005 0.029*
根干重(g) 0.035±0.002 0.045±0.001 0.003**
总干重(g) 0.090±0.005 0.120±0.005 0.003**
注：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)
表4 DE培养基上兜兰接菌组与对照组的矿质元素含量差异
对照组 接菌组 P
钙Ca(μg/g) 3915.97±17.082 3787.28±30.488 0.021*
锰Mn(μg/g) 117.06±0.060 124.06±0.685 0.001**
硫S(μg/g) 2427.914±24.738 2723.26±21.320 0.001**
铁Fe(μg/g) 310.697±2.395 797.60±1.150 0.000**
锌Zn(μg/g) 22.838±0.515 36.900±0.682 0.000**
镁Mg(μg/g) 1165.669±3.729 1366.997±2.685 0.000**
磷P(μg/g) 3851.297±25.849 5473.152±72.246 0.000**
注：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 一株美孢胶膜菌QS104及其应用和促进兜兰无菌苗生长的方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 547
<212> DNA
<213> Tulasnella calospora
<400> 1
tgaggtcatg cgtggtagta ccgacgtgcg caaaggacgc ggacttggtg acacgagccc 60
aacggccggt caagcacgtg ctcaaaccca gaaggactcc acgctcaggc atgtagagta 120
cccatcaggc gatcggcgcg acgcatctaa gagaacacga tccaaagacc gaggactccg 180
aactcgggtc tttcgcgagg aaagactccc gaaggaatac aatgacgctc aaaggggcat 240
accgcagccg gattagggcg cggtgcaatg cgttcaacaa ctcgatgatt cacgtataag 300
tggtggactt gcgcatcaca tcactttatc gcaatttgca acggtcttca tcgaatgacg 360
tgccaaggga tccagcgctg ccggttgtaa gatgttacaa ctggtgttag actcacaatg 420
cggaacgatc tttaacgtgt gcctcggaag aggtaacaca gcagggacgg cttaacctcg 480
gtcagagggg tcgtttatcc tcgaccagag cgccttaacg tcccgaggac gaccgggata 540
gaatgtc 547
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcggcaaat tatcctcata ag 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagtagaagc tgcatagggt c 21
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgtgtttca agacggg 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acccgctgaa cttaagc 17

Claims (10)

1.一株美孢胶膜菌QS104(Tulasnella calospora)，其特征在于，所述美孢胶膜菌QS104保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCCNO.17777。
2.根据权利要求1所述的美孢胶膜菌QS104，其特征在于，所述美孢胶膜菌QS104的ITS-5.8S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述美孢胶膜菌QS104在促进兜兰无菌苗生长中的应用。
4.一种促进兜兰无菌苗生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1或2所述的美孢胶膜菌QS104接种于PDA培养基上，培养至菌丝长满培养基表面；
(2)兜兰无菌苗移入无菌苗培养基中培养；
(3)截取一块直径0.3～0.8cm的步骤(1)得到的菌丝长满表面的培养基，接入步骤(2)所述培养有兜兰无菌苗的无菌苗培养基中共培养；
所述步骤(1)和步骤(2)无时间顺序的限制。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述兜兰无菌苗为6～10月龄的幼苗。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述无菌苗培养基包括：CaCl20.5～2.0mmol/L，MgSO4 0.2～1.0mmol/L，K2SO4 0.5～2.0mmol/L，KH2PO4 0.1～0.8mmol/L，FeSO4 60～150μmol/L，H3BO4 15～40μmol/L，MnCl2 15～60μmol/L，ZnSO4 1～6μmol/L，NaMoO4 0.5～2.0μmol/L，Na2EDTA 100～180μmol/L，酵母浸膏0.5～2.0g/L，琼脂6～10g/L，pH值5.8～6.2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无菌苗培养基包括：CaCl2 1.0mmol/L，MgSO4 0.5mmol/L，K2SO4 1.0mmol/L，KH2PO4 0.4mmol/L，FeSO4 100μmol/L，H3BO4 25μmol/L，MnCl2 33μmol/L，ZnSO4 2.8μmol/L，NaMoO4 1.0μmol/L，Na2EDTA 140μmol/L，酵母浸膏1.0g/L，琼脂8.5g/L，pH值6.0。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述共培养的温度为25～28℃。
9.根据权利要求4或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述共培养的光照强度为1200～1400Lux，所述共培养的光照时间为12h/d。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述兜兰包括杏黄兜兰。
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