CN113337408A

CN113337408A - 一种香菇菌株jxb5及其应用

Info

Publication number: CN113337408A
Application number: CN202110817247.2A
Authority: CN
Inventors: 张根伟; 刘振国; 李书生; 马宏; 刘昆昂; 尹淑丽; 付艳菊
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113337408B

Abstract

本发明涉及一种香菇菌株JXB5及其应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19376，保藏日期为2020年4月10日。该菌株的原基数少，子实体圆整、肉厚、硬质、不易开伞，出菇潮次分明；菌株木质素和纤维素酶活、抗杂能力均高于主栽品种。以该菌株作为亲本进行杂交育种，可以较大概率获得早熟、原基数数量适中、子实体圆整肉厚、不易开伞的杂交子代。

Description

一种香菇菌株JXB5及其应用

技术领域

本发明属于香菇育种技术领域，具体涉及一种香菇菌株JXB5及其应用。

背景技术

我国香菇年产量占世界总产量的80%以上。香菇菌种作为重要的生产资料，对产量、质量和生产方式起着决定性的作用。按照出菇期的早晚，可以把我国香菇主栽品种分为早熟、中熟和晚熟品种。早熟品种L18、868、0912等，虽然出菇早产量高，但出菇过多、过密，严重影响香菇品质；中熟品种808、168等，品质优，但出菇晚，产量较低，占用生产设施时间长；晚熟品种939、135等，一般150天以上出菇，现在已经很少有人使用。随着我国香菇栽培逐步向机械化、工厂化发展，急需较短时间就可以实现优质菇生产的香菇品种，实现香菇高效现代生产。

优良特异香菇种质是香菇育种的基础。在香菇育种研究领域，除了要求菌株吃料能力强、抗性强、适温广、产量高外，还要求香菇子实体中大型、肉厚密实、营养丰富等。从菌株特性角度，影响香菇子实体品质的因素有：（1）原基数量要适合，原基数过多，则品质下降；（2）子实体要不易开伞，容易开伞则菇长不大、菇肉薄；（3）菇形要圆整、硬质，硬质菇方便运输。然而，由于缺少早熟、少原基、肉厚、不易开伞、硬质等优良特异香菇种质，制约了早熟优质香菇品种的育种工作。

发明内容

本发明提供一种香菇菌株JXB5及其在育种中的应用，该菌株具有抗杂能力强、木质素和纤维素酶活高，早熟、硬质、少原基、肉厚、不易开伞等优良特性。

本发明采用如下技术方案：

一种香菇菌株JXB5（冀香B5），分类命名为香菇Lentinula edodes，保藏号为CGMCCNo.19376。该菌株于2020年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该菌株的菌株特性为：80天出菇，原基数3-9个，出菇温度8-28℃，头潮菇子实体直径66.4mm，厚度31.2mm，柄长32.6mm，硬度1.54 kg/cm²，属于肉厚型硬质子实体，出菇潮次分明；木质素和纤维素酶活直径分别为25.8mm和18.6mm，高于0912等主栽品种；抗杂能力与0912等主栽品种相当。

本发明还包括上述香菇菌株JXB5产生的原生质体。

本发明还包括上述香菇菌株JXB5产生的孢子。

本发明还包括上述香菇菌株JXB5产生的菌丝体。

本发明还包括上述香菇菌株JXB5产生的子实体。

本发明还包括包含上述香菇菌株JXB5的菌棒。

本发明还包括上述香菇菌株JXB5在香菇育种中的应用。以该菌株为亲本分别与0912、扣香、灵仙1号杂交。结果表明：杂交子代生长速度＞4.0mm/d菌株占72.8%-83.3%，出菇时间≤85d菌株占62.5%-66.7%，原基数≥25个菌株占22.8%-31.3%，原基数13-24个占51.0%-54.4%，原基数≤12个占16.2%-24.0%，圆整肉厚不易开伞菌株占33.3%-42.7%。

本发明还包括上述香菇菌株JXB5在制备香菇子实体、香菇菌丝体和/或香菇孢子中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明的香菇菌株JXB5（冀香B5）克服了现有的早熟香菇主栽品种原基过多，通过舒蕾进行原基数量控制，费工费时等缺点，具有早熟、硬质、少原基、子实体圆整肉厚不易开伞等优良特性，与多原基亲本进行杂交，可以大幅度提高获得早熟、原基数数量适中、子实体圆整肉厚不易开伞的杂交子代的概率，为早熟优质香菇选育提供了优良育种材料。

附图说明

图1为JXB5（冀香B5）的子实体照片。

图2为16个香菇菌株亲缘关系聚类分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1早熟硬质少原基肉厚型香菇JXB5选育

以香菇868（早熟广温）和808（中熟硬质）为亲本，杂交选育出冀香15（中早熟硬质中大香菇）；以香菇L18（早熟高温）和808（中熟硬质）为亲本杂交选育出冀香3号（中熟硬质香菇）。冀香15和冀香3号均为河北省成果转化服务中心评价品种，可以在网上查询，河北省科学院生物研究所可以提供菌株。以冀香15和冀香3号为亲本，杂交选育出菇形似808，早熟、硬质、少原基、肉厚、不易开伞优良香菇种质JXB5。

具体选育过程如下：

①单孢分离：

将香菇亲本冀香15和冀香3号7分开伞菌盖分别置于培养皿中，25℃静置24小时，收集落在培养皿中的孢子，并在无菌水中稀释成适当的浓度，并涂布在PDA培养基培养皿中，25℃培养15天，挑取菌落，进行单核菌株鉴定，保藏备用。

②杂交：进行两两对峙杂交，显微镜筛选具有锁装联合的双核菌株，共得到245个双核菌株。

③生长速度筛选：在含有PDA培养基的培养皿中，接入活化的菌株，25℃培育，测定生长速度并观察长势，筛选生长快、长势旺盛的杂交菌株。

④抗木霉筛选：PDA培养基上与分离到的致病性绿色木霉对峙培养，方法为含有PDA培养基9cm培养皿中，距离中心2cm，先接入活化的杂交菌株25℃培养3天，再对称接入木霉菌饼，25℃培养5天，测定抑制带宽度、杂交菌株向木霉生长半径。

抑制率＝（对照菌株半径 –菌株向木霉生长半径）/对照菌株半径 ×100%。

⑤酶活测定

木质素酶活测定方法：制备供试菌株5mm直径菌饼，接种到含有18ml木质素酶测定培养基平板上，在20℃温度下培养5天，测定、记录变色圈的大小、颜色变化。木质素酶测定培养基（1L）：木质粉末20g，蔗糖1g，愈创木酚2g，琼脂12g。

纤维素酶活性测定方法：制备供试平菇菌株5mm直径菌饼，接种到含有13ml纤维素酶测定培养基平板上，在20℃温度下培养5天，测定、记录变色圈的大小、颜色变化。纤维素酶测定培养基（1L）：刚果红0.2g，微晶纤维素2.48g，琼脂12g。

出菇试验

筛选生长快、抗性强、酶活高的菌株，分别在河北灵寿和平泉分别进行栽培试验。

采用常规香菇栽培配方（杂木屑84%，麸皮15%，石膏1%），并使混合物的水含量为58％。采用15cm×58cm塑料袋装栽培料，充分蒸汽灭菌，冷却至25℃接种。河北灵寿接种时间为2017年8月20日，暖棚立棒出菇；河北平泉2018年3月接种，层架冷棚出菇。23-25℃发菌培养，完成转色后，早晚通风控制温差，菌棒现原基后，开袋出菇。在繁殖的子实体中，筛选出菇早、菇型好、菇质硬、抗性强的菌株。

结果：通过系统选育，选育出出菇早、适温广、抗杂能力强、肉厚、不易开伞的香菇新菌株——JXB5（冀香B5）。该菌株出菇温度8-28℃，80天出菇，在灵寿原基数3-6个，在平泉原基数5-9个，出菇温度8-28℃，头潮菇子实体直径66.4mm，厚度31.2mm，柄长32.6mm，硬度1.54 kg/cm²，不易开伞，属于肉厚型硬质子实体，出菇潮次分明；木质素和纤维素酶活直径分别为25.8mm和18.6mm，高于主栽品种。冀香B5除了抗杂能力强、木质素和纤维素酶活高等特点外，还具有明显的早熟、少原基、肉厚、不易开伞等优良特性（见图1）。

选育出的香菇新菌株JXB5（冀香B5）（分类命名：香菇Lentinula edodes）于2020年4月10日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行菌种保藏，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.19376。

表1 香菇菌株特性比较

。

表2 香菇菌株酶活特性比较（酶活直径mm）

。

表3香菇JXB5（冀香B5）头潮菇子实体形态学指标（灵寿）

。

实施例2 香菇菌株真实性鉴定

试验委托上海生工进行。

（1）供试菌株

供试16个香菇菌株，其中，168、808、灵仙1号（LX1）、庆科212、868、L18为主栽品种，RX11为自然选育的菌株，YX5、YX6为野生香菇菌株，冀香3号（JX3）为L18与808的杂交子代，冀香15（JX15）为868与808的杂交子代，冀香B5（JXB5）、JXB15为冀香3号（JX3）和冀香15（JX15）的杂交子代，E14、E36为0912和JXB5的杂交子代。

表4 16个供试香菇菌株信息

。

（2）DNA 提取和测序

将菌丝接入含有20mL PDA的直径9cm 培养皿中，使用玻璃纸隔开培养基和菌丝，生长至满板，用于DNA 提取和测序。取适量菌丝组织液氮研磨采用CTAB 法提取DNA。DNA 纯度、浓度和完整性分别使用凯奥K5500 微量分光光度计、Qubit荧光光度计和Agilent 2100Bioanalyzer 进行检测。将质量好的DNA 送至上海生工基因科技（上海）有限公司进行重测序。DNA 样本通过片段化、纯化、末端修复、3′端腺苷酸化、连接头、片段大小选择、通过PCR富集片段等步骤最终完成文库构建。

（3）测序及参考基因组序列比对

试验委托上海生工进行。使用Illumina平台进行测序，原始图像数据文件经CASAVA 碱基识别形成初数据（Raw reads）。后续通过计算机对测序数据进行质控分析、碱基质量分布分析、测序数据过滤，最终获得Clean reads。使用BWA 软件（Liu & Durbin2009）将Clean reads 与参考基因组进行对比，其结果经SAMTOOLS 软件（Liu et al.2009）转换格式，而后利用Picard 软件去重，并对对比率、基因组覆盖度分布、插入片段长度（insert-size）分布、变异进行统计。利用R 语言对Indel 和SNP 位点进行密度统计（单位：每10kb 的位点数量），使用Circos 软件进行可视化展示。使用自行设计的R 语言和shell 脚本对SNP 数据进行整合和筛选。

（4）数据分析

SNP 标记多态性和群体多态性分析：用于群体分析的单个SNP 位点多态性使用多态信息含量指数（polymorphism information content，PIC）来计算。

群体结构分析：使用Structure 2.3.4 对香菇资源进行群体结构分析，计算遗传相似性权重值（Q）。详细分析步骤如下：通过对亚群数目K 进行一定取值范围的模拟计算，确定最有可能的亚群数目K 值，详细参数如下：亚群数目K取值范围为2–10，模拟参数迭代（length of burninperiod）为10 000 次，蒙特卡罗迭代（number ofMCMC Reps afterburnin）为10 000 次，每个K 值重复运行5 次。将模拟结果提交到在线工具。依据遗传相似性权重值，利用NTSYS软件进行聚类分析。

结果：

（1）基因组重测序数据质量及与参考基因组比对

本研究利用illumina 平台对16份香菇种质资源进行重测序。初数据序列总数范围为20991778–28539966。初数据碱基数范围为3066262850–4177232954，Clean Bases 在2765417891–3779502043之间。Clean Q30 Bases Rate 范围在88.42%–90.92%之间，说明样本建库测序的质量达到重测序标准。

表5 16个香菇菌株重测序数据质量

。

（2）GC含量及与参考基因组的InDEL和SNP变异

表6为16个菌株的检测GC含量和相对于参照基因组的Indel和SNP变异。16个菌株GC含量不同，菌株B5.GC含量为41.02%，其它菌株GC含量范围为44.46-46.58%。

以华中农业大学研究的香菇135为参考基因组（Refer species:BDGU01000001.1）进行比较。16个香菇菌株Indel总数量范围13926–23159 之间，SNP位点总体数量范围为95725-158659，并且存在显著区别。JXB5（冀香B5）SNP总数101000个，Indel总数14853个。

表6 16个香菇菌株检测GC含量及相对于参照基因组的InDEL和SNP变异

。

（3）香菇菌株的聚类分析

通过基于SNP数据的16个香菇菌株遗传距离比较及亲缘关系聚类分析，如图2所示，证明了16个菌株为彼此存在差异的独立菌株，香菇主栽品种间亲缘关系很近；证明了JXB5杂交菌株为区别于亲本的新菌株。

（4）早熟硬质少原基肉厚型香菇菌株JXB5特异性SNP/InDEL位点

早熟香菇原基多、容易爆出，是人们对香菇的一般认识。鉴于冀香B5早熟、硬质、少原基、肉厚、不易开伞等特殊特点，通过过滤菌株未覆盖位点、菌株间多态性低位点及重叠缺失位点，筛选到JXB5菌株的特异性SNP 位点62 个。现公布24个特异性SNP/InDEL位点，见表7。

表7香菇菌株JXB5特异性SNP/InDEL位点

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实施例3 JXB5菌株在杂交育种中的应用

参照实例1，以JXB5为亲本分别与0912、扣香、灵仙1号杂交。结果表明：杂交子代生长速度＞4.0mm/d菌株占72.8%-83.3%，出菇时间≤85d菌株占62.5%-66.7%，原基数≥25个菌株占22.8%-31.3%，原基数13-24个菌株占51.0%-54.4%，原基数≤12个菌株占16.2%-24.0%，圆整肉厚不易开伞菌株占33.3%-42.7%。

表8香菇JXB5菌株在杂交育种中的应用效果（株）

。

综上，JXB5（冀香B5）作为优良种质，可以较大概率获得早熟、原基数数量适中、圆整肉厚不易开伞的杂交子代子实体。

Claims

1.一种香菇（Lentinula edodes）菌株JXB5，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.19376。

2.一种如权利要求1所述的香菇菌株JXB5产生的原生质体。

3.一种如权利要求1所述的香菇菌株JXB5产生的孢子。

4.一种如权利要求1所述的香菇菌株JXB5产生的菌丝体。

5.一种如权利要求1所述的香菇菌株JXB5产生的子实体。

6.一种包含如权利要求1所述的香菇菌株JXB5的菌棒。

7.一种如权利要求1所述的香菇菌株JXB5在香菇育种中的应用。

8.一种如权利要求1所述的香菇菌株JXB5在制备香菇子实体、香菇菌丝体和/或香菇孢子中的应用。