KR101303715B1 - 신규한 백색 팽이버섯의 모균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 백색 팽이버섯을 만들 수 있는 신규한 모균주(KCCM11129P) 및 신규한 백색 팽이버섯 균주의 분리방법에 관한 것이다. 본 발명의 다포자 임의교배법에 의해 분리된 백색 팽이버섯 균주는 공지된 백색 팽이버섯 균주와는 완전히 다른 유전적 차이를 보이는 신품종으로 로열티 절약 및 농업 고부가 창출을 통한 국가 수출경쟁력 향상에 크게 기여할 수 있다.

Description

신규한 백색 팽이버섯의 모균주{Parent Strain of Novel White Flammulina velutipes}
본 발명은 신규한 백색 팽이버섯의 모균주 및 신규한 백색 팽이버섯 균주의 분리방법에 관한 것이다.
팽이버섯(Flammulina velutipes)은 분류학상 담자균아문(Basidiomycota), 주름버섯목(Agaricales), 송이과(Tricholomataceae), 팽나무버섯속(Flammulina)의 5종 가운데 하나인 벨루티페스(velutipes)로 분류된다. 야생종의 경우, 온대에서 한대에 걸쳐 늦가을부터 초봄까지의 저온기에 활엽수의 그루터기나 고목에서 다발로 발생하는데 자실체 색상이 황갈색 내지 밤색이고 갓 직경과 대의 굵기가 크고 대의 길이가 짧다(공원식, 박사학위논문, 건국대학교 대학원, 1997을 참조).
현재 식용버섯으로 재배되고 있는 팽이버섯은 1899년 일본에서 감나무 원목을 사용하여 자연기상조건에서 인공재배가 시작된 이래 1926년 포자접종방법이 개발되어 골목재배가 성행되었고, 톱밥배지를 이용한 상자재배가 1928년에 처음으로 시도되었으며, 이후 미강을 이용한 영양원 첨가 등의 재배법이 발달하여 현재에 이르고 있다. 우리나라에서는 1936년에 처음 골목재배 방법이 언급되었으며, 이후 농촌진흥청 농업과학기술원에서 연구되어 1980년대 말부터 일반 농가에 보급되어졌다(유창예, 석사학위논문, 경상대학교 대학원, 1997을 참조). 재배종의 특징은 야생종과는 달리 갓의 크기가 10㎜이하, 대의 길이가 100 내지 140㎜를 나타내고, 대직경이 2 내지 4㎜정도가 된다(Won-Sik Kong, Kor. J. Mycol., 25(2), 111-120, 1997을 참조).
팽이버섯의 번식방법은 유성생식과 무성생식으로 나누어진다. 유성생식은 균사에서 자실체가 생장해 4극성의 담자포자를 형성하고, 이것이 발아되어 증식을 한다. 무성생식은 형성된 이핵균사가 끊어져서 생긴 분열자라는 무성포자가 발아, 증식한다. 팽이버섯은 균사생장 중 무성생식과정이 특히 많이 이루어져 단핵균사와 이핵균사에서 1핵의 분열자의 형성이 쉽게 일어나는 특성이 있다(Takemaru, T., Trans. Mycol. Soc. Japan, 36, 152-157, 1995을 참조).
이러한 팽이버섯의 육종은 경제성을 고려하여 생산성이 높고, 재배가 용이하고, 포자의 생산에 있어 유전적인 안정성이 중요하게 고려되었고, 특히 소비자의 선호도를 위한 백색종의 개발에 대한 연구가 두드러졌다.
하지만, 현재 세계적으로 재배되고 있는 팽이 백색품종은 모두 일본에서 육성된 품종으로 그 혈연관계가 매우 가깝기 때문에 유전적 구성이 유사하다. 따라서 팽이를 재배하고 수출하는 우리나라의 경우 본격적인 품종보호제도가 이루어질 때 상당액의 로얄티를 요구 받을 수 있으며 이는 우리 농가에 심각한 타격을 줄 수 있을 것이다. 이에 우리 고유의 백색품종의 개발은 시급한 일이라 할 것이다.
신품종의 개발을 위한 육종방법으로는 재배중 우수한 형질을 나타내는 버섯을 선별하여 포자를 받아 종균을 배양하는 영양생식선발법(Senbatsu)과 균사생장시 형성된 단핵균주를 이용한 교배법에 의한 육종방법이 사용되어졌다. 전자에 의한 방법은 좋은 형질에 대한 안정적인 유전성이 떨어지고, 재배환경의 미세한 변화에 생산성이 급격히 줄어드는 단점이 있다. 교배법은 야생종 혹은 재배종에서 원하는 형질을 가지고 있는 단핵균주들을 선발 및 분리하는 공정이 필요해 원하는 형질을 가진 단핵균주가 없을 경우에는 적용하기가 힘든 단점이 있다(Kitamoto, Y., In Genetics and Breeding of Edible Mushrooms, Gordon and Breach Science Publishers, pp 65-86, 1993을 참조).
따라서, 상기 육종방법의 단점을 보강한 육종방법의 개발과 한국 고유의 백색 팽이버섯 품종의 육성 및 농가보급에 대한 요청이 지속되어 왔다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 로열티 걱정 없이 농업 고부가 창출에 기여할 수 있는 신품종의 백색 팽이버섯 균주를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 다포자 임의교배법에 의해 백색 팽이버섯 균주를 분리할 경우 기존의 백색 팽이버섯 균주와는 완전히 다른 유전적 차이를 보이는 신품종 백색 팽이버섯 균주를 분리해 낼 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 백색 팽이버섯을 만들 수 있는 신규한 모균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 모균주로 형성된 갈색 팽이버섯 자실체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 모균주로부터 신규한 백색 팽이버섯 균주의 분리방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 신규한 백색 팽이버섯을 만들 수 있는 신규한 모균주를 제공한다. 상기 균주는 2010년 11월 9일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(기탁번호: KCCM 11129P).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 모균주로부터 형성된 갈색 팽이버섯 자실체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신규한 모균주로부터 신규한 백색 팽이버섯 균주의 분리방법을 제공한다:
(a) 팽이버섯 포자의 배양 및 단핵균주 분리 단계;
(b) 상기 분리된 단핵균주를 교잡하여 교잡균주를 선발하는 단계; 및
(c) 상기 선발된 교잡균주를 이용하여 다포자 임의교배법을 수행하는 단계.
본 발명자들은 국가 고유품종 육성노력의 일환으로 신품종의 백색 팽이버섯 균주를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 다포자 임의교배법에 의해 백색 팽이버섯 균주를 분리할 경우 기존의 백색 팽이버섯 균주와는 완전히 다른 유전적 차이를 보이는 신규한 백색 팽이버섯 균주를 분리해 낼 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 단핵균주의 분리
본 발명의 방법에 따르면, 우선 팽이버섯 균주로부터 포자를 수집한다. 본 발명에서 이용하는 팽이버섯은 당업계에 공지된 다양한 종류의 팽이버섯을 포함하며, 바람직하게는 갈색 팽이버섯, 보다 바람직하게는 농촌진흥청 보존균주 ASI4004, ASI4005, ASI4006, ASI4008, ASI4009, ASI4017, ASI4019, ASI4023, ASI4025, ASI4028, ASI4045, ASI4048, ASI4049, ASI4052, ASI4057, ASI4065 또는 ASI4072를 이용하여 포자를 수집한다.
포자를 수집하는 방법은 제한되지 않으며 예를 들어, 클린벤치에서 성숙한 신선한 버섯을 선택하여 대를 자른 후 버섯에서 갓의 주름살 부분이 유리접시의 샤레바닥쪽을 향하게 올려놓고 공기의 유동을 방지하기 위하여 뚜껑을 덮는 방식으로 수집할 수 있다. 포자 수집을 위한 온도는, 바람직하게는 10-30℃, 보다 바람직하게는 15-20℃에서 수집하며, 수집시간은 바람직하게는 1-60시간, 보다 바람직하게는 3-30시간, 가장 바람직하게는 6-15시간 동안 수집한다.
상기 수집된 포자는 배지에 배양하여 단핵균주를 분리한다. 본 발명에서 이용하는 배지는 제한되지 않으며, 바람직하게는 MCM(Mushroom Complete Medium) 배지, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지, YMPG(Yeast-Malt-Peptone-Glucose) 배지, YM(Yeast-Malt) 배지 또는 MEA(Malt Extract Agar) 배지, 보다 바람직하게는 MCM 배지, PDA 배지 또는 YMPG 배지, 가장 바람직하게는 MCM 배지 또는 PDA 배지를 이용하여 배양한다. 상기 포자의 배양을 위한 온도는, 바람직하게는 10-35℃, 보다 바람직하게는 20-30℃에서 배양하며, 배양시간은 바람직하게는 2-10일, 보다 바람직하게는 3-6일 동안 배양한 뒤 단핵균주를 분리한다.
단계 (b): 교잡균주의 선발
이어, 상기 분리된 단핵균주를 교잡하여 교잡균주를 육성 및 선발한다. 교잡의 방법은 제한되지 않으며, Mono-mono 교잡법, Di-Mon 교잡법 등 당업계에 공지된 다양한 교잡법을 이용할 수 있다. 본 명세서에서 용어, “Mono-mono 교잡법”은 1핵 균사와 1핵 균사 간의 교배를 의미한다. 예를 들어, 먼저 교잡에 사용될 1핵 균주들의 균총 가장자리에서 균을 떼어낸다. 그런 다음, 배지에 종류가 다른 1핵 균사를 약 0.5~1 ㎝ 정도 떨어진 상태로 대치시켜 놓는다. 대치 후 약 15일 정도 지나면 양쪽에서 자란 균사가 서로 부딪힌 곳에서 교잡의 성공여부를 확인할 수 있다. 만약 교잡이 이루어 졌다면 꺽쇠(clamp)가 만들어지는 것을 확인할 수 있으며, 이 부분을 떼어서 새로운 배지로 옮겨 배양하면 이것이 바로 mono-mono 교잡에 의해 만들어진 원균이 된다. 본 명세서에서 용어, “Di-mono 교잡법”은 꺽쇠 연결을 통해 2핵 균사에 있는 두 개의 핵 중에 하나가 1핵 균사의 세포내로 그대로 이동하기 때문에 모균주의 특정한 형질을 가진 새로운 균주 육성에 유용한 방법이다. Di-mon 교잡법은 예를 들어, 육종목표에 적합하다고 판단되는 균주의 2핵 균사와 또 다른 균주의 1핵 균사를 서로 대치(2-3 ㎝ 정도의 간격) 시켜 놓고, 23℃ 정도에서 15일 정도 배양하여 1핵 균사 뒤편에 새롭게 만들어진 균사가 꺽쇠를 가지는 2핵 균사인지 광학 현미경으로 확인 후 분리 배양하는 육종법이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 두 개 단핵 균주를 같은 샤레에 10 ㎜ 정도 띄워 접종 한 다음, 20-30℃ 정도에서 5-20일간 배양한 후 양 균사가 마주치는 지점에서 균사를 떼어내고 현미경으로 클램프(꺽쇠)의 존재를 확인하고, 5-10일 후 균총의 양끝에서 클램프가 있는 것을 다시 확인하여 교잡균주를 선발할 수 있다.
단계 (c): 다포자 임의교배법 수행
마지막으로, 상기 선발된 교잡균주를 이용하여 다포자 임의교배법을 수행한다. 다포자 임의교배법은 상기 단계(a) 내지 (b) 이후에 수행하는 방법 외에도 상기 단계(a) 내지 (b)를 생략하고 다포자 임의교배법만을 수행하여 이핵균주를 선발하여 본 발명에 따른 백색 팽이버섯 균주를 분리할 수도 있다.
다포자 임의교배법은 종래의 육종법과 달리 단포자 분리단계, 교배유형 결정단계, 현미경 검정단계 및 단핵균주간 교배단계 등을 생략할 수 있으며, 손쉽게 한번에 많은 교배를 통하여 이핵균주의 생산이 가능하다.
다포자 임의교배법은 먼저, 육성코자하는 버섯의 유용형질을 가진 양친을 선발하고 포자를 수집하여 이를 섞은 포자 현탁액을 제조하고, 이로부터 무작위 교배를 수행한 뒤, 이로부터 목표형질을 가진 버섯을 선발하고, 조직분리로 원균을 획득하는 단계를 거친다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 다포자 임의교배법은 다음의 단계를 포함한다: (c-1) 서로 다른 또는 하나의 팽이버섯으로부터 포자를 수집하는 단계; (c-2) 상기 포자를 포함하는 포자 현탁액을 제조하는 단계; (c-3) 상기 포자 현탁액을 배양하여 무작위 교배를 수행하는 단계; (c-4) 상기 무작위 교배로 백색 형질을 가진 개체를 선발하는 단계; 및 (c-5) 조직분리를 통하여 백색 팽이버섯의 원균을 획득하는 단계.
상기 포자의 수집 방법은 버섯으로부터 포자를 수집할 수 있는 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 버섯의 갓을 이용하여 버섯 주름이 아래로 향하도록 놓아 포자를 수집할 수 있다.
포자의 현탁액은 포자를 담을 수 있는 용기 등을 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 유리병을 이용하여 서로 다른 포자가 섞이도록 한다. 포자가 섞일 수 있도록 용매를 이용할 경우, 상기 용매는 예를 들어, 물, 액체배지 등 당업계에 공지된 다양한 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 오염을 방지하기 위해 멸균수를 사용한다.
상기 방법에 의해 제조된 포자 현탁액은 배지, 바람직하게는 PDA배지에 도말하여 배양하며, 배양기를 이용하여 배양할 경우, 바람직하게는 1-30일, 보다 바람직하게는 3-20일, 가장 바람직하게는 7~14일간 배양하면 발아된 단핵균사 간 무작위교배가 이루어진다.
상기 무작위 교배를 통하여 정상적인 버섯을 발생 시킨 후 원하는 특성을 가진 균을 선발하며, 선발된 균을 유지하기 위하여는 버섯으로부터 조직분리하여 원균으로 사용할 수 있다.
본 발명의 분리 방법으로 분리된 백색 팽이버섯은 공지된 다른 다양한 품종의 DNA 패턴과 전혀 다른 양상의 유전적 차이를 보이는 신품종의 백색 팽이버섯 균주이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 신규한 백색 팽이버섯을 만들 수 있는 신규한 모균주 및 갈색 팽이버섯 자실체를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 신규한 백색 팽이버섯 균주의 분리방법을 제공한다.
(ⅲ) 본 발명의 다포자 임의교배법에 의해 분리된 신규한 백색 팽이버섯 균주는 공지된 일본의 백색 팽이버섯 균주와는 다른 유전적 차이를 보이는 신품종으로 로열티 절약 및 농업 고부가 창출을 통한 국가 수출경쟁력 향상에 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 팽이버섯 유전자원의 특성 평가에 의한 자실체 재배적 형태적 특성 조사를 나타낸 도면이다.
도 2는 버섯의 일반적인 포자 수집 방법을 나타내는 사진이다.
도 3은 단핵균주를 분리하는 단계를 나타낸 모식도이다.
도 4는 교잡에 필요한 도구를 나타낸 사진이다.
도 5는 교잡의 방법으로 대치배양을 시킨 모습을 나타내는 사진이다.
도 6은 교잡의 결과 클램프가 형성된 모습을 나타내는 사진이다.
도 7은 다포자임의교배법에 의해 포자현탁액을 배양하는 과정의 사진이다.
도 8은 갈색 야생균주간 교잡에 의해 고유의 백색 균주를 육성한 사진을 나타내는 도면이다.
도 9은 본 발명의 백색균주와 모균주 및 일본 순백계 간 유전적 차이를 나타내는 도면이다.
도 10는 본 발명의 신규한 모균주로 형성된 갈색 팽이버섯 자실체를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
팽이버섯 유전자원 특성 평가
본 발명자들이 원하는 백색의 팽이버섯 품종을 육성하기 위하여 현재 전세계적으로 재배되는 일본의 품종인 백색계통이 아닌 갈색들만의 교잡으로 일본 백색과는 다른 새로운 백색 팽이버섯 품종을 제작하고자 하였다.
가. 공시균주
본 연구에 사용한 균주는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과에서 수집 보존하고 있는 팽이버섯 ASI 4001등 102 가지의 균주를 공시하였다(표 1).
시험에 사용된 균주
근원 한국 일본 중국 미국 독일 필리핀 총합
균주의 수 35 48 10 7 1 1 102
나. 배양적 특성조사
배지종류 시험
팽이버섯 균주별로 균사생장에 알맞은 배지의 종류와 균사생장 정도를 조사하기 위하여 PDA(Gellix PDA 39 g, 물 1000 ㎖), YM(Yeast ext. 3 g, Malt ext 3 g, Peptone 5 g, Dextrose 10 g, Agar 20 g, 물 1000 ㎖), MEA(Malt ext 20 g, Peptone 5 g, Agar 20 g, 물 1000 ㎖), MCM(Dextrose 20 g, MgSO4 0.46 g, K2HPO4 1 g, Yeast ext. 2 g, Peptone 2 g, Agar 20 g, 물 1000 ㎖)배지를 만들어 직경 87 ㎜의 일회용 샤레에 넣고 버섯균사를 접종하여 7일간 배양한 다음 균총의 직경을 측정하였다.
배양온도 시험
PDA배지가 들어있는 유리접시에 균주별로 접종을 하여 10, 15, 20, 25, 30, 35℃에서 7일간 배양을 한 다음 균총의 직경을 측정하였다.
다. 재배적 특성조사
미송톱밥과 미강을 8:2의 부피비율로 혼합하여 수분함량을 65%정도로 조절하여 850 ㎖ PP. 병에 넣어 고압살균을 하였다. 여기에 팽이버섯 공시균주별로 접종을 하여 25℃에서 균을 배양한 다음 표준재배법에 의하여 환경조절한 재배사에서 버섯의 발생 유무를 조사하고 버섯무게, 형태, 색깔, 크기 등을 조사하였다.
배양방법:
-> 표준온도 조건: Fruiting 14℃, Cold room 4℃, Growth 7℃
갈색자실체 형성 균주(16균주)에서 포자 수집 단핵균주 육성
가. 포자채취
포자의 채취는 일반적인 버섯에서의 방법(도 2)을 다소 수정하여 다음의 방법을 이용하였다:
①클린벤치에서 성숙한 신선한 버섯을 선택하여 대를 자른 후 버섯에서 갓의 주름살 부분이 유리접시의 샤레바닥 쪽을 향하게 가볍게 올려놓고 공기의 유동을 방지하기 위하여 뚜껑을 덮었다.
②버섯을 넣은 샤레는 온도가 15-20℃이고 주위가 청결한 곳에 6-15시간 동안 포자를 낙하 시킨 후 버섯을 제거하고 4℃ 냉장고에 보관하였다.
나. 단핵 균주 분리
한 자실체(버섯)로부터 담자포자를 받아 4℃에 보관하면서 필요에 따라 시험에 사용하였다. 단포자 분리는 증류수에 연속적으로 희석하여 MCM배지가 든 평판배지에 약 1x104개를 도포하여 25℃에서 3-6일간 배양한 후 각각의 균총을 현미경으로 관찰하여 클램프(clamp)가 없는 것을 단핵균주로 판단하였으며, 이를 새로운 PDA(Potato Dextrose Agar)배지로 옮겨 시험에 사용하였다(도 3).
단핵균주간 교잡에 의한 교잡균주 육성
가. 실험재료
도 4와 같이, 포자의 교잡에 필요한 도구들(알콜램프, 스페츌라, 펀치)를 준비하고 상기 분리한 단핵균주를 준비하였다. 교잡 전 교잡균주는 코르크보러나 펀치로 디스크(원형 접종원)를 만들었다. 모든 작업은 무균상에서 이루어 졌다(도 4).
나. 교잡방법
교잡은 두 개 단핵 균주를 같은 샤레에 10 ㎜ 정도 띄워 접종 한 다음, 25℃에서 7-12일간 배양하였다. 배양후 양 균사가 마주치는 지점에서 균사를 떼어내어 현미경으로 클램프의 존재를 확인하고, 7일 후 균총의 양끝에서 다시 확인하여 클램프가 있는 것을 2핵균사로 간주하여 교배가 된 것으로 보았다.
교잡은 의외로 간단하며 대치배양을 원칙으로 하였으며, 교잡주의 번호와 실험 날짜를 미리 써두었다. (도 5 a).
버섯에 따라 차이가 있지만 대부분 25℃에서 배양을 하였으며 시간이 지나면 도 5(b)에서 처럼 중앙에 대치선이 생기면서 일부 교잡이 이루어졌다. 교잡의 유무는 현미경으로 클램프 생성의 유무로 확인하였다(도 6). 상기의 실험결과 454개의 이핵균주를 육성하였다(표 2).
Figure 112011011554079-pat00001
상기 표에서 가로축, 새로축은 농진청 버섯과 보존균주번호이며(예를 들어, 4004는 ASI4004, 4005는 ASI4005 등), 표 내부의 분수 형식의 데이터는 이핵화가 확인된 균주/단핵균주간 교잡균주수를 의미한다.
다. 포자취득
상기의 방법을 통하여 얻은 이핵균주는 모두 갈색의 자실체를 형성하였으며, 이 중 연갈색을 보이는 이핵균주를 선발(52(22), 23(16)으로 표기)하여 포자를 취득하였다(도 8의 패널B).
다포자 임의교배법에 의한 백색 팽이버섯 육성
가. 실험방법
다포자 임의교배법을 통하여, 백색 팽이버섯 균주를 얻을 수 있었다. 다포자 임의교배법에 의한 백색 팽이버섯 균주의 육성 방법은 다음과 같다.
1) 포자받기: 우선 52(22) 품종을 선택한 후 일회용 샤레에 갓만 따서 주름이 아래로 향하도록 놓고 뚜껑을 약간만 열어두었다. 하루밤이면 55(22)의 충분한 포자가 받아졌다.
2) 포자현탁액 만들기: 작은 유리병(20-30 ㎖)에 물을 2/3 정도 채운 후 멸균하였다. 멸균수가 식은 후에 크린벤치에서 피펫끝에 멸균수를 찍어 미리 받아놓은 55(22)의 포자를 피펫끝에 뭍힌 후 이를 멸균수가 든 병에 풀어 55(22)의 포자현탁액을 만들었다.
3) 포자현탁액의 도말: PDA배지에 만들어 놓은 포자 현탁액을 몇 방울(50-200 ㎕) 떨어뜨린 후 유리막대로 배지면에 고르게 폈다. 이렇게 도말한 배지는 배양기에서 7~14일간 배양하면 발아된 단핵균사 간 무작위교배가 이루어졌다(도 7).
4) 균총의 선발: 배양된 균총은 서로 분리되어 자라므로 시험자의 능력에 맞는 양의 균총을 따서 서로 다른 샤레에 옮겨 배양하였다.
5) 선발 및 균의 유지: 각각을 배양 후 병에 접종하여 정상적인 버섯을 발생 시킨 후 백색의 특성을 가진 5가지 균주(23(16)-52, 52(22)-46, 52(22)-42, 52(22)-41, 52(22)-45)를 선발하였다. 선발된 균주를 유지하기 위하여는 버섯으로부터 조직분리하여 원균으로 사용할 수 있었다.
나. 실험결과
다포자 임의교배법을 이용한 계통육성의 경우 종래 기술인 관행육종법(계통육성 기간: 90일)과 비교하여 약 1/3의 시간이 소요되었다(계통육성 기간: 30일). 상기의 방법을 통하여 백색자실체를 형성하는 5개의 균주(23(16)-52, 52(22)-46, 52(22)-42, 52(22)-41, 52(22)-45로 표기)를 획득하였으며(도 8의 패널 C), 상기 5개의 균주 중 52(22) 다포자(F1)에서 백색버섯을 다수 얻을 수 있어 이 모본계통 52(22)를 SS line으로 명명하였다. 상기 균주는 2010년 11월 9일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(기탁번호: KCCM 11129P)
상기 육성된 고유의 백색계통과 일본품종 간의 DNA 패턴 비교
가. 게놈 DNA 추출
공시재료는 현재 농가에서 가장 많이 재배되는 일본품종 고사(C)와 SS line를 대조품종으로 하고 육성계통 7균주 중 갈색버섯을 생산하는 2균주(B)와 백색버섯을 생산하는 5균주(W)를 사용하였다. 게놈 DNA 추출을 위한 균사 배양은 PDA 플레이트에 균사를 접종하여 26℃의 인큐베이터에서 7일간 배양하였다. 그 후 MCM 액체배지에 PDA 플레이트에서 자란 균사를 옮겨 접종하였고, 7일간 액체배지에 배양하여 균사를 동결 건조시킨 후 본 실험에 사용하였다. DNA는 TOYOBO사의 Mag Extractor(Plant DNA purification kit)를 이용하여 추출하였다. 동결 건조한 균사를 액체질소로 곱게 마쇄하여 균사 500 ㎎에 라이시스 버퍼 600 ㎕를 넣고 65℃에서 10분 반응시킨 후, 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)을 600 ㎕ 첨가하고 볼텍싱(vortexing)한 후 13,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상등액만 취하였다. 여기에 흡착액 600 ㎕와 자성비드 40 ㎕를 넣은 후 트래퍼에 튜브를 끼워 자성비드에 DNA가 붙게 하였다. 자성비드를 세정액과 70% 에탄올로 2번씩 세척한 후 상온에서 10분간 건조시켜 100 ㎕의 3차 멸균수에 녹였다. 트래퍼에 튜브를 끼워 자성비드와 DNA가 녹아있는 액을 분리한 후 DNA만 새 튜브에 옮겨 4℃에 보관, PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였다.
나. URP - PCR 조건
URP-PCR은 바이오니아의 PCR Premix 키트를 이용하였고, premix 키트에 게놈 DNA 50 ng 2 ㎕, 프라이머 100 ng 1 ㎕, DDW 17 ㎕를 첨가하였다. PCR 증폭반응은 ABI PCR SYSTEM 9700을 이용하여 처음 DNA의 열변성을 위하여 94℃에서 5분간 1 사이클, 그리고 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간으로 총 35 사이클 실시하였으며, 최종 DNA의 합성은 72℃에서 10분으로 하였다. 증폭된 PCR 산물은 1× TAE(40 mM Tris; pH 8.0, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA) 완충용액에서 1.5%의 아가로스겔로 전기영동한 후 1 ㎍/㎖ 브롬화 에티듐(ethidium bromide) 용액으로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터상에서 나타나는 DNA 밴드를 확인하였다. 프라이머는 12개로 이루어진 상용 프라이머(SRILS UniPrimer Kit) 중 No. 9 를 사용하였다.
다. 실험결과
상기 방법을 통하여 일본품종과 본 실험에서 분리된 고유의 백색계통의 DNA 패턴을 비교한 결과 서로 다른 양상의 유전적 차이를 나타내어 완전히 다른 품종에 해당함을 확인할 수 있었다(도 9).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11129P 20101109

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 다음의 단계를 포함하며, 백색 팽이버섯 균주(Flammulina velutipes SS line인 SS41 KCCM 11129P)의 분리방법:
    (a) 팽이버섯 포자의 배양 및 단핵균주 분리 단계;
    (b) 상기 분리된 단핵균주를 교잡하여 교잡균주를 선발하는 단계; 및
    (c) 상기 선발된 교잡균주를 이용하여 단핵균주의 분리 없이 다포자 임의교배법을 수행하는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 다포자 임의교배법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백색 팽이버섯 균주의 분리방법:
    (a) 서로 다른 품종 또는 하나의 팽이버섯으로부터 포자를 수집하는 단계;
    (b) 상기 포자를 포함하는 포자 현탁액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 포자 현탁액을 배양하여 무작위 교배를 수행하는 단계;
    (d) 상기 무작위 교배로 백색 형질을 가진 개체를 선발하는 단계; 및
    (e) 조직분리를 통하여 백색 팽이버섯의 원균을 획득하는 단계.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 배양은 MCM(Mushroom Complete Medium) 배지, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지, YMPG(Yeast-Malt-Peptone-Glucose) 배지, YM(Yeast-Malt) 배지 및 MEA(Malt Extract Agar) 배지로 구성된 군으로부터 선택되는 배지를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 배양은 배양 온도 25℃ 에서 3 내지 6일간 배양하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
  7. 삭제
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 팽이버섯은 갈색 팽이버섯인 것을 특징으로 하는 분리방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 배양은 7 내지 14일간 배양하는 것을 특징으로 하는 분리방법.



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